劉芮池，程有普，柴阿麗，石延霞，謝學(xué)文，帕提古麗，李寶聚

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津300384；3新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091）

0 引言

【研究意義】瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）隸屬卵菌門(mén)，是一種重要的土傳病原菌，通常侵染幼苗的根和種子，造成大量死苗[1]。尖鐮孢（Fusarium oxysporum）是一種世界性分布的土傳病原菌，引起維管束病害，近幾年來(lái)蔬菜枯萎病發(fā)生面積逐年擴(kuò)大[2-3]。大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）可侵染大豆、番茄、茄子、馬鈴薯等，引發(fā)黃萎病、根腐病、莖基腐病等，目前尚無(wú)有效防治手段[4]。由于這 3種病原菌引起的病害癥狀與其他植物病害相似度高，尤其病害初期癥狀不明顯，僅靠肉眼不能準(zhǔn)確判斷病害種類。而防治不同病原菌所用藥劑不同，錯(cuò)誤的診斷導(dǎo)致用藥及防治失敗，所以在病害潛伏期或發(fā)病初期作出準(zhǔn)確診斷，有利于及時(shí)采取針對(duì)性防治措施，減少損失[5-7]。因此，對(duì)于上述3種侵染蔬菜的土傳病原菌，亟需建立科學(xué)、準(zhǔn)確、快速、高通量的檢測(cè)方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的病害診斷依賴于病害癥狀的觀察和病原菌的分離與鑒定，但病害的癥狀觀察需要典型癥狀出現(xiàn)才可準(zhǔn)確判斷，病原菌的分離培養(yǎng)易受環(huán)境、培養(yǎng)條件等影響，操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿足高通量、快速的檢測(cè)要求，不利于大規(guī)模樣品的分析鑒定[8-12]。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，已有許多成熟的技術(shù)可用于植物病原菌的檢測(cè)。THOMAS等[13]利用腐霉菌的18S rRNA基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物 Pyth712Fwd/Pyth1758Rev對(duì)腐霉菌屬進(jìn)行了普通PCR檢測(cè)；加拿大地區(qū)的大豆生產(chǎn)受腐霉菌影響嚴(yán)重，MARCHAND等[14]于 2010—2012年采集土壤樣本，對(duì)分離出的腐霉菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序以鑒定不同的腐霉菌物種；GEISER等[15]采用引物EF1/EF2擴(kuò)增TEF基因區(qū)域以鑒定鐮孢菌；RAHJOO等[16]于2004—2005年在伊朗11個(gè)地區(qū)分離出191株鐮孢菌，通過(guò)TEF區(qū)域特異性引物VER1/2和PRO1/2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定結(jié)果顯示分別為尖鐮孢、層出鐮孢（F. proliferatum）和黃色鐮孢（F. culmorum）；LI等[17]設(shè)計(jì)了引物NMS1/NMS2用于輪枝菌屬的鑒定；BRESSAN等[18]通過(guò)ITS區(qū)域建立了一種快速、特異的PCR檢測(cè)方法用于土壤中大麗輪枝菌的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為4 fg?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】針對(duì)多種土傳病原菌的多重PCR檢測(cè)技術(shù)的研究鮮有報(bào)道。針對(duì)田間多種病原菌復(fù)合侵染問(wèn)題，建立3種土傳病原菌的多重PCR體系，同時(shí)檢測(cè)多種病原菌，提高檢測(cè)效率，為病害防治贏得時(shí)間?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】篩選適宜的檢測(cè)引物，優(yōu)化多重PCR檢測(cè)體系，建立能夠同時(shí)檢測(cè)蔬菜瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌的多重PCR檢測(cè)方法，提高病原菌檢測(cè)效率，為病害的診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年12月至2018年12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔬菜病害綜合防治課題組提供，其中瓜果腐霉、尖鐮孢、大麗輪枝菌為檢測(cè)病菌（表1）。

表1 供試菌株Table 1 The strains used in the test

1.2 基因組DNA的提取

取適量?jī)龈删z樣品，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多重PCR引物組合

檢索國(guó)內(nèi)外關(guān)于瓜果腐霉、尖鐮孢、大麗輪枝菌的分子檢測(cè)報(bào)道，選取可能組合的引物。瓜果腐霉采用 ASANO等[19]設(shè)計(jì)的特異引物 AsAPH2B/AsPyF；尖鐮孢引物采用FOF1/FOR1[20]；大麗輪枝菌采用引物VActF/VActR[21]。

通過(guò)NCBI網(wǎng)站對(duì)引物組進(jìn)行BLAST比對(duì)，檢測(cè)這3對(duì)引物之間相似度是否符合組成多重PCR的條件，設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。引物由北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成（表2）。

1.4 多重PCR體系的建立

對(duì)影響三重 PCR體系的重要因素進(jìn)行優(yōu)化。58—65℃之間設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)程序，共58、58.7、59.6、60.8、62.4、63.7、64.5、65℃ 8個(gè)梯度；引物AsAPH2B/AsPyF 濃度設(shè)定 0.12、0.16 和 0.20 μmol·L-13個(gè)梯度，引物 FOF1/FOR1濃度設(shè)定 0.16、0.20和0.24 μmol·L-13個(gè)梯度，引物VActF/VActR濃度設(shè)定0.24、0.28和 0.32 μmol·L-13個(gè)梯度；3個(gè)延伸時(shí)間分別設(shè)為30 s、45 s、1 min；3個(gè)循環(huán)次數(shù)分別設(shè)為30、35、40次。

PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用 Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相。結(jié)果按照病原菌擴(kuò)增的特異性和敏感性，即條帶的強(qiáng)弱、雜帶的有無(wú)等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.5 陽(yáng)性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序及分析

對(duì)陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，并在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，以驗(yàn)證PCR的特異性。

1.6 三重PCR反應(yīng)特異性檢測(cè)

選取瓜果腐霉、尖鐮孢、大麗輪枝菌基因組DNA等量混合均勻，分別以辣椒疫霉、立枯絲核菌、核盤(pán)菌等16株蔬菜土傳病原菌基因組DNA為對(duì)照，利用優(yōu)化好的三重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行三重PCR檢測(cè)，檢驗(yàn)該體系的特異性。

表2 供試引物Table 2 The primers used in the test

1.7 三重PCR反應(yīng)靈敏度檢測(cè)

將瓜果腐霉、尖鐮孢、大麗輪枝菌基因組 DNA模板濃度設(shè)置為 10、1、10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5ng·μL-1，使用優(yōu)化后的三重 PCR反應(yīng)條件進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相。分別檢測(cè)單一病原菌及混合病原菌的反應(yīng)靈敏度。

1.8 三重PCR檢測(cè)體系的穩(wěn)定性

為檢驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，分別使用北京博邁德生物技術(shù)有限公司的2×Taq Master PCR Mix和大連寶生物工程有限公司的TaKaRa Taq酶進(jìn)行三重 PCR 反應(yīng)。其中 TaKaRa Taq（5 units/μL）0.125 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture（各 2.5 mmol·L-1）2 μL，其他條件相同。兩種反應(yīng)體系均分別使用 AerisTM型（新加坡藝思高科技有限公司）和C1000 TouchTM型（賽默飛世爾科技有限公司）的熱循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增[22]。

1.9 人工模擬接種基質(zhì)中病原菌的檢測(cè)

1.9.1 人工模擬帶菌基質(zhì)制備 將瓜果腐霉、尖鐮孢、大麗輪枝菌菌株分別接種于OA和PDA平板，25℃恒溫培養(yǎng)10 d，收集瓜果腐霉菌絲，稱重，制成終濃度為10 mg·mL-1的菌絲懸液，10倍梯度稀釋，將100 mL菌懸液加入到100 g無(wú)菌基質(zhì)中，分別制備成濃度為 10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mg·g-1的模擬帶菌基質(zhì)[23]。用滅菌刷刷下尖鐮孢和大麗輪枝菌平板上的孢子，分別配成濃度為106個(gè)孢子/mL懸浮液，10倍梯度稀釋。將 100 mL菌懸液加入到100 g無(wú)菌基質(zhì)中，分別制備成濃度為108、107、106、105、104、103、102個(gè)孢子/mL的模擬帶菌基質(zhì)。將分別帶有 3種病原菌的基質(zhì)等比混合制成混合帶菌基質(zhì)。在每100 g模擬帶菌土中隨機(jī)抽取1 g土樣，冷凍干燥備用[24]。

1.9.2 帶菌基質(zhì)中 DNA的提取 采用 Fast DNA SPIN Kit for Soil（美國(guó)MP Biomedicals土壤基因組DNA提取試劑盒）對(duì)基質(zhì)進(jìn)行基因組DNA的提取，-20℃保存。

1.9.3 三重 PCR檢測(cè)人工模擬帶菌基質(zhì) 以不同濃度模擬帶菌基質(zhì)總DNA為模板，使用優(yōu)化的三重PCR方法檢測(cè)模擬的帶菌基質(zhì)，確定該引物對(duì)基質(zhì)中病原菌分生孢子的檢測(cè)靈敏度。

1.10 三重PCR體系的應(yīng)用

田間采集根腐病、枯萎病及黃萎病病害根莖樣本35份，土壤樣本149份，其中根圍土壤取自距發(fā)病植株根圍2 mm，深5—10 cm的土壤，過(guò)篩去除雜物，取0.5 g根圍土壤提取基因組DNA，提取病組織和根圍土壤基因組DNA，并采用優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，以驗(yàn)證該三重PCR檢測(cè)體系。

2 結(jié)果

2.1 三重PCR反應(yīng)體系的建立

通過(guò)對(duì)退火溫度、引物濃度組合、延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化，最終確定三重PCR反應(yīng)體系（總體積為 25 μL）：2×Taq Master PCR Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的引 物 AsAPH2B/AsPyF、FOF1/FOR1、VActF/VActR 分別為 0.3、0.4、0.6 μL，模板各 1 μL，補(bǔ)加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60.8℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min（圖1）。

2.2 陽(yáng)性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序及分析

采用優(yōu)化后的三重PCR檢測(cè)體系對(duì)瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序后，通過(guò)GenBank上BLAST比對(duì)，同源性均達(dá)到99%，因此確定擴(kuò)增產(chǎn)物均為目標(biāo)菌株（表3）。

圖1 三重PCR退火溫度優(yōu)化Fig. 1 Optimization of the annealing temperature for triplex PCR

表3 擴(kuò)增產(chǎn)物比對(duì)結(jié)果Table 3 The results of PCR products

2.3 三重PCR反應(yīng)特異性檢測(cè)

按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件，引物AsAPH2B/AsPyF、FOF1/FOR1和VActF/VActR同時(shí)擴(kuò)增出瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌的基因組 DNA，獲得 163、328和530 bp的特異條帶，而其他蔬菜病原菌都沒(méi)有特異條帶（圖2）。

圖2 三重PCR特異性檢測(cè)Fig. 2 The specific detection of triplex PCR

2.4 三重PCR檢測(cè)體系的靈敏度

三重PCR體系中，3對(duì)引物擴(kuò)增單個(gè)模板能夠檢測(cè)到 10-2ng·μL-1的瓜果腐霉、尖鐮孢和 10-1ng·μL-1大麗輪枝菌基因組DNA，同時(shí)擴(kuò)增3個(gè)模板的靈敏度為 10-1ng·μL-1（圖 3、圖 4）。

圖3 三重PCR檢測(cè)單一病原菌的靈敏度Fig. 3 The sensitivity of triplex PCR for detection of DNA from a single pathogen

圖4 三重PCR檢測(cè)靈敏度Fig. 4 The sensitivity of triplex PCR detection

2.5 三重PCR檢測(cè)體系的穩(wěn)定性

采用大連寶生物工程有限公司和北京博邁德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Taq酶，PCR儀采用賽默飛世爾科技有限公司的C1000 TouchTM和新加坡藝思高科技有限公司的AerisTM熱循環(huán)儀，以3種病原菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行三重PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，均可以擴(kuò)增出3種病原菌的特異性目的片段（圖5）。因此，所建立的三重PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定，可用于瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌的快速診斷。

圖5 三重PCR體系穩(wěn)定性檢測(cè)Fig. 5 The stability detection of triplex PCR system

2.6 人工模擬接種基質(zhì)檢測(cè)

利用三重PCR方法對(duì)瓜果腐霉模擬帶菌基質(zhì)、尖鐮孢模擬帶菌基質(zhì)、大麗輪枝菌模擬帶菌基質(zhì)、混合帶菌基質(zhì)和未加菌基質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)瓜果腐霉的檢測(cè)靈敏度為10-2mg菌絲/g，尖鐮孢檢測(cè)靈敏度為106個(gè)孢子/g，大麗輪枝菌的檢測(cè)靈敏度為105個(gè)孢子/g；混合體系下對(duì)于尖鐮孢和大麗輪枝菌的檢測(cè)靈敏度為106個(gè)孢子/g，對(duì)瓜果腐霉的靈敏度是10-2mg菌絲/g；而未加菌的基質(zhì)DNA中未檢測(cè)到（圖6）。因此，所建立的三重PCR反應(yīng)體系可應(yīng)用于基質(zhì)中瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌的檢測(cè)。

圖6 模擬帶菌基質(zhì)三重PCR檢測(cè)靈敏度Fig. 6 Sensitivity of triplex PCR detection in artificially inoculated substrate

2.7 三重PCR體系的應(yīng)用

分別從35份病組織和149份土壤中提取基因組DNA，進(jìn)行三重PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示4份病組織中檢測(cè)到大麗輪枝菌，3份病組織中檢測(cè)到瓜果腐霉，18份病組織中檢測(cè)到尖鐮孢，10份病組織中未檢測(cè)到目標(biāo)菌，病菌檢出率為71.43%，檢測(cè)結(jié)果與病害癥狀及分離培養(yǎng)結(jié)果吻合；在土壤檢測(cè)中19份土壤檢測(cè)到大麗輪枝菌，22份土壤檢測(cè)到尖鐮孢，30份土壤檢測(cè)到瓜果腐霉，78份土壤中未檢測(cè)到目標(biāo)菌，檢測(cè)結(jié)果與分離培養(yǎng)結(jié)果吻合（表 4）。由此可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)蔬菜病組織及其根圍土壤進(jìn)行三重PCR檢測(cè)，可進(jìn)行田間蔬菜瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌的快速診斷。

表4 不同地區(qū)病害樣本三重PCR檢測(cè)Table 4 Identification of diseases samples in different areas by triplex PCR

3 討論

我國(guó)蔬菜生產(chǎn)種苗需求量超過(guò)6 800億株/年，育苗基質(zhì)需求量大[25]，由于育苗基質(zhì)原料來(lái)源復(fù)雜，基質(zhì)生產(chǎn)未能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，由基質(zhì)帶菌引起的蔬菜土傳病害大面積發(fā)生問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2015年渭南市大荔、臨渭等西瓜產(chǎn)區(qū)種植戶使用育苗基質(zhì)培育西瓜苗后造成80%以上秧苗葉片發(fā)黃、根莖 部 腐 爛 （ http：//bbs.hsw.cn/read-htm-tid-7334210-displayMode-1.html）；2017年8月，河南省崇召村菜農(nóng)購(gòu)買(mǎi)的育苗基質(zhì)帶菌，造成白菜、西蘭花等蔬菜葉片大面積發(fā)黃、枯萎（http：//www.cfvin.com/n/2017/08/24/164307287466.shtml）。因此，為防止基質(zhì)帶菌引起土傳病害發(fā)生和傳播，基質(zhì)出廠前的帶菌檢測(cè)非常重要。目前國(guó)內(nèi)對(duì)蔬菜土傳病原菌的多重PCR體系報(bào)道較少，大多為在植株發(fā)病后根據(jù)病情對(duì)相應(yīng)的病原菌進(jìn)行普通PCR檢測(cè)，但此種方法不能提前發(fā)現(xiàn)基質(zhì)中的病原菌，具有滯后性，且每次只能檢測(cè)一種病原菌，而病原菌復(fù)合侵染情況在田間普遍存在，因此能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原菌的多重 PCR技術(shù)具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

多重PCR是在同一PCR體系里加入多對(duì)特異性引物，體系復(fù)雜，因素影響多，所以多重PCR反應(yīng)體系建立較難。其中引物的選擇直接影響PCR擴(kuò)增的特異性與靈敏度，同時(shí)要防止引物相互配對(duì)，又要能夠區(qū)分?jǐn)U增片段大小。因此，需要選擇適合長(zhǎng)度的引物序列，從而獲得最優(yōu)的檢測(cè)靈敏度和特異性以及各目標(biāo)片段擴(kuò)增均一性[26-27]。目前國(guó)際上關(guān)于瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌的分子檢測(cè)研究較多[12-17]，但同時(shí)檢測(cè)這3種病原菌的多重PCR尚未見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)多重PCR引物設(shè)計(jì)原則，本研究在參考大量文獻(xiàn)引物的基礎(chǔ)上，通過(guò)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行引物組BLAST比對(duì)，篩選出適用于多重PCR的引物組合，成功建立了對(duì)瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌進(jìn)行檢測(cè)的三重PCR檢測(cè)體系。該體系降低了檢測(cè)過(guò)程的復(fù)雜性和成本，節(jié)省時(shí)間并提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在混合 DNA下檢測(cè)靈敏度為10-1ng·μL-1，與何宛芹等[28]根據(jù)EF-1α基因設(shè)計(jì)引物建立的鐮孢菌四重 PCR檢測(cè)體系靈敏度一致。孫娟等[29]建立了能夠同步檢測(cè)棉花黃萎病菌、枯萎病菌和炭疽病菌的三重 PCR檢測(cè)體系，靈敏度為1.06 ng·μL-1，其靈敏度低于本研究所建立的三重PCR檢測(cè)體系。

另外，本研究建立的三重PCR檢測(cè)體系可用于基質(zhì)中病原菌的檢測(cè)，做到了預(yù)防病害發(fā)生，滿足當(dāng)前生產(chǎn)需要。同時(shí)，克服了土壤檢測(cè)中病原菌含量少、雜質(zhì)多等弊端，每克土壤中含有 106個(gè)孢子即可被檢測(cè)到。土壤微生物總 DNA的富集和提取是該檢測(cè)手段實(shí)際應(yīng)用中的關(guān)鍵問(wèn)題，仍需進(jìn)一步深入研究。本研究建立的三重 PCR體系可以在早期準(zhǔn)確地檢測(cè)出田間蔬菜病株根圍土壤中的瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌，在病害潛伏期和發(fā)病初期就能對(duì)3種病害進(jìn)行快速診斷，從而有效預(yù)防和控制蔬菜病害，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

通過(guò)引物篩選組合和條件優(yōu)化，建立了可同時(shí)檢測(cè)瓜果腐霉、尖鐮孢和大麗輪枝菌3種蔬菜重要病原菌的三重PCR體系。該體系具有靈敏度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)田間病株及其根圍土壤中的瓜果腐霉、尖鐮孢、大麗輪枝菌，為蔬菜土傳病害的早期預(yù)防和流行監(jiān)測(cè)提供了有效的技術(shù)手段。