梅詠玉，方 晨，丁少禎，劉曉昌，徐張巍，胡 靜，許建明，梅 俏

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230022)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是由免疫調(diào)節(jié)功能紊亂介導(dǎo)的慢性腸道炎癥性病變，發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，可能與腸道環(huán)境因素、腸上皮屏障和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)之間的異常相互作用有關(guān)[1]。在免疫調(diào)節(jié)紊亂的過(guò)程中，巨噬細(xì)胞分泌大量炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，包括IL-1、IL-6、TNF-α等，進(jìn)一步加劇結(jié)腸的炎性損傷程度。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，通過(guò)模式識(shí)別受體，識(shí)別病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，引發(fā)固有免疫反應(yīng)，快速有效對(duì)抗病原體[2]。IBD患者腸道中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，研究表明，自噬在固有免疫反應(yīng)中起著重要作用，可以有效減輕結(jié)腸炎中過(guò)度炎癥和免疫反應(yīng)[3]。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制，包括形成吞噬泡，延長(zhǎng)并吞噬細(xì)胞溶質(zhì)成分(包括細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集體和病原體)，形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，與溶酶體融合后溶質(zhì)成分降解和再循環(huán)[4]。自噬受損被認(rèn)為參與IBD發(fā)生機(jī)制。自噬缺陷導(dǎo)致腸壁內(nèi)固有免疫反應(yīng)增強(qiáng)和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生明顯增加，提示IBD中固有免疫反應(yīng)與巨噬細(xì)胞自噬密切相關(guān)[5]。

Kv1.3通道通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)，控制巨噬細(xì)胞的活化和增殖過(guò)程。同時(shí)， Ishii等[6]研究表明，Kv1.3與p62密切相關(guān)。p62是一種重要的自噬相關(guān)蛋白，在自噬中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。特異性Kv1.3阻滯劑對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用可能發(fā)揮治療免疫功能紊亂有關(guān)的炎癥性疾病。5-(4-苯氧基丁氧基)補(bǔ)骨脂素[5-(4-phenoxybutoxy)psoralen，PAP-1]是一種新型特異性小分子Kv1.3通道阻滯劑[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討Kv1.3阻滯劑PAP-1對(duì)葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulphate，DSS)結(jié)腸炎的作用及相關(guān)機(jī)制,為IBD治療藥物研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠,♂,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：34000200001278。

1.2 試劑DSS(分子質(zhì)量40 000)、PAP-1(P6124)，均購(gòu)自Sigma公司；髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒、糞便隱血試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；cDNA合成試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒，購(gòu)自德國(guó)Hilden Qiagen公司；IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒，均購(gòu)自武漢新啟迪生物科技有限公司；抗p62、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、IL-1β抗體，均購(gòu)于北京博奧森生物有限公司；抗Beclin-1、LC3-Ⅱ、Kv1.3、F4/80抗體，均購(gòu)于Abcam公司。

1.3 儀器高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；Elx800型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；EPS 300型電泳儀(上海天能科技有限公司)；K960型PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)；PikoReal 96型熒光定量PCR儀(Thermo Scientific公司)。

2 方法

2.1 模型的制備與實(shí)驗(yàn)分組將40只小鼠隨機(jī)分成4組。A組:正常對(duì)照組，正常飲水和腹腔注射等體積溶劑(含3% DMSO的生理鹽水)；B組:正常對(duì)照+PAP-1注射組，正常飲水和腹腔注射PAP-1(3 μg·g-1,每天3次)；C組:DSS模型組，飲用含5% DSS的水和腹腔注射等體積溶劑(含3% DMSO的生理鹽水)；D組:DSS模型+PAP-1注射組，飲用含5% DSS的水和腹腔注射PAP-1(3 μg·g-1,每天3次)。實(shí)驗(yàn)造模連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死所有小鼠，按文獻(xiàn)方法制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及脾臟巨噬細(xì)胞，同時(shí)收集小鼠結(jié)腸組織待測(cè)。

2.2 結(jié)腸炎嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)每日記錄小鼠體質(zhì)量、便血情況和糞便性狀。采用隱血試劑盒測(cè)定糞便潛血。計(jì)算小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取出小鼠結(jié)腸組織，10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋，切片厚約4 μm，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)指數(shù)(histological index，HI)評(píng)分[9]。

2.3 結(jié)腸勻漿MPO活性及細(xì)胞因子水平檢測(cè)用生理鹽水制備10%結(jié)腸組織勻漿。按說(shuō)明書操作,檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織勻漿MPO活性，以及IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α水平。

2.4 免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)腸巨噬細(xì)胞的滲出石蠟切片經(jīng)脫蠟及水化，2%過(guò)氧化氫抗原修復(fù)，3% BSA封閉，F(xiàn)4/80一抗(1 ∶100)4 ℃溫育過(guò)夜，與二抗室溫避光孵育1 h，DAPI浸染細(xì)胞核，封片。共聚焦激光掃描顯微鏡觀察圖像并進(jìn)行分析。

2.5 腹腔和脾臟巨噬細(xì)胞的分離提取參照文獻(xiàn)方法[10]，收集小鼠腹膜巨噬細(xì)胞。用8 mL冷PBS溶液沖洗小鼠腹腔5 min,收集腹腔灌洗液。離心獲取細(xì)胞，接種在含有RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青-鏈霉素)的12孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2 h。用PBS充分洗滌，除去非貼壁細(xì)胞，收集黏附細(xì)胞即為腹腔巨噬細(xì)胞。

將小鼠脾臟組織切成小塊，輕研磨通過(guò)200目的鋼絲網(wǎng)，獲得脾細(xì)胞懸浮液。按上述方法，從脾細(xì)胞懸浮液中獲取脾臟巨噬細(xì)胞。

2.6 透射電鏡觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體將小鼠腹腔和脾臟巨噬細(xì)胞制備成細(xì)胞團(tuán)塊。2.5%戊二醛4 ℃固定過(guò)夜。用1%鋨酸固定，并用不同濃度的乙醇脫水，環(huán)氧樹脂固定，70 nm切片，JEM-1230F電子顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體。

2.7 qPCR檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織和巨噬細(xì)胞中iNOS、IL-1β及自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)取小鼠腹腔和脾臟巨噬細(xì)胞和結(jié)腸組織，采用TRIzol試劑提取RNA。按RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒說(shuō)明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒，擴(kuò)增獲得cDNA用于定量PCR。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s,共35個(gè)循環(huán)。繪制擴(kuò)增曲線及熔解曲線，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequences of qPCR

2.8 Western blot檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織和巨噬細(xì)胞中iNOS、IL-1β及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)取小鼠腹腔和脾臟巨噬細(xì)胞和結(jié)腸組織，采用細(xì)胞裂解液提取蛋白質(zhì),SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。脫脂乳室溫封閉2 h。將膜與一抗IL-1β、iNOS、p62、Beclin-1、LC3-II、β-actin 4 ℃孵育過(guò)夜。加入TBST洗滌3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h。再次加入TBST洗滌3次，以β-actin為內(nèi)參，采用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白，Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 PAP-1減輕結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸炎癥與正常組比較，模型組結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量逐漸減輕，PAP-1降低結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減輕趨勢(shì)(Fig 1A)。模型組DAI評(píng)分明顯高于正常組,PAP-1組DAI評(píng)分低于模型組(Fig 1B)。Fig 1C、1D結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組結(jié)腸黏膜病理顯示結(jié)腸損傷明顯，有明顯上皮細(xì)胞破壞，大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞丟失和黏膜下層水腫，HI評(píng)分及結(jié)腸勻漿MPO活性增高(P<0.05)；與模型組比較，PAP-1組結(jié)腸黏膜病理?yè)p傷減輕，HI評(píng)分和結(jié)腸勻漿MPO活性降低(P<0.05)。

Fig 1 Effects of PAP-1 on DSS-induced colitic

A: The daily mean weight change in each group; B: The changes of DAI in each group daily; C: The colonic HI scoring and MPO activity in each group; D: Histopathological features of the colon in each group (HE×400).#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel.

Fig 2 Effects of PAP-1 on inflammatory cytokine production of colon tissues in DSS-induced colitic mice

3.2 PAP-1對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸炎癥因子水平的影響如Fig 2所示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1、IL-6和TNF-α含量上升(P<0.05),IL-10含量下降(P<0.05)，IL-1β mRNA和蛋白的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。與模型組比較，PAP-1組小鼠結(jié)腸組織中IL-1、IL-6和TNF-α含量均下降(P<0.05),IL-10含量上升(P<0.05)，IL-1β mRNA和蛋白的表達(dá)減弱(P<0.05)。

3.3 PAP-1減少結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸巨噬細(xì)胞滲出和活化Fig 3A的免疫熒光染色顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中總巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80的表達(dá)增加，經(jīng)PAP-1處理后，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中F4/80的表達(dá)少于模型組，表明PAP-1可減少小鼠結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞的滲出。采用iNOS作為巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志，F(xiàn)ig 3B結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸組織中iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)較正常組明顯增強(qiáng), PAP-1組小鼠結(jié)腸組織中iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)較模型組減弱,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示PAP-1可能減少結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞的激活。

3.4 PAP-1對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸自噬的影響Fig 4結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)降低, p62 mRNA和蛋白表達(dá)增加；經(jīng)PAP-1處理后，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)增加，p62 mRNA和蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 3 Colonic macrophage infiltration and activation in colitic mice reduced by PAP-1

3.5 PAP-1對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腹腔巨噬細(xì)胞自噬的影響Fig 5的透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體減少，PAP-1組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體較模型組增多。Fig 6結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)降低,iNOS、IL-1β、p62 mRNA和蛋白表達(dá)增加；經(jīng)PAP-1處理后，結(jié)腸炎小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)增加，iNOS、IL-1β、p62 mRNA和蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.6 PAP-1對(duì)結(jié)腸炎小鼠脾臟巨噬細(xì)胞自噬的影響Fig 7的透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠脾臟巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體減少，PAP-1組小鼠脾臟巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬體較模型組增多。Fig 8結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠脾臟巨噬細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)降低, iNOS、IL-1β、p62 mRNA和蛋白表達(dá)增加；經(jīng)PAP-1處理后，結(jié)腸炎小鼠脾巨噬細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)增加，iNOS、IL-1β、p62 mRNA和蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 4 Effect of PAP-1 on colon autophagy

A: Effect of PAP-1 on the expression levels of colonic LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 mRNA in colitic mice; B: Effect of PAP-1 on the expression levels of colonic LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 proteins in colitic mice.#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel.

Fig 5 Effect of PAP-1 on autophagy-related structure of peritoneal macrophages observed by electron microscopy

A: Normal; B: PAP-1; C: Model; D: DSS+PAP-1. The yellow arrows represent autophagic vacuoles.

Fig 6 Effect of PAP-1 on iNOS, IL-1β and autophagy in peritoneal macrophages of colitic

A: Effect of PAP-1 on the expression levels of iNOS, IL-1β, LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 mRNA in peritoneal macrophages of colitic mice; B: Effect of PAP-1 on the expression levels of iNOS, IL-1β, LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 proteins in peritoneal macrophages of colitic mice.#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel.

Fig 7 Effect of PAP-1 on autophagy-related structure of spleen macrophages observed by electron microscopy

A: Normal; B: PAP-1; C: Model; D: DSS+PAP-1. The yellow arrows represent the autophagic vacuoles.

Fig 8 Effect of PAP-1 on iNOS, IL-1β and autophagy in spleen macrophages of colitic

A: Effect of PAP-1 on the expression levels of iNOS, IL-1β, LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 mRNA in spleen macrophages of colitic mice; B: Effect of PAP-1 on the expression levels of iNOS, IL-1β, LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 proteins in spleen macrophages of colitic mice.#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel.

4 討論

IBD是一種以免疫功能紊亂為特征的腸道難治性炎性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥黏膜中有大量活化的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞可分泌大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α等，促進(jìn)腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生,部分藥物通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能可以減輕小鼠結(jié)腸炎[2]。本研究顯示，DSS結(jié)腸炎小鼠中結(jié)腸巨噬細(xì)胞滲出增加。iNOS是巨噬細(xì)胞活化的主要標(biāo)志物。結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸和巨噬細(xì)胞中iNOS表達(dá)明顯增加，表明結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞明顯活化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸和巨噬細(xì)胞中IL-1β表達(dá)均明顯增加，提示巨噬細(xì)胞在結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

研究表明，Kv通道通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞增殖和活化過(guò)程，在疾病免疫功能調(diào)控中起關(guān)鍵作用。Kv1.3通道是巨噬細(xì)胞中重要的離子通道,活化的巨噬細(xì)胞中Kv1.3表達(dá)明顯增加[9]。因此，阻斷Kv1.3通道，降低巨噬細(xì)胞活化，可能是調(diào)控結(jié)腸炎炎癥的有效方法。研究表明，抑制淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的Kv1.3通道，可以抑制炎性細(xì)胞因子的合成，減緩?fù)砥诼阅I衰竭中腎纖維化過(guò)程，改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等具有巨噬細(xì)胞免疫功能紊亂的自身免疫炎癥性疾病[11]。Schmitz等[7]發(fā)現(xiàn)，PAP-1是一種特異性小分子Kv1.3阻斷劑，EC50為2 nmol·L-1，比Kv1.5選擇性高23倍,腹腔注射或口服PAP-1可預(yù)防遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，PAP-1可降低DSS結(jié)腸炎小鼠DAI評(píng)分、HI評(píng)分、MPO活性及促炎細(xì)胞因子水平，升高抗炎細(xì)胞因子水平，減低結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞滲出及活化。提示PAP-1可降低巨噬細(xì)胞活化，減輕結(jié)腸炎小鼠的炎癥損傷。

研究表明，自噬與IBD發(fā)病機(jī)制相關(guān)，自噬相關(guān)基因如Atg1611、IRGM與IBD易感性有關(guān)，表明自噬可能影響IBD病理生理過(guò)程[12]。Hugot等[13]發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞自噬與腸道的固有免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。Lapaquette等[14]發(fā)現(xiàn)，黏附侵襲性大腸桿菌(AIEC)刺激，可引起自噬受損的巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-6、TNF-α水平增加。Cabrera等[5]研究表明，Atg4b缺乏引起的自噬抑制，可增加DSS結(jié)腸炎的易感性,主要原因是促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織和腹腔巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。提示IBD中巨噬細(xì)胞與自噬密切關(guān)系。Ke等[9]發(fā)現(xiàn)，在LPS/DSS刺激的腹腔巨噬細(xì)胞以及DSS結(jié)腸炎小鼠中，自噬可抑制NLRP3炎性體活化。因此，PAP-1阻斷Kv1.3通道，減輕結(jié)腸炎的相關(guān)機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞自噬有關(guān)。

與有關(guān)研究結(jié)果相似[15]，本研究結(jié)果顯示，DSS結(jié)腸炎小鼠巨噬細(xì)胞和結(jié)腸組織中p62表達(dá)增加，Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)降低，同時(shí)巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬泡減少，表明DSS結(jié)腸炎小鼠巨噬細(xì)胞和結(jié)腸組織自噬受到抑制。p62與LC3結(jié)合，將靶底物送至自噬體以降解,自噬受損時(shí)p62水平升高。Beclin-1是Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物的重要組成部分，參與自噬體形成。LC3-II參與自噬體膜的延伸及閉合,是監(jiān)測(cè)自噬水平的重要標(biāo)準(zhǔn)，其表達(dá)量與自噬體數(shù)量相關(guān)[4]。PAP-1可降低結(jié)腸炎小鼠巨噬細(xì)胞和結(jié)腸組織中p62表達(dá)，增加Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá),同時(shí)增加巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬泡形成，表明PAP-1可降低DSS結(jié)腸炎小鼠巨噬細(xì)胞和結(jié)腸組織的自噬抑制，減輕巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的結(jié)腸固有免疫炎癥反應(yīng)。

綜上所述，PAP-1可減輕DSS結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥損傷，減輕巨噬細(xì)胞和結(jié)腸組織自噬抑制，提示PAP-1促進(jìn)自噬通路修復(fù)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞固有免疫功能。