基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的左金丸治療結(jié)直腸癌的作用機制分析＊

潘秋莎，楊夢蝶，呼雪慶，趙 明,2，蘇式兵＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院 上海 201203；2.AntiCancer,Inc.圣地亞哥 92111）

左金丸，又名“萸連丸”。首載于《丹溪心法》,為金元著名醫(yī)家朱丹溪所創(chuàng)，方中重用苦寒之黃連為君,佐以辛熱之吳茱萸,清泄肝火,降逆止嘔。左金丸藥理學(xué)研究表明其在潰瘍性結(jié)腸炎、胃粘膜損傷中良好的效果[1]。近年來有研究表明左金丸在結(jié)直腸癌的治療和研究中有突出的表現(xiàn)，其單體成分小檗堿、吳茱萸堿和槲皮素等更是在結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）的實驗研究中有明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，促進腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制癌基因表達(dá)等作用[2]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)生物學(xué)的角度出發(fā),融合了多向藥理學(xué)的思想，結(jié)合計算機技術(shù)，通過構(gòu)建生物分子網(wǎng)絡(luò)，分析和預(yù)測中藥及復(fù)方治療疾病中多成分、多靶點及多途徑的機制研究[3,4]。利用中藥靶標(biāo)及藥理活性預(yù)測，通過建立藥物-靶點-疾病之間的相互關(guān)系進行分析，可以揭示藥物作用于人體的效應(yīng)機制[5,6]。本研究通過多種公共數(shù)據(jù)平臺，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，獲取左金丸和結(jié)直腸癌的相關(guān)信息。構(gòu)建左金丸作用于結(jié)直腸癌的成分-靶點-疾病的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，揭示左金丸治療結(jié)直腸癌的潛在作用機制，并為左金丸的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為中藥及中藥復(fù)方的藥理作用、效應(yīng)機制提供新的研究思路和方法。

1 材料與方法

1.1 左金丸活性成分及靶點篩選

本研究依托中藥綜合數(shù)據(jù)庫分析平臺TCMSPlsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php[7]；HIT（http://lifecenter.sgst.cn/hit）[8]；TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid）[9]；TCMdatabase@taiwan（tcm.cmu.edu.tw）[10]，檢索收集左金丸中黃連、吳茱萸的化學(xué)成分，按照口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和化合物類藥性(Druglikeness，DL)≥0.18進行篩選，得到即為左金丸的的活性成分。OB是指藥物分子通過口服的方式進入人體循環(huán)系統(tǒng)能力的重要參數(shù)，同時也是作為藥物篩選過程及分子類藥性的一個重要指標(biāo)[11]；DL的閾值篩選通常用于藥物研發(fā)中，可將高質(zhì)量的先導(dǎo)化合物從大量的化合物分子庫中篩選出進而提高藥物設(shè)計的精準(zhǔn)率[12]。 通 過 數(shù) 據(jù) 庫 TCMSP、Drugbank（http://www.drugbank.ca）[13]檢索活性成分對應(yīng)的人類靶蛋白，通過該數(shù)據(jù)庫 SIB（http://www.swisstargetprediction.ch）[14]、SEA（http://sea.bkslab.org/）[15]進行化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性擴展,篩選相對應(yīng)的人類靶蛋白。將以上得到的靶點合并去重，刪掉無對應(yīng)的靶點及成分。通過軟件Cytoscape 6.1（http://www.cytoscape.org）[16]構(gòu)建左金丸成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，按照大于Degree平均值為卡值，進一步構(gòu)建左金丸的核心成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.2 結(jié)直腸癌疾病靶點收集

數(shù)據(jù)庫DisGeNET（www.disgenet.org）[17];OMIM（http://www.omim.org）[18]；OUGene（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/OUGene）[19]等涵蓋了人類遺傳疾病信息及治療疾病的藥物信息，通過疾病名稱或癥狀關(guān)鍵詞搜索可獲得疾病或癥狀的靶點信息，檢索提取其相關(guān)的靶基因。

1.3 構(gòu)建左金丸治療結(jié)直腸癌的功能靶點

將預(yù)測所得的左金丸靶點蛋白及結(jié)直腸癌靶基因相互交集，與預(yù)測所得的核心靶點，合并去重后得到的靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/Version10.5）[20],獲得蛋白互作關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),將數(shù)據(jù)保存為TSV格式。將文件中node1、node2和Combined score信息導(dǎo)入Cytoscape6.1中。Cytoscape是一個開放源碼的生物信息分析軟件。通過其Network Analyzer功能分析，以大于中介中心（Betweenness）和節(jié)點介度（Degree）平均值為卡值，對上述的數(shù)據(jù)進行分析，構(gòu)建左金丸作用于結(jié)直腸癌的功能靶點網(wǎng)絡(luò)。

節(jié)點介度，又稱為連通性，是一個基因擁有邊（調(diào)控關(guān)系）的數(shù)量，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中節(jié)點（note）的大小與度成正比關(guān)系，節(jié)點越大，表示與此節(jié)點相連的邊越多，即與這個基因的關(guān)聯(lián)性更大[21]。中介中心，是一個結(jié)點擔(dān)任其它兩個結(jié)點之間最短路的橋梁的次數(shù)，反映在網(wǎng)絡(luò)中某一節(jié)點與其他節(jié)點之間的接近程度。通常以最短路徑數(shù)量計算，設(shè)節(jié)點s和節(jié)點t，用d(s,t)表示節(jié)點s到節(jié)點t的距離,δst表示節(jié)點s到節(jié)點t的最短路徑數(shù)量δst（v）表示節(jié)點s到節(jié)點t的最短路徑中經(jīng)過節(jié)點v的數(shù)量，所以經(jīng)過v點的路徑數(shù)量為:∑δst(μ)/δst[22]。

1.4 構(gòu)建左金丸治療結(jié)直腸癌的成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

利用在線工具 Davaid6.7（https://david.ncifcrf.gov）[23]對篩選所得的核心靶點進行基因本體GO生物學(xué)功能富集分析和KEGG通路富集分析。所得值按按Bonferroni法校正后，P＜0.01篩選。為了能直觀闡述左金丸治療結(jié)直腸癌的作用機制，選取P值排名前二十的通路信息構(gòu)建左金丸的活性成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)結(jié)構(gòu)，構(gòu)建左金丸部分成分-靶點-通路圖，闡釋左金丸作用于結(jié)直腸癌的作用機制。

2 結(jié)果

2.1 左金丸活性成分及其靶點的篩選

經(jīng)過對左金丸化學(xué)成分收集，得到234種化合物，其中黃連62種、吳茱萸172種。篩選后得共41種活性成分,黃連15種,吳茱萸26種,主要有槲皮素、β淄谷醇、異鼠李素、吳茱萸堿、小檗堿等。其共有成分包括了小檗 堿（Berberine）、槲 皮 素（Quercetin）及 黃 柏 酮（Obacunone）3種。

在TCMSP、Drugbank中查找41個成分對應(yīng)的人類靶蛋白，得到靶蛋白360個。其中黃連162個，吳茱萸198個。通過SEA和SIB數(shù)據(jù)庫，對活性成分進行成分相似性擴展靶點預(yù)測，得到281個靶點，全部合并去重后得到482個靶點，其中黃連共有224個，吳茱萸有262個，刪除無靶點對應(yīng)的成分，得到36個活性成分。運用軟件Cytoscape6.1構(gòu)建左金丸成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（圖1A）。該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)共有610條邊，共522個節(jié)點，結(jié)構(gòu)平均節(jié)點度為3.86，其中有36個節(jié)點為左金丸的活性核心成分。進一步，結(jié)構(gòu)建核心成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，按照中介中心度（Betweenness）和節(jié)點介度（Degree）平均值篩選，得到72個核心靶點，構(gòu)建左金丸的核心成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（表1，圖1B）。

2.2 結(jié)直腸癌的疾病基因

在數(shù)據(jù)庫 GENenNET、OMIM、OUGene中輸入“colorectal cancer”查找與其有關(guān)的基因蛋白信息，收集合并得到737個靶基因。

圖1 左金丸成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 構(gòu)建左金丸治療結(jié)直腸癌的功能靶點網(wǎng)絡(luò)

將上述左金丸預(yù)測所得482個靶點與結(jié)直腸癌的737疾病基因，通過維恩分析得到共有靶點58個（圖2A）。將其與預(yù)測分析所得核心靶點合并去重后得到120個靶點蛋白，通過數(shù)據(jù)庫String，分析蛋白之間的相互關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。再通過Cytoscape6.1對所得數(shù)據(jù)進一步分析，選取大于中介中心（Betweenness）和節(jié)點介度（Degree）的平均值，得到50個靶點蛋白，即為左金丸作用于結(jié)直腸癌的功能靶點。構(gòu)建左金丸治療結(jié)直腸癌的潛在功能靶點網(wǎng)絡(luò)（圖2B），網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點越大，其Degree值越高，意味著與結(jié)直腸癌的關(guān)系更為密切。排名靠前涉及靶點有PIK3CA、AKT1、TP53、HIF-1α、BAX、MYC、CCND1、EGFR、STAT3、MMP9等。

表1 左金丸活性成分

2.4 左金丸作用于結(jié)直腸癌的成分-功能靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

利用平臺Davaid6.8對左金丸治療結(jié)直腸癌的潛在功能靶點進行基因功能及通路分析。得到基因GO本體條目283條，涉及核質(zhì)、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)調(diào)控等方面，基因百科全書（KEGG）通路58條，將P值排名前二十的功能信息展示（表2）。結(jié)果顯示：左金丸的活性成分主要富集在細(xì)胞增殖正調(diào)節(jié)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化正調(diào)控、細(xì)胞遷移正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等生物過程；細(xì)胞組成方面主要富集在細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)等方面；分子功能主要涉及了蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。其通路主要富集在癌癥途徑、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1信號通路、PI3K-AKT信號通路、HTLV-1感染通路、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、FoXO信號通路等。通過Cytoscape6.1構(gòu)建左金丸成分-作用靶點-通路網(wǎng)絡(luò)（圖2C）。

2.5 左金丸部分成分-靶點-通路分析

構(gòu)建左金丸治療結(jié)直腸癌的成分靶點通路，結(jié)合文獻(xiàn)將預(yù)測所得左金丸作用于結(jié)直腸癌的功能靶點，及其對應(yīng)的成分、通路通過示意圖綜合展示（圖3）。如圖所示，圖中綠色箭頭表示促進作用，紅色的T線表示抑制作用，黃色的圓形表示左金丸作用于結(jié)直腸癌

的作用靶點，綠色圓形表示通路的靶點，藍(lán)色箭頭表示靶點對應(yīng)的成分，白色框內(nèi)表示相關(guān)通路。

表2 顯著富集前二十條生物過程和KEGG(Р＜0.01)

圖3 左金丸治療結(jié)直腸癌的部分功能靶點通路

實驗研究表明，左金丸抗腫瘤的機制是多成分、多靶點、多途徑作用的。研究觀察槲皮素對結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO影響，發(fā)現(xiàn)其可通過上調(diào)P21和P27的表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯與G0/G1期，上調(diào)凋亡蛋白p53，誘導(dǎo)RKO細(xì)胞發(fā)生凋亡[24]；使用槲皮素處理人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，結(jié)果表明其可以明顯抑制細(xì)胞中Bcl-2，C-myc的表達(dá)水平，進而抑制了腫瘤細(xì)胞的的侵襲和轉(zhuǎn)移[25,26]。因而，在不同的細(xì)胞中，槲皮素的作用機制及途徑各不相同，但主要是通過下調(diào)癌癥相關(guān)基因，上調(diào)抗癌基因從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。β淄谷醇具有抗腫瘤活性，但其與結(jié)直腸癌之間的研究甚微，有研究發(fā)現(xiàn)β-淄谷醇能抑制人結(jié)腸腺癌細(xì)胞COLO320中βcatenin蛋白及細(xì)胞增殖抗原PCNA的表達(dá)，進而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[27]。吳茱萸堿可通過降低缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的及Akt1/2的蛋白水平，抑制PI3K/Akt的信號傳導(dǎo)，進而抑制人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[28]；此外，趙[29]等人探索吳茱萸堿對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116增殖和遷移的影響，檢測到隨著時間和藥物濃度的增加，吳茱萸堿通過下調(diào)CyclinA1的表達(dá)，激活P53信號通路和Caspase-3促進細(xì)胞發(fā)生凋亡，且抑制細(xì)胞內(nèi)的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（Glucose Phospho Isomerase，PGI）介導(dǎo)的JAK2/STAT3信號通路的激活，降低MMP-3的表達(dá)實現(xiàn)細(xì)胞遷移抑制作用。由此可見，吳茱萸堿在抗結(jié)直腸癌中主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞遷移等作用。研究表明小檗堿能促進腸癌細(xì)胞HCT116及SW480中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的表達(dá)，通過靶向激活MAPK信號通路從而抑制了AOM/DSS誘導(dǎo)形成的腸癌[30]。檢測異鼠李素對LOVO細(xì)胞的增殖凋亡影響，發(fā)現(xiàn)其可抑制EGFR磷酸化，提高BAX的表達(dá)水平，降低Bcl-2的表達(dá)水平進而實現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。結(jié)合以上文獻(xiàn)及預(yù)測結(jié)果分析，本研究認(rèn)為左金丸主要活性成分在作用于結(jié)直腸癌中的靶點分別如下：槲皮素主要對應(yīng)靶點有 P53、bcl-2、bax[32]等；異鼠李素主要對應(yīng)靶點TNFR、EGFR等；吳茱萸堿主要主要對應(yīng)靶點有HIF-1α、PI3K、AKT、P53及Bax[33]、NF-κB及VEGFA[34]等；β淄谷醇主要對應(yīng)到靶點β-catenin等；小檗堿對應(yīng)的靶點有HSP90、p53、Fas等；異鼠李素對應(yīng)的靶點有EGFR、BAX、Bcl-2等。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，病變部位主要侵及結(jié)直腸。據(jù)2018年國家癌癥數(shù)據(jù)中心統(tǒng)計報告顯示：結(jié)直腸癌男性發(fā)病率位居第四，女性第三，死亡率均占第四。

左金丸中活性成分槲皮素、吳茱萸堿及小檗堿在結(jié)直腸癌的治療研究中報道相對較多，藥理學(xué)研究顯示槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及抗炎的作用[35]，可通過P53等信號通路抑制腫瘤細(xì)胞增生，進而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明吳茱萸堿除了抗炎鎮(zhèn)痛，抗病原微生物的作用外，還能增強機體的抗缺氧能力[36]，在結(jié)直腸癌的治療機制研究中主要涉及抑制細(xì)胞的增殖和周期、促進凋亡及自噬、抑制腫瘤血管新生等方面，其涉及的相關(guān)通路主要有PI3K-AKT、JAKSTAT等[37]。小檗堿具有抗炎、殺菌作用，另外研究也表明其也具有抗腫瘤、降血糖等作用，在結(jié)直腸癌中的研究主要涉及抑制腫瘤細(xì)胞增生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面[38]。

據(jù)已有文獻(xiàn)報道顯示：在實體瘤中，慢性缺氧環(huán)境能促進腫瘤細(xì)胞的增殖遷移及侵襲能力，而細(xì)胞上皮間質(zhì)化是細(xì)胞喪失上皮表型轉(zhuǎn)為間質(zhì)化細(xì)胞進而產(chǎn)生腫瘤原位浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素之一。缺氧環(huán)境下，胞內(nèi)的HIF-1α表達(dá)升高，而與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白鈣黏附蛋白表達(dá)下調(diào)，PI3K/Akt信號通路下游信號分子AKT1及ATM激酶磷酸化水平上調(diào)，HIF-1的主要靶基因是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），它在腫瘤細(xì)胞中參與腫瘤細(xì)胞的新生，能使細(xì)胞耐受缺氧環(huán)境，促進腫瘤生長，因此HIF-1通路的活化是結(jié)直腸癌發(fā)生的一個重要機制之一[39]。研究表明炎癥在結(jié)直腸癌的發(fā)病中是一個至關(guān)重要的因素，慢性腸道炎癥對腸道持續(xù)性的刺激會使腸道上皮細(xì)胞持續(xù)性活化，進而使得細(xì)胞或血管異常增生。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中有過度活化的STAT3異常表達(dá)，其可誘導(dǎo)SOCS3基因甲基化，進而導(dǎo)致STAT3通路失衡、持續(xù)活化。STAT3是IL-6的活化因子，而IL-6與結(jié)直腸的發(fā)病密切相關(guān)，STAT3在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起著不可忽視的作用[40]。P53是抑癌基因，其突變是腫瘤發(fā)生的一個關(guān)鍵因素，在P53和結(jié)直腸癌的相關(guān)的通路中多表現(xiàn)與促細(xì)胞凋亡相關(guān)[41]。由此可見，左金丸在治療結(jié)直腸癌中涉及到相關(guān)的靶點主要與促進細(xì)胞凋亡、抑制炎癥、抑制細(xì)胞和血管增生密切相關(guān)。

在本研究預(yù)測結(jié)果中顯示富集通路FoXO信號通路，目前在結(jié)直腸癌的研究中，尚未見到左金丸及其活性成分與FoXO通路直接相關(guān)的的研究報道。其轉(zhuǎn)錄因子FoxO1中的蘇氨酸、絲氨酸以及賴氨酸殘基的磷酸化修飾能使其穿梭于細(xì)胞核內(nèi)外,最終導(dǎo)致FoxO1轉(zhuǎn)錄活性的改變，進而參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和抵抗氧化應(yīng)激等[42]，但其在結(jié)直腸癌的發(fā)展中起著何種作用仍需要實驗驗證。

4 結(jié)論

本研究通過分析得到左金丸核心成分36種，其排名靠前且與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的有槲皮素、小檗堿、吳茱萸堿等；50個潛在功能靶點，主要功能靶點涉及PIK3CA、TP53、HIF-1α、STAT3等；283條GO生物功能及58條KEGG，其中與HIF-1、PI3K-AKT等信號通路密切相關(guān)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)測分析結(jié)合表明：左金丸作用于結(jié)直腸癌潛在的機制可概括為：①調(diào)節(jié)機體免疫耐受能力，增強宿主免疫抵抗，抑制炎癥對腸粘膜的持續(xù)性刺激，進而阻止了細(xì)胞的異常增生；②通過上調(diào)抑癌基因，下調(diào)癌癥相關(guān)因子，促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；③降低腫瘤細(xì)胞的耐受缺氧環(huán)境，促進細(xì)胞細(xì)胞發(fā)生凋亡及上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)移。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法為中藥方劑效應(yīng)機制的研究提供了新的研究方法，也為中醫(yī)經(jīng)典名方的實驗研究及臨床應(yīng)用提供了進一步的理論依據(jù)和研究思路。但是，由于研究依托公共數(shù)據(jù)平臺，難以獲得完整、準(zhǔn)確和及時的數(shù)據(jù)，且缺乏網(wǎng)絡(luò)藥理的量化分析技術(shù)，這些是目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的局限。其次，中醫(yī)在臨床上講究辨證論治，處方更是需要辯證施治，本研究尚未對復(fù)方配伍中的劑量關(guān)系層次進行探討。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果有待進一步驗證。