脂氧素A4改善肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的體外實(shí)驗(yàn)研究

陳云志，連澤來，余華軍，孔鴻儒，戴勝杰，黃超豪，孫洪偉

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)一班，浙江 溫州325035）

脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）是機(jī)體自身在炎癥后期產(chǎn)生的一種內(nèi)源性脂質(zhì)抗炎介質(zhì)，能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的及時(shí)消退，其最突出的優(yōu)點(diǎn)是在炎癥的病理過程中發(fā)揮作用且不會(huì)干擾機(jī)體正常的生理活動(dòng)，無糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥和免疫抑制劑等傳統(tǒng)抗炎藥的多種副作用[1-2]。因此，LXA4代表著全新的“促進(jìn)炎癥消退”的炎癥治療策略，可能有很好的臨床應(yīng)用前景[3]。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LXA4對重癥急性胰腺炎（sever acute pancreatitis，SAP）繼發(fā)的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）有治療作用，但其具體的作用機(jī)制尚不十分清楚。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）是肺的主要功能細(xì)胞，它介于血液和組織之間，在SAP繼發(fā)ALI的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4-5]。因此我們推測，LXA4對SAP繼發(fā)ALI的治療作用可能是通過改善PMVECs的炎癥損傷來實(shí)現(xiàn)的。本研究就LXA4對因炎癥受損的PMVECs是否有治療作用進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑材料

PMVECs（廣州Focusbio生物科技有限公司）；RPMI 1640（美國Gibco公司）；胰蛋白酶、DMSO、MTT（Sigma公司）；胎牛血清（美國HyClone公司）；LXA4（美國Cayman公司）；TNF-α（英國PEPROTECH公司）；ReverTra Ace? qPCR RT Kit、SYBR? Green Realtime PCR Master Mix（日本TOYOBO公司）；GAPDH、IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65引物序列（上海Invitrogen生物有限公司）。

1.2 主要儀器

5% CO2恒溫培養(yǎng)箱；細(xì)胞超凈工作臺；倒置相差顯微鏡；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及分析軟件；

1.3 PMVECs的培養(yǎng)

用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10% HyClone胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），在37 ℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，瓶底被細(xì)胞鋪滿時(shí)，用0.25%胰酶消化，傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 分階段實(shí)驗(yàn)及分組

第一階段：分為空白對照組（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）和TNF-α組（分別以5、10、20 ng/mL處理24 h），采用MTT法檢測空白對照組及不同濃度TNF-α組對PMVECs存活率及單層通透性的影響。第二階段：分為模型組（20 ng/mL TNF-α處理24 h）和治療組（1、10、100 μg/L LXA4干預(yù)24 h），檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.5 指標(biāo)檢測

（1）PMVECs的鑒定及形態(tài)觀察：培養(yǎng)的PMVECs采用免疫熒光法檢測細(xì)胞CD31的表達(dá)，以此來鑒定不同組PMVECs在倒置顯微鏡下觀察生長情況及形態(tài)改變。（2）各組PMVECs細(xì)胞存活率檢測：采用MTT法。（3）各組PMVECs單層通透性的測定：用針頭式濾器檢測TNF-α損傷前后及LXA4干預(yù)后PMVECs單層通透性的變化。（4）各組PMVECs IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA的表達(dá)情況：細(xì)胞完成相應(yīng)處理后，用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明分兩步完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：第一步，RNA在65 ℃進(jìn)行5 min后，立即冰上冷卻；第二步，反應(yīng)液組成：RT Enzyme Mix 0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，5×RT Buffer 2 μL，Nuclease-free Water 6 μL，RNA 1 μL；反應(yīng)條件：37 ℃、15 min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)→98 ℃、5 min酶失活反應(yīng)；進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（引物設(shè)計(jì)和合成由上海Invitrogen生物有限公司完成，具體見表1）。

表1 基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PMVECs干預(yù)前后形態(tài)對比

首先通過免疫熒光CD31鑒定PMVECs，正常內(nèi)皮細(xì)胞單層呈“鋪路石樣”外觀，CD31抗體免疫熒光染色后呈強(qiáng)陽性（如圖1A所示）?？瞻讓φ战M細(xì)胞生長狀態(tài)良好，貼壁牢固，細(xì)胞間連接緊密，多角形或長條梭形，大小均勻，邊界清楚，呈單層“鋪路石”樣生長排列（如圖1B所示）。TNF-α處理后，細(xì)胞收縮、變圓，胞體變小，細(xì)胞間隙增寬，胞核模糊，細(xì)胞邊界變模糊，有細(xì)胞脫落的現(xiàn)象（如圖1C所示）。而LXA4干預(yù)后，與TNF-α處理組比較，細(xì)胞收縮情況有所好轉(zhuǎn)，呈短或長梭形改變，細(xì)胞邊界有向正常組變化的趨勢，細(xì)胞間緊密，細(xì)胞脫落較少（如圖1D所示）。

圖1 PMVECs干預(yù)前后形態(tài)對比

2.2 PMVECs經(jīng)TNF-α干預(yù)前后細(xì)胞存活率的改變

經(jīng)不同濃度TNF-α干預(yù)后，PMVECs存活率明顯下降，且該副效應(yīng)隨TNF-α濃度遞增逐漸加強(qiáng)，如表2所示。

表2 不同濃度TNF-α干預(yù)PMVECs前后細(xì)胞存活率的改變（±s，n=6）

表2 不同濃度TNF-α干預(yù)PMVECs前后細(xì)胞存活率的改變（±s，n=6）

與空白對照組比較，**P＜0.01

分組 存活率（%） P值空白對照組 100±5.42 -5 ng/mL TNF-α組 76.39±9.30** 0.0003 10 ng/mL TNF-α組 61.87±11.67** ＜0.0001 20 ng/mL TNF-α組 49.54±12.64** ＜0.0001

2.3 不同濃度LXA4對TNF-α干預(yù)后PMVECs存活率的影響

TNF-α干預(yù)后的PMVECs，經(jīng)不同濃度LXA4處理，其存活率明顯改善，且該正效應(yīng)隨著LXA4濃度的遞增逐漸加強(qiáng)，如表3所示。

2.4 TNF-α對PMVECs單層通透性的影響及LXA4處理后的改善作用

表3 LXA4對炎癥損傷的PMVECs存活率的影響（±s，n=6）

表3 LXA4對炎癥損傷的PMVECs存活率的影響（±s，n=6）

與TNF-α組比較，**P＜0.01

組別 存活率（%） P值T N F-α組（2 0 n g/m L，下同） 5 0.7 3±1 4.4 3 -T N F-α+1 μ g/L L X A 4組 6 1.2 8±1 6.6 6 0.2 6 8 4 T N F-α+1 0 μ g/L L X A 4組 6 9.8 1±1 5.3 3 0.0 5 0 3 T N F-α+1 0 0 μ g/L L X A 4組 8 2.3 2±8.7 1** 0.0 0 1 0

TNF-α損傷30、60、90 min后PMVECs單層通透系數(shù)（Kf值）較損傷前顯著增高；加入LXA4干預(yù)時(shí)Kf值均顯著低于TNF-α組。測定結(jié)果如表4所示。

2.5 LXA4對損傷后PMVECs炎癥因子表達(dá)的影響

我們通過熒光定量RT-PCR分別檢測空白對照組、模型組及治療組（100 μg/L LXA4干預(yù)）的炎癥因子IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65的mRNA表達(dá)情況（采用2-△△CT方法進(jìn)行計(jì)算）。結(jié)果顯示，TNF-α處理后，損傷的PMVECs炎癥因子IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65的mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。而經(jīng)LXA4干預(yù)后，IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65的mRNA表達(dá)明顯減少（P＜0.05），基本恢復(fù)到TNF-α干預(yù)前的水平（P＞0.05），如表5所示。

表4 TNF-α及LXA4對PMVECs通透系數(shù)的影響（±s，n=3）

表4 TNF-α及LXA4對PMVECs通透系數(shù)的影響（±s，n=3）

與損傷前比較用*P表示，與TNF-α組比較用#P表示

Kf（mL/min·cm2·kPa）損傷前 損傷后15 min 損傷后30 min 損傷后60 min 損傷后90 min TNF-α組 0.021±0.011 0.019±0.015 0.037±0.005 0.067±0.007 0.096±0.007*P值 - 0.8613 0.0835 0.0036 0.0006 TNF-α+LXA4組 0.019±0.010 0.020±0.008 0.029±0.009 0.039±0.008 0.058±0.011*P值 - 0.8989 0.2674 0.0538 0.0105#P值 0.8272 0.9238 0.2496 0.0103 0.0072組別

表5 三組炎癥因子的熒光定量RT-PCR結(jié)果（±s，n=3）

表5 三組炎癥因子的熒光定量RT-PCR結(jié)果（±s，n=3）

與對照組比較用*P表示，與模型組比較用#P表示

組別 m R N A相對表達(dá)量I L-1 β V C A M-1 N F-κ B p 6 5對照組 1.0 3±0.2 2 1.1 0±0.2 3 1.0 7±0.0 9模型組 5.8 9±0.1 4 2.4 6±0.5 4 3.8 3±0.3 2*P值 ＜0.0 0 0 1 0.0 1 6 0 0.0 0 0 1治療組 1.1 2±0.1 2 1.1 4±0.1 9 1.1 5±0.1 1*P值 0.5 6 7 6 0.8 2 7 8 0.3 8 4 8#P值 ＜0.0 0 0 1 0.0 1 6 2 0.0 0 0 2

3 討論

介于血液和組織間隙之間的PMVECs對調(diào)節(jié)肺的氣體交換及血液與肺間質(zhì)之間的水液平衡至關(guān)重要[6]。炎癥介質(zhì)導(dǎo)致PMVECs形態(tài)與功能受損，誘導(dǎo)PMVECs凋亡，由此引發(fā)PMVECs的連接由正常的緊密變?yōu)椴B(tài)的疏松，最終使PMVECs屏障功能受損，毛細(xì)血管通透性增加，從而使得血管中的蛋白質(zhì)及體液向肺間質(zhì)的滲出增加，繼而導(dǎo)致ALI的發(fā)生[7-8]。TNF-α是炎癥介質(zhì)的典型代表，是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白，是炎癥損傷級聯(lián)反應(yīng)的觸發(fā)劑，在SAP繼發(fā)的ALI發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[9]。

本研究體外培養(yǎng)人PMVECs，鏡下觀察到正常細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈大小均勻地多角形或長條梭形，貼壁牢固，細(xì)胞間連接緊密，呈單層“鋪路石”樣生長排列，與國內(nèi)外研究報(bào)道一致[10-11]。而采用不同濃度（5、10、20 ng/mL）TNF-α干預(yù)PMVECs后，鏡下觀察PMVECs細(xì)胞收縮，胞體變小，形態(tài)變圓，細(xì)胞邊界模糊，間隙增寬，胞核模糊，有細(xì)胞脫落現(xiàn)象。與空白對照組PMVECs相比，TNF-α干預(yù)后的PMVECs存活率顯著降低，且隨著TNF-α濃度的升高，PMVECs的存活率明顯降低，單層通透性明顯升高。TNF-α干預(yù)后的PMVECs IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)量均顯著升高。上述結(jié)果均證明，TNF-α確能引起PMVECs的ALI。TNF-α主要通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的TNF-α受體，使PMVECs產(chǎn)生IL-1β和IL-6等，共同介導(dǎo)病變血管的炎癥反應(yīng)[9，12]。TNF-α與其受體結(jié)合后主要通過影響細(xì)胞內(nèi)調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子（如NF-κB）的活化來調(diào)控炎癥反應(yīng)，可激活中性粒細(xì)胞增加其表達(dá)白細(xì)胞分化抗原CD11+/CD18+復(fù)合物，同時(shí)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC），使其表達(dá)ICAM-1與血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1），從而導(dǎo)致白細(xì)胞和EC間相互作用，促使釋放大量活性氧和彈性蛋白酶，損害血管內(nèi)皮細(xì)胞和器官組織細(xì)胞，增加血管通透性[6，13-14]。

LXA4是機(jī)體自身在急性炎癥后期產(chǎn)生的一類脂質(zhì)抗炎介質(zhì)，具有廣泛的抗炎促消退功能，被譽(yù)為炎癥反應(yīng)的“剎車信號”或“停止信號”。本研究結(jié)果顯示，LXA4干預(yù)組與TNF-α處理組比較，其PMVECs細(xì)胞收縮情況有所好轉(zhuǎn)，細(xì)胞間緊密，細(xì)胞脫落較少，細(xì)胞邊界有向正常組變化的趨勢；且PMVECs存活率和單層通透性均顯著改善，該效應(yīng)具有劑量依賴性；PMVECs的炎癥因子IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA表達(dá)量均顯著下降。因此，我們的研究結(jié)果證實(shí)，LXA4確能改善TNF-α引起的PMVECs急性炎癥損傷。但LXA4通過何種分子途經(jīng)達(dá)到上述治療作用，本研究尚未明確，我們推測可能與TNF-α的炎癥通路和凋亡通路相關(guān)，有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。