基于雌激素代謝調(diào)控的白藜蘆醇對(duì)MNNG誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌變的抑制作用

尹 弟，陳春霞，閔夢(mèng)君，趙 峰，杜 蕾，印曉星，周雪妍

(徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是最常見(jiàn)的婦科腫瘤之一，近年來(lái)，EC的發(fā)病率逐年增加，而且發(fā)病年齡愈發(fā)年輕化[1]。雖然手術(shù)結(jié)合放療和化療可以達(dá)到良好的治療效果，但是術(shù)后生育功能的喪失，以及化療藥物毒性大、副作用強(qiáng)、易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)EC患者的身心健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2]。目前，EC的診斷尚缺乏金標(biāo)準(zhǔn)。因此，臨床上迫切需要早期準(zhǔn)確的EC診斷方法。

EC的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)雌激素水平密切相關(guān)[3]。雌激素活性物質(zhì)包括雌酮(estrone，E1)、雌二醇(estradiol，E2)、雌三醇(estriol，E3)、2-羥基雌酮/雌二醇(2-hydroxyestrone/estradiol，2-OHE1/E2)、4-羥基雌酮/雌二醇(4-hydroxyestrone/estradiol，4-OHE1/E2)、16α-羥基雌酮(16α-hydroxyestrone，16α-OHE1)、2-甲氧基雌酮/雌二醇(2-methoxyestrone/estradiol，2-MeOE1/E2)和4-甲氧基雌酮/雌二醇(4-methoxy-estrone/estradiol，4-MeOE1/E2)。超生理濃度的雌激素可與雌激素受體結(jié)合，介導(dǎo)多種生長(zhǎng)因子的過(guò)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[4]。而雌激素的多種代謝產(chǎn)物則可與DNA形成加合物，誘導(dǎo)基因突變，產(chǎn)生直接的基因毒性。尤其是2-OHE2和4-OHE2具有極強(qiáng)的致癌活性，它們?cè)隗w內(nèi)通過(guò)非受體介導(dǎo)，與DNA形成加和物，導(dǎo)致DNA編碼錯(cuò)誤，誘導(dǎo)DNA損傷，促進(jìn)癌癥形成[5]。因此，雌激素及其毒性代謝產(chǎn)物異常蓄積，是EC發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種植物多酚，具有抗氧化、抗腫瘤效應(yīng)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Res可以抑制成年乳腺癌♀鼠的腫瘤發(fā)生，但對(duì)于青春期前的未成年♀鼠，Res則延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的動(dòng)情期時(shí)間，并增加了乳腺癌的發(fā)病率和平均瘤重[7]。因此，Res對(duì)腫瘤的調(diào)控作用與實(shí)驗(yàn)對(duì)象體內(nèi)雌激素水平密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以ICR ♀小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)宮腔注射N(xiāo)-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl- N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)建立小鼠EC模型，同時(shí)給予Res進(jìn)行治療，考察Res對(duì)雌激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控及EC的治療作用，為探尋EC臨床診斷潛在生物標(biāo)志物與EC的臨床藥物治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)ICR小鼠，♀，體質(zhì)量(16～20) g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)新藥與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠給予自由飲水。

1.2 試劑MNNG(貨號(hào)R-081N)、Res(貨號(hào)M02442)，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105)，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；TRNAiso Plus(貨號(hào)9108)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(貨號(hào)RR820A)、PrimeScript RT reagent Kit(貨號(hào)RR037A)，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；雌二醇(貨號(hào)E8875)、雌酮(貨號(hào)1238002)，購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；2-甲氧基雌二醇(貨號(hào)E2490-000)、4-羥基雌二醇(貨號(hào)E2500-000)、2-羥基雌二醇(貨號(hào)E2470-000)、16α-羥基雌酮(貨號(hào)E1250-000)，購(gòu)自加拿大Steraloids公司；4-甲氧基雌二醇(貨號(hào)M262630)、2-羥基雌酮(貨號(hào)H941945)、4-羥基雌酮(貨號(hào)H941950)、2-甲氧基雌酮(貨號(hào)M262520)、4-甲氧基雌酮(貨號(hào)M226135)，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；d5-雌二醇(貨號(hào)D-5552)，購(gòu)自美國(guó)C/D/N同位素公司。

1.3 儀器KD-TS3A生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、KD-BM生物組織石蠟包埋機(jī)(金華科迪儀器設(shè)備有限公司)；RM2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1210病理組織漂烘機(jī)(德國(guó)Leica公司)；Tecnai G2透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)；NanoDrop 1000核酸濃度測(cè)定儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；2720 PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Light Cycle 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6420A三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、MassHunter Acquisition數(shù)據(jù)采集軟件、MassHunter Qualitative定性分析軟件和MassHunter Quantitative定量分析軟件(美國(guó)Agilent公司)。

1.4 EC小鼠模型的建立♀ ICR小鼠(4～5周齡)，適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：正常對(duì)照組(Control組)、Res組、模型組(MNNG組)、模型+Res給藥組(MNNG+Res組)。其中，MNNG組和MNNG+Res組宮腔給予MNNG(溶于50%聚乙二醇中，單次給藥60 mg·kg-1)，1周1次，連續(xù)3周。對(duì)照組及Res組宮腔給予50%聚乙二醇進(jìn)行假手術(shù)(給藥體積及次數(shù)同模型組)。第1次造模后，對(duì)照組及MNNG組給予空白純化日糧配方飼料飼養(yǎng)；Res組及MNNG+Res組給予含有Res(800 mg·kg-1)的純化日糧配方飼料飼養(yǎng)。具體的做法為：每天每10只小鼠給予50 g含藥飼料，每天上午8 ∶00定時(shí)更換，且將前1 d剩余的飼料倒掉，含藥飼料密閉儲(chǔ)存于4 ℃，避光保存。連續(xù)喂養(yǎng)36周后，處死小鼠并取血清、子宮組織備測(cè)。

1.5 HE染色取子宮組織，依次行4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片處理后，進(jìn)行脫蠟、染色、脫水、封片，晾干后，通過(guò)顯微鏡觀察子宮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.6 qPCR檢測(cè)使用TRIzol提取子宮組織總RNA，按照PrimeScript RT試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR分析，使用Roche LightCycle 480軟件計(jì)算得出樣本中各目的基因的Ct值，通過(guò)ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，以GADPH的mRNA表達(dá)水平作參比。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，序列見(jiàn)Tab 1。

1.7 雌激素及其代謝產(chǎn)物的含量測(cè)定取小鼠子宮適量，精密稱重，按100 g·L-1的比例加入PBS緩沖液，在冰水浴中充分勻漿，制備成100 g·L-1的組織勻漿液。取勻漿液或小鼠血清300 μL,加入10 μL d5-E2溶液(50 nmol·L-1)作為內(nèi)標(biāo)，渦旋1 min后，按照1 ∶3(V∶V)的體積加入乙酸乙酯，渦旋10 min，于4 ℃、13 000 r·min-1離心5 min，收集上層有機(jī)相，有機(jī)相于40 ℃真空冷凍干燥機(jī)旋轉(zhuǎn)干燥后，精密加入0.1 mol·L-1的Na2CO3/NaHCO3緩沖溶液(pH 9.0)50 μL和1 g·L-1的丹磺酰氯丙酮溶液50 μL，充分渦旋混合1 min，65 ℃烘箱加熱反應(yīng)7 min，放冷后，4 ℃、13 000 r·min-1離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液入進(jìn)樣瓶中。用LC-MS/MS法測(cè)定樣本中雌激素及其代謝產(chǎn)物共11種目標(biāo)分析物的含量，檢測(cè)方法應(yīng)用本課題組前期建立并驗(yàn)證的液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)[8]；定量方法采用加內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法。

Tab 1 qPCR reaction primers and amplification length

2 結(jié)果

2.1 Res對(duì)EC發(fā)生發(fā)展的抑制作用Fig 1A結(jié)果顯示，MNNG組小鼠的體質(zhì)量呈逐漸增加的趨勢(shì)，于第4周和第8周體質(zhì)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；MNNG+Res組小鼠體質(zhì)量均較MNNG組小鼠低，且于16～36周體質(zhì)量明顯低于MNNG組(P<0.01)。同時(shí)子宮指數(shù)結(jié)果顯示，MNNG組小鼠子宮指數(shù)比對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予Res治療后，MNNG+Res組小鼠子宮指數(shù)有所減小，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 1B。qPCR方法檢測(cè)各腫瘤標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平(Fig 1C)，與對(duì)照組相比，模型組中Ccnd1、Erbb2的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，且給予Res治療后，其表達(dá)明顯降低(P<0.01)；CK-19在模型組和正常對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其在MNNG+Res組的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。小鼠子宮組織HE染色結(jié)果顯示(Fig 1D)，對(duì)照組和Res組小鼠子宮內(nèi)膜腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)良好；而MNNG誘導(dǎo)的EC小鼠的HE染色結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、排列緊密，部分間質(zhì)消失，腺腔可見(jiàn)分支形成，局灶可見(jiàn)篩孔；給予Res治療后，小鼠子宮肌層輕度水腫，子宮內(nèi)膜較模型組趨于正常狀態(tài)。

2.2 Res對(duì)雌激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用采用LC-MS/MS定量分析方法檢測(cè)小鼠血清和子宮組織中雌激素及其代謝產(chǎn)物的含量，并將數(shù)據(jù)采用SIMCA 14.0軟件進(jìn)行OPLS-DA統(tǒng)計(jì)分析。采用VIP來(lái)衡量預(yù)測(cè)各個(gè)代謝物對(duì)模型的貢獻(xiàn)，通常VIP>1為潛在生物標(biāo)志物的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)需要進(jìn)一步通過(guò)t檢驗(yàn)方法，保留具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的數(shù)據(jù)。

對(duì)模型分離貢獻(xiàn)作用較大且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物有：血清中，4-MeOE1、E1；子宮中，4-OHE2、2-MeOE1，表明這幾個(gè)代謝物可能是Res抗腫瘤作用的潛在生物標(biāo)志物。

對(duì)上述代謝物分別進(jìn)行含量測(cè)定，Tab 2結(jié)果顯示，在EC小鼠血清及子宮內(nèi)膜組織中，具有細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的2-MeOE2、4-MeOE1含量明顯降低，具有基因毒性作用的4-OHE2含量明顯升高，而給予Res治療后可恢復(fù)其穩(wěn)態(tài)平衡。提示Res可能通過(guò)調(diào)控雌激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮其對(duì)EC的抑制作用。

3 討論

EC是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，在我國(guó)，隨著社會(huì)發(fā)展和經(jīng)濟(jì)條件改善，EC的發(fā)病率逐年升高，目前僅次于宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位。初潮年齡早及晚絕經(jīng)、多囊卵巢綜合征、外源性雌激素作用、子宮內(nèi)膜癌三聯(lián)征(肥胖-高血壓-糖尿病)、乳腺癌、卵巢癌家族史等，均為EC的高危因素，嚴(yán)重危害著女性的生命健康。雖然手術(shù)聯(lián)合放化療的治療方案可取得良好的治療效果，但是，術(shù)后生育功能的喪失以及保守治療所帶來(lái)的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)仍給EC患者的生理、心理健康帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅[2]。

Fig 1 Inhibition of resveratrol on endometrial cancer model

A:Body weight curves were plotted for each treatment group; B: Mice uterus index; C:The mRNA expression of Ccnd1, Erbb2 and CK-19 was detected in uterus tissues; D:HE staining of uterus tissue for the appearance and structure of the tumor ×40.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMNNG group.

Tab 2 Concentration of potential biomarkers in serum and uterine tissue of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMNNG

Fig 2 OPLS-DA score plots of serum(A, C) and uterus tissue(B, D) estrogen metabolites in mice

Fig 3 Variable importance in projection(VIP) values calculated from OPLS-DA models for estrogen metabolic profile data in mouse serum(A, C) and uterus tissue(B, D)

毫無(wú)疑問(wèn)，EC若能盡早被發(fā)現(xiàn)并對(duì)其加以控制，病情將得到改善或逆轉(zhuǎn)；而若在臨床早期不對(duì)其加以控制，病情發(fā)展將難以控制。但事實(shí)上，EC的臨床診斷尚缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，早期EC的診斷還比較困難，需要仔細(xì)詢問(wèn)病史，準(zhǔn)確細(xì)致地進(jìn)行婦科檢查，并采用輔助檢查，才能進(jìn)一步作出診斷。目前，臨床上對(duì)EC的診斷方法主要還是通過(guò)診斷性刮宮及分段診刮[9]，但是，診刮不能判斷是否有肌層的浸潤(rùn)及浸潤(rùn)的深度，是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，故無(wú)法進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)確分期，不能達(dá)到早期、準(zhǔn)確診斷EC的要求。因此，尋找有預(yù)測(cè)價(jià)值的EC生物標(biāo)志物具有極其重要的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LC-MS/MS定量分析方法，測(cè)定EC小鼠血清和子宮組織樣本中雌激素及其代謝產(chǎn)物的含量變化，旨在探明可用于EC臨床診斷的潛在生物標(biāo)志物。

多項(xiàng)研究表明，雌激素代謝紊亂與婦科腫瘤疾病密切相關(guān)。雌激素類(lèi)物質(zhì)可在體內(nèi)多種代謝酶的介導(dǎo)下進(jìn)行動(dòng)態(tài)的生物轉(zhuǎn)化，而雌激素及其毒性代謝產(chǎn)物組成的活性物質(zhì)組則根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同、濃度水平的差異，以不同的分子機(jī)制在EC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。內(nèi)源性雌激素主要包括E1、E2和E3，由于體內(nèi)E3的含量極低，故雌激素的代謝研究主要還是考察E1和E2的代謝情況。雌激素的代謝方式包括氧化代謝與結(jié)合代謝(O-甲基化、葡萄糖醛酸化及磺化等)兩種。氧化代謝主要為羥基化過(guò)程，主要產(chǎn)物為4-OHE2、2-OHE2、4-OHE1、2-OHE1和16α-OHE1。雌激素的代謝紊亂被認(rèn)為與婦科腫瘤相關(guān)是因?yàn)橛凶C據(jù)表明，其可以引起DNA損傷和突變，其中雌激素的羥基化代謝起了主要作用，在雌激素的羥基化代謝產(chǎn)物中，4-OHE2是活性最強(qiáng)的一種[10]。雌激素的另一類(lèi)代謝產(chǎn)物是由羥基化代謝產(chǎn)物被兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)甲基化生成的甲氧基類(lèi)雌激素(2-MeOE2、4-MeOE2、2-MeOE1、4-MeOE1)，這類(lèi)雌激素表現(xiàn)為保護(hù)效應(yīng)，且有研究表明，2-MeOE2可明顯抑制6T-CEM細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-6,11]。

Res具有抗癌、抗突變、抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及雌激素調(diào)節(jié)等多方面的藥理活性。Res可作用于在腫瘤的起始、促進(jìn)、發(fā)展3個(gè)階段：① 通過(guò)抗突變、誘導(dǎo)二相藥代酶的作用，發(fā)揮抗腫瘤起始活性[12]；② 通過(guò)抗炎、抑制環(huán)加氧酶和氫過(guò)氧化物酶的活性，在腫瘤的促進(jìn)階段起抑制作用[13]；③ 誘導(dǎo)人早幼粒白血病細(xì)胞的分化而抑制腫瘤的發(fā)展[14]。Banerjee等[15]利用EC細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Res可對(duì)EC細(xì)胞發(fā)揮很好的生長(zhǎng)抑制作用，并且能最大限度地抑制E2介導(dǎo)的ER陽(yáng)性乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)刺激效應(yīng)。且Res是一種多酚類(lèi)化合物，因其分子結(jié)構(gòu)與合成的雌激素類(lèi)化合物己烯雌酚的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，并顯示一定的雌激素樣活性，被稱為植物雌激素。因此，Res可能通過(guò)調(diào)控雌激素水平，進(jìn)而抑制EC的發(fā)生、發(fā)展。

目前，EC模型可分為大鼠自發(fā)子宮內(nèi)膜腺癌、雌激素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌、MNNG誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌、腫瘤細(xì)胞接種誘導(dǎo)裸鼠子宮內(nèi)膜癌、Pten基因突變誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌模型。在本實(shí)驗(yàn)中，采用MNNG誘導(dǎo)的小鼠EC對(duì)各種激素敏感，且造模方法簡(jiǎn)單，造模成本相對(duì)較低，重復(fù)性強(qiáng)。HE染色結(jié)果顯示，MNNG組小鼠腺體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、排列緊密，部分間質(zhì)消失，腺腔可見(jiàn)分支形成，局灶可見(jiàn)篩孔，表明EC模型是成功的。qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠子宮組織中腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)，對(duì)EC模型進(jìn)行了驗(yàn)證。在MNNG+Res組中，給予Res治療后，小鼠子宮內(nèi)膜的形態(tài)發(fā)生了改變，內(nèi)膜增生得到了改善，且腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)也明顯降低，表明Res對(duì)EC產(chǎn)生了一定的抑制作用。且EC小鼠體內(nèi)具有保護(hù)作用的代謝產(chǎn)物2-MeOE2、2-MeOE1和4-MeOE1的水平明顯下降，同時(shí)其具有毒性作用的代謝產(chǎn)物4-OHE2的含量明顯增加；在給予Res治療后，對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物的水平也發(fā)生了相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，再次表明Res抑制了EC的發(fā)生發(fā)展。此外，在EC小鼠體內(nèi)，2-MeOE2和4-OHE2的水平在子宮組織和外周血液中具有相似的變化趨勢(shì)。提示外周血液中的2-MeOE2和4-OHE2有可能作為EC臨床診斷的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物。