胡家敏，侯雙雙，古書鴻，谷曉平，張 波

(1．貴州省山地環(huán)境氣候研究所，貴州 貴陽 550002；2．貴州省山地氣候與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550002；3.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

茶葉是世界三大飲品之一，是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，其中春茶產(chǎn)值占茶葉生產(chǎn)總值的1/2以上，而春季倒春寒產(chǎn)生的低溫災(zāi)害嚴(yán)重限制了茶葉產(chǎn)業(yè)的健康高效發(fā)展。農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害保險(xiǎn)是春季茶葉生產(chǎn)過程中遭遇低溫災(zāi)害時(shí)有效的防災(zāi)減災(zāi)途徑?？紤]到農(nóng)業(yè)保險(xiǎn)技術(shù)障礙和道德層面帶來的基差風(fēng)險(xiǎn)，自2007年起，農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害保險(xiǎn)的設(shè)計(jì)以氣象指數(shù)這一客觀指數(shù)為主要指標(biāo)。準(zhǔn)確衡量低溫災(zāi)害和低溫災(zāi)損間的關(guān)系是農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害保險(xiǎn)是否合理的關(guān)鍵[1-4]，氣象指數(shù)偏高或偏低則會(huì)導(dǎo)致保險(xiǎn)雙方利益受到損傷，不利于農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害保險(xiǎn)的健康發(fā)展。因此，探索低溫災(zāi)害對(duì)貴州主要茶葉種植品種——福鼎大白茶生長發(fā)育的影響，并通過植物細(xì)胞傷害率計(jì)算茶葉的半致死溫度以量化福鼎大白茶低溫凍害指標(biāo)對(duì)茶葉凍害的防災(zāi)減災(zāi)氣象服務(wù)有重要的意義。

低溫脅迫對(duì)茶葉的生理生化傷害本質(zhì)為植物膜脂過氧化及膜透性的破壞[5-7]，茶葉對(duì)低溫的生理生化響應(yīng)主要體現(xiàn)在這兩方面。丙二醛(MDA)是植物逆境環(huán)境下膜脂過氧化的產(chǎn)物，是植物膜氧化損傷指標(biāo)[8]，眾多逆境脅迫的植物生理響應(yīng)均以此為重要指標(biāo)。膜透性破壞用相對(duì)電導(dǎo)率(R)來表示，相對(duì)電導(dǎo)率直接表征物細(xì)胞傷害程度[9]。當(dāng)?shù)蜏剡_(dá)到一定程度時(shí)，植物達(dá)到半致死狀態(tài)，即傷害率達(dá)到50%，若溫度低于該溫度，植物所受的低溫?fù)p傷則不可恢復(fù)甚至死亡，該界限溫度稱為低溫半致死溫度[10-12]，低溫半致死溫度通常用于衡量植物對(duì)逆境環(huán)境的忍受程度?；诩?xì)胞傷害率的低溫半致死溫度研究廣泛應(yīng)用于不同環(huán)境脅迫情況下和不同種類的植物耐寒性評(píng)價(jià)[13-20]。對(duì)茶葉耐低溫性研究最早源自于20世紀(jì)80年代末針對(duì)福建茶葉耐寒性的研究[21]，該研究認(rèn)為利用低溫半致死溫度、傷害率對(duì)茶葉耐寒性的種質(zhì)進(jìn)行篩選較為可靠。自2007年以來，近10年期間，茶葉低溫半致死溫度的研究主要集中在根據(jù)茶葉低溫半致死溫度展開的茶葉抗寒性評(píng)價(jià)方面，涉及江浙、重慶、福建和山東等產(chǎn)茶區(qū)域[22-30]，其中浙江氣象局基于低溫半致死溫度制定了茶葉凍害等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[31]，對(duì)茶葉春季凍害的農(nóng)業(yè)氣象服務(wù)具有重要參考價(jià)值。這一系列的研究成果均說明以低溫半致死溫度作為茶葉低溫災(zāi)害指標(biāo)是更精準(zhǔn)的農(nóng)業(yè)氣象服務(wù)的必要途徑。

貴州是中國著名的茶葉產(chǎn)區(qū)之一，氣候變化導(dǎo)致的愈發(fā)嚴(yán)重和頻繁的倒春寒給貴州春茶生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。然而以低溫半致死溫度為主要指標(biāo)對(duì)貴州春茶低溫災(zāi)害的研究未見報(bào)道。為此，筆者根據(jù)貴州低溫凍害發(fā)生特征，通過人工氣候室模擬貴州福鼎大白茶開采期的低溫凍害過程，并測定不同處理的相對(duì)電導(dǎo)率和傷害率(M)以及膜氧化損傷指標(biāo)丙二醛(MDA)，利用傷害率進(jìn)行低溫Logistic函數(shù)的擬合，通過分析研究，獲得貴州福鼎大白茶的春茶生產(chǎn)過程中低溫凍害的低溫半致死溫度，以期為貴州茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展及其氣象服務(wù)、茶葉氣象保險(xiǎn)等業(yè)務(wù)的開展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

福鼎大白茶：盆栽規(guī)格為50 cm(直徑)×50 cm(高)，盆栽茶樹選用無病蟲害的10年生健康茶樹，取自貴州省遵義市鳳岡茶園，土壤、水肥管理均同于茶樹正常田間管理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

茶樹開采前低溫凍害控制試驗(yàn)于2017年3月27日至4月24日，在貴州省黔東南州氣象局的人工氣候室中進(jìn)行，茶樹移栽恢復(fù)正常生長后進(jìn)行分組設(shè)置低溫凍害試驗(yàn)。根據(jù)貴州倒春寒過程特征，設(shè)置3組動(dòng)態(tài)低溫處理，即:0℃，最高5℃，表示為處理0/5；-1℃，最高4℃，表示為處理-1/4；-2℃，最高3℃，表示為處理-2/3。每組按氣溫日變化特征設(shè)置6：00為最低溫，14：00為最高溫，人工氣候室根據(jù)氣溫日變化周期性特征模擬低溫天氣的氣溫日變化動(dòng)態(tài)。將處于萌發(fā)期的茶樹放入不同低溫下的氣候室，低溫處理后，觀察茶樹葉片形態(tài)，每組試驗(yàn)處理的天數(shù)持續(xù)至新芽出現(xiàn)超過2/3的焦黑色時(shí)停止處理。每組預(yù)設(shè)9棵茶樹，另設(shè)對(duì)照(CK)：室外，常溫。每組處理完畢后采集成熟葉片用冰袋保存立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行茶葉生理生化指標(biāo)的測定。

1.3 生理生化指標(biāo)的測定

1.3.1 丙二醛(MDA) 凍害處理后，稱取試驗(yàn)材料1 g，剪碎，加入5%TCA(三氯乙酸)2 mL，研磨至勻漿，再加8 mL TCA進(jìn)一步研磨，勻漿在3 000 r/min離心10 min，上清液為樣品提取液；吸取離心的上清液2 mL，加入2 mL 0.6%TBA(硫代巴比妥酸)溶液，搖勻。將試管放入沸水浴中煮沸10 min(自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計(jì)時(shí))，取出試管并冷卻，3 000 r/min離心15 min。取上清液并量其體積，利用式(1)計(jì)算MDA含量。

(1)

1.3.2 膜透性測定(電導(dǎo)儀法) 凍害處理后，選取茶樹葉片，剪下后用濕布包住。試驗(yàn)時(shí)用自來水將供試葉片沖洗，除去表面沾污物，再用蒸餾水沖洗1～2次，用干凈紗布輕輕吸干葉片表面水分，然后剪成約1 cm2的小葉片，將剪下的小葉片混合均勻，快速稱取鮮樣3份，每份1～2 g，分別放入3個(gè)燒杯中，加入蒸餾水淹沒葉片。將裝有樣品的燒杯分別放入真空干燥器，用抽氣機(jī)抽氣7～8 min，以抽出細(xì)胞間的空氣，重新緩緩放入空氣，空氣中的水即被壓入組織而使葉下沉。將抽過氣的燒杯取出，放在實(shí)驗(yàn)桌上靜置20 min，期間輕輕搖動(dòng)，在20～25℃恒溫下，用電導(dǎo)儀測定溶液電導(dǎo)率(R1)。之后將燒杯放入100℃沸水中15 min，以殺死植物組織，取出放入室溫冷卻1 h，在20～25℃恒溫下測其煮沸電導(dǎo)率(R2)。3份樣品的R1、R2取平均值，并通過式(2)和式(3)計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率(R)和細(xì)胞傷害率(M)。

(2)

(3)

1.4 低溫半致死溫度計(jì)算

試驗(yàn)茶樹低溫凍害低溫半致死溫度的確定可應(yīng)用Logistic 函數(shù)計(jì)算得到。式(4)為低溫與細(xì)胞傷害率的Logistic函數(shù)，y為細(xì)胞傷害率(%)，x為低溫(℃)，a、b為待定參數(shù)，K為飽和參數(shù)，對(duì)于傷害率來講飽和值為100%。當(dāng)傷害率為50%時(shí)即為低溫半致死溫度(lna/b)。將式(4)通過等式兩邊取自然對(duì)數(shù)進(jìn)行線性轉(zhuǎn)換(式5)，通過線性擬合確定待定參數(shù)值。

(4)

(5)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫脅迫下福鼎大白茶茶葉的形態(tài)變化

通過不同凍害程度處理，反映出不同凍害程度的茶葉形態(tài)響應(yīng)不同。當(dāng)進(jìn)行最低溫度為0℃處理時(shí)，茶樹的葉片形態(tài)沒有明顯變化；當(dāng)進(jìn)行最低溫度為-1℃的處理時(shí)，僅1 d茶葉的葉片形態(tài)便出現(xiàn)明顯的焦黑，隨著處理時(shí)間的延長焦黑現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，經(jīng)過2 d的處理50%左右的葉片出現(xiàn)明顯凍害特征，持續(xù)3 d大部分葉片出現(xiàn)焦黑現(xiàn)象；當(dāng)進(jìn)行最低溫度為-2℃的處理時(shí)，僅1 d大部分茶葉葉片形態(tài)便出現(xiàn)明顯的焦黑，處理2 d后80%左右的茶葉出現(xiàn)焦黑現(xiàn)象，故停止了凍害脅迫處理。

2.2 低溫脅迫下福鼎大白茶生理特性的變化

2.2.1 丙二醛(MDA) MDA是植物受低溫脅迫時(shí)膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量多少是植物受到傷害的重要標(biāo)志[5-7]，是植物逆境脅迫下常用指標(biāo)。從表1看出，MDA含量因低溫程度和脅迫時(shí)間而出現(xiàn)不同的響應(yīng)特征。相同低溫處理下，MDA含量隨著脅迫時(shí)間的延長而升高(-2/3處理呈先升高后下降趨勢)；相同脅迫時(shí)間下，MDA含量與低溫變化大致呈先升后降的變化趨勢。0/5處理持續(xù)3 d時(shí)，MDA含量最高，為2.38 μmol/L，是對(duì)照的40倍，0/5處理持續(xù)2 d時(shí)MDA含量較高，是對(duì)照處理的33倍。當(dāng)?shù)蜏孛{迫時(shí)間為1 d時(shí)，除-2/3處理表現(xiàn)出較明顯的生理反應(yīng)，0/5、-1/4處理的MDA含量變化與對(duì)照(CK)差異不大，表明茶樹生長在一定溫度范圍內(nèi)對(duì)短時(shí)間的低溫有一定的免疫能力；當(dāng)?shù)蜏孛{迫時(shí)間達(dá)到2 d和3 d時(shí)，各溫度處理MDA含量均表現(xiàn)出明顯的變化，表明低溫2 d對(duì)茶葉生長的損傷明顯。

表1不同低溫及時(shí)間處理福鼎大白茶的丙二醛含量
Table 1 MDA content of Fortin White Tea under different low temperature treatments and time μmol/L

處理Treatment持續(xù)時(shí)間/dDuration time123CK0.060.060.060/50.261.972.38-1/40.00.520.74-2/31.130.85試驗(yàn)停止

2.2.2 相對(duì)電導(dǎo)率 當(dāng)植物受到逆境危害時(shí)，細(xì)胞膜受到損傷，導(dǎo)致膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，使得細(xì)胞提取液電導(dǎo)率增大，通常用相對(duì)電導(dǎo)率反映膜透性情況，相對(duì)電導(dǎo)率越大，則植物損傷越嚴(yán)重[14]。從表2看出，隨著低溫脅迫程度的增加(處理溫度的降低及持續(xù)時(shí)間的延長)，相對(duì)電導(dǎo)率均表現(xiàn)出升高趨勢。從不同的低溫處理看，最低溫度越低，植物受到的傷害越重，相對(duì)電導(dǎo)率越大；從低溫脅迫持續(xù)時(shí)間看，脅迫時(shí)間越長相對(duì)電導(dǎo)率越大。由于-2/3處理持續(xù)2 d時(shí)，茶葉80%以上的葉片出現(xiàn)焦黑現(xiàn)象，停止了脅迫時(shí)間的持續(xù)，因此，在-2/3處理持續(xù)2 d時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率最大，為81.75%，明顯高于對(duì)照(73.5%)。與對(duì)照相比，當(dāng)?shù)蜏靥幚頌?/5時(shí)，持續(xù)1 d、2 d和3 d的相對(duì)電導(dǎo)率分別較對(duì)照高0.5百分點(diǎn)、0.5百分點(diǎn)和1.5百分點(diǎn)；當(dāng)?shù)蜏靥幚頌?1/4時(shí)，持續(xù)1 d、2 d和3 d的相對(duì)電導(dǎo)率分別較對(duì)照高1.73百分點(diǎn)、2.39百分點(diǎn)和3.35百分點(diǎn)；當(dāng)?shù)蜏靥幚頌?2/3時(shí)，持續(xù)1 d和2 d的相對(duì)電導(dǎo)率分別較對(duì)照高2.96百分點(diǎn)和8.25百分點(diǎn)。由此可知，低溫脅迫程度對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響不均勻，0℃的低溫對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率影響不明顯，-1℃和-2℃的低溫對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響迅速體現(xiàn)，從茶葉形態(tài)對(duì)低溫脅迫響應(yīng)特征也可印證這一點(diǎn)，0℃時(shí)茶葉形態(tài)特征無明顯響應(yīng)，而當(dāng)溫度低至-1℃和-2℃時(shí)，茶葉明顯出現(xiàn)焦黑凍傷現(xiàn)象。表明，茶葉能夠耐受一定范圍的低溫，其耐受低溫程度與持續(xù)時(shí)間有關(guān)。

表2不同低溫及時(shí)間處理福鼎大白茶的相對(duì)電導(dǎo)率變化
Table 2 Relative conductivity of Fortin White Tea under different low temperature treatments and time %

處理Treatment持續(xù)時(shí)間/dDuration time123CK73.5073.5073.500/574.0074.0075.00-1/475.2375.8976.85-2/376.4681.75試驗(yàn)停止

2.3 福鼎大白茶低溫半致死溫度

從表3可知，經(jīng)線性回歸分析，低溫脅迫時(shí)間為1 d和2 d的參數(shù)a，b分別為35.54，1.17和30.1，1.09。通過參數(shù)計(jì)算可知，低溫凍害脅迫情況下，脅迫時(shí)間持續(xù)1 d和2 d的低溫半致死溫度差異不大，分別為-3.1℃和-3.0℃。

表3 低溫脅迫下的茶葉 Logistic函數(shù)參數(shù)值及低溫半致死溫度Table 3 Parameters of the Logistic function and semi-lethal temperature of tea in response to low temperature stress

注：**擬合度達(dá)P<0.05的顯著性水平;*擬合度達(dá)P<0.1的顯著性水平。
Note:** and * indicate 5% and 1% significant levels respectively.

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

逆境脅迫導(dǎo)致植物生理層面的表現(xiàn)為過氧化產(chǎn)物增加和膜透性增大，從而對(duì)植物的新陳代謝產(chǎn)生有害影響，低溫脅迫對(duì)茶樹生長的影響同樣體現(xiàn)為有害物質(zhì)和細(xì)胞功能損傷兩個(gè)方面，研究選擇丙二醛(MDA)和相對(duì)電導(dǎo)率(R)2個(gè)典型指標(biāo)分析在低溫凍害脅迫環(huán)境下貴州茶葉主栽品種福鼎大白茶的生理特性變化，并通過Logistic函數(shù)擬合確定低溫半致死溫度，從而確定貴州福鼎大白茶低溫凍害指標(biāo)。研究結(jié)果表明：MDA含量因低溫程度和脅迫時(shí)間而出現(xiàn)不同的響應(yīng)特征，MDA含量隨著脅迫時(shí)間的延長而呈大致升高趨勢，隨低溫下降呈先增高再下降的趨勢，綜合表現(xiàn)為0℃持續(xù)3 d時(shí)MDA含量達(dá)到峰值。對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率而言，不論是處理溫度的降低還是持續(xù)時(shí)間的延長，相對(duì)電導(dǎo)率均表現(xiàn)出升高趨勢，上升趨勢不均勻，0℃對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響極不明顯，-1℃和-2℃對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響逐漸明顯，綜合表現(xiàn)為-2℃持續(xù)2 d時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率最大。通過對(duì)不同低溫處理程度與細(xì)胞傷害率二者關(guān)系的Logistic函數(shù)擬合，得出在脅迫時(shí)間持續(xù)1 d和2 d的低溫半致死溫分別為-3.1℃和-3.0℃，不同脅迫時(shí)間下低溫半致死溫度不同，脅迫時(shí)間越長低溫半致死溫度越高。因此，茶葉低溫凍害指標(biāo)應(yīng)與實(shí)際的低溫天氣過程密切相關(guān)，低溫持續(xù)天數(shù)越長則低溫半致死溫度越高，相應(yīng)的低溫凍害界限溫度應(yīng)越高。

3.2 討論

本研究發(fā)現(xiàn)丙二醛(MDA)含量隨處理溫度的下降呈現(xiàn)單峰型現(xiàn)象，即先升高后下降。低溫脅迫下，植物膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累對(duì)植物細(xì)胞會(huì)造成傷害，隨著溫度的下降，植物本身清除能力下降，因此MDA含量上升，達(dá)到一定損傷程度后MDA含量達(dá)到極大值，試驗(yàn)對(duì)福鼎大白茶的研究表明，MDA極值點(diǎn)為0℃。試驗(yàn)中的MDA含量變化趨勢與其他植物低溫脅迫下MDA含量變化的研究結(jié)果相吻合[4,32-33]。王瑞等[32]研究低溫脅迫對(duì)玉米幼苗MDA含量的影響表明，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，玉米品種四密21和東農(nóng)250表現(xiàn)出先升高后減少勢，屯玉88則表現(xiàn)為持續(xù)升高趨勢，說明，不同品種的MDA對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)特征存在差異。尹航等[11]的相關(guān)研究表明，低溫脅迫下煙草的MDA含量特征也同樣出現(xiàn)單峰型趨勢。該試驗(yàn)福鼎大白茶MDA含量隨著脅迫時(shí)間的延長出現(xiàn)升高趨勢。李仁忠等[31]對(duì)浙江春茶不同品種霜凍指標(biāo)確定的研究表明，隨著溫度的下降，春茶中MDA均呈現(xiàn)升高趨勢。因其研究茶葉低溫脅迫試驗(yàn)處理均為0～10℃的低溫且低溫脅迫時(shí)間僅1 d，因此，茶葉中MDA含量未出現(xiàn)單峰型特征，極有可能是由于試驗(yàn)設(shè)置未達(dá)到MDA峰值出現(xiàn)的低溫脅迫程度所致。

電導(dǎo)率是衡量茶葉植株細(xì)胞組織的幼嫩程度和細(xì)胞質(zhì)膜是否受到傷害的指標(biāo)。通常情況下,細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)受細(xì)胞膜的阻隔保留在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜遭受某種傷害時(shí)，電解質(zhì)則大量涌向細(xì)胞外，導(dǎo)致電解質(zhì)激增。試驗(yàn)結(jié)果與其他相關(guān)研究結(jié)論相吻合[4,31-34]，福鼎大白茶相對(duì)電導(dǎo)率隨低溫脅迫程度的加深(不論是溫度降低還是脅迫時(shí)間延長)呈上升趨勢，試驗(yàn)研究結(jié)果與眾多茶葉的相對(duì)電導(dǎo)率在低溫脅迫下的變化結(jié)果一致。李仁忠等[31]的研究表明，低溫脅迫下，浙江春茶的相對(duì)電導(dǎo)率呈升高趨勢，并在-1℃變化尤為劇烈。試驗(yàn)表明，福鼎大白茶的相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度下降出現(xiàn)不均勻上升，該結(jié)果與李葉云等[34]研究結(jié)果一致。由此表明，春茶生長過程中，在倒春寒低溫逆境中，若溫度未達(dá)到一定的低溫，相對(duì)電導(dǎo)率的響應(yīng)不明顯。

該研究表明，不同脅迫時(shí)間下低溫半致死溫度不同，脅迫時(shí)間越長低溫半致死溫度越高。試驗(yàn)中脅迫時(shí)間為1 d和2 d的低溫半致死溫度差異較小，與劉映寧等[2-4]的研究結(jié)果一致，顯然相同品種在不同低溫災(zāi)害發(fā)生時(shí)(不同持續(xù)時(shí)間和低溫強(qiáng)度)，其低溫半致死溫度不同。因此，對(duì)貴州福鼎大白茶低溫凍害的預(yù)警和預(yù)防工作中應(yīng)考慮不同地域茶樹適應(yīng)狀態(tài)和當(dāng)?shù)氐勾汉l(fā)生情況來確定具體的茶葉低溫凍害界限。試驗(yàn)材料是遵義鳳岡茶園茶樹，并且僅探索了10年樹齡的福鼎大白茶對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)特征，樹齡的影響以及持續(xù)時(shí)間的影響均需進(jìn)一步探索，才能使貴州茶葉氣象服務(wù)工作更加完善。