三七總皂苷對(duì)杠柳毒苷代謝產(chǎn)物杠柳次苷藥代動(dòng)力學(xué)的影響*

李 麗，賈 琪，姚廣哲，歐陽(yáng)慧子，常艷旭，何 俊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

香加皮為臨床常用中藥材，主要用于治療心力衰竭和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其化學(xué)成分主要為強(qiáng)心苷類、C21甾類、萜類，以及脂肪酸類。但是不合理使用后可能引起的惡心、嘔吐、腹瀉、心動(dòng)過(guò)緩等諸多不良反應(yīng)嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。杠柳毒苷與杠柳次苷均為香加皮藥材中的甲型強(qiáng)心苷類成分[1]。杠柳毒苷作為香加皮主要有毒/有效成分，口服后可在體內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，主要存在形式為杠柳次苷[2]。杠柳次苷具有強(qiáng)心、抗腫瘤等作用[3-6]，但同時(shí)也具有比杠柳毒苷更強(qiáng)的細(xì)胞毒性[7]。三七總皂苷是中藥三七的主要藥效物質(zhì)，在維持血液循環(huán)、改善心腦血管、抗炎方面均顯示出一定的藥理作用[8]。研究表明，三七總皂苷與香加皮提取物或杠柳毒苷配伍后，均可降低杠柳毒苷產(chǎn)生的毒副作用[9]。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上[10]，考察了三七總皂苷對(duì)杠柳毒苷代謝產(chǎn)物杠柳次苷在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響，初步揭示了香加皮、三七配伍減毒的作用機(jī)制，為臨床上香加皮、三七的配伍使用提供了理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 杠柳毒苷（批號(hào)：DST170907-041）、杠柳次苷（批號(hào)：DST170918-043）、三七總皂苷（批號(hào)：DST170815，人參皂苷 Rb1、Rd、Re、Rg1 和三七皂苷R1總量≥73.91%）購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司，補(bǔ)骨脂素（批號(hào)：180301-018）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，以上對(duì)照品（除杠柳毒苷外）質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。

乙酸乙酯為分析純（天津康科德科技有限公司），甲醇、乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher公司），色譜級(jí)甲酸（美國(guó)ROE公司），實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 儀器 Agilent6430三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Agilent1200高效液相色譜儀（美國(guó) Agilent公司）；5424R型高速離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司）；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；XPE205型十萬(wàn)分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠（220±30）g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

2.1.1 杠柳次苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取杠柳次苷對(duì)照品9.99 mg，甲醇溶解于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配制成濃度為0.999 mg/mL的儲(chǔ)備液，密封后置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，待用時(shí)用甲醇依次稀釋，配制成杠柳次苷濃度為10~5 000 ng/mL的工作溶液。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取補(bǔ)骨脂素10.01 mg，甲醇溶解于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，制備成濃度為1.001 mg/mL的儲(chǔ)備液，密封后置于4℃冰箱冷藏，待用時(shí)用甲醇稀釋成1μg/mL的內(nèi)標(biāo)（IS）溶液備用。

2.2 血漿樣品中杠柳次苷LC-MS/MS分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 Waters CORTECSTM C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.7μm）；流動(dòng)相：B 為乙腈，A 為0.1%甲酸水；流速0.3 mL/min，梯度洗脫（0~7 min，19%~50%B；7~9 min，50%~50%B）；柱溫為 30 ℃；進(jìn)樣量5μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子檢測(cè)，檢測(cè)模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化器壓力：15 psi。杠柳次苷和補(bǔ)骨脂素的定量離子對(duì)分別為535.3→113.1和187.0→131.1；碎裂電壓分別為135 V和115 V；碰撞能量分別為20 V和25 V。

2.3 給藥方案及血漿樣品處理方法

2.3.1 給藥方案 將18只SD大鼠隨機(jī)分成3組，分別為：杠柳毒苷單獨(dú)給藥組、杠柳毒苷和低劑量三七總皂苷配伍組以及杠柳毒苷和高劑量三七總皂苷配伍組，每組6只。按杠柳毒苷10 mg/（kg·d）、三七總皂苷0.74 g/（kg·d）和2.22 g/（kg·d）（分別相當(dāng)于香加皮與三七的配伍比例為1∶1和1∶3）的劑量灌胃給藥，分別給予杠柳毒苷和杠柳毒苷—三七總皂苷配伍溶液，連續(xù)給藥7 d。在給藥7 d后0、0.033、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h自大鼠眼眶靜脈叢采血0.25 mL，置于肝素化管中，以7 000 r/min，4℃離心，取上清得血漿，置于-70℃冰箱凍存。

2.3.2 血漿樣品處理方法 精密吸取血漿樣品100μL，定量加入內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素（1μg/mL）20μL、甲醇20μL，渦旋1 min后，加入乙酸乙酯2 mL，渦旋5 min，離心 10 min（14 000 r/min）后，定量吸取上清液2 mL置于EP管中，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)尤?0%甲醇 100 μL，渦旋 3 min，離心 10 min（14 000 r/min），取上清液在“2.2”條件下進(jìn)行測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取大鼠空白血漿100μL（不加對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)）、空白血漿100μL加入杠柳次苷對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液、含藥血漿，按“2.3.2”項(xiàng)下處理，在2.2條件下測(cè)定，杠柳次苷和補(bǔ)骨脂素的保留時(shí)間分別是6.66 min和4.31 min，與血漿中內(nèi)源性成分均能得到良好的分離，其他成分均無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 取“2.1”項(xiàng)下制得的不同濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入到大鼠空白血漿中，按“2.3.2”項(xiàng)下的血漿樣品處理方法進(jìn)行處理，配制成含杠柳次苷濃度分別為 2、4、10、20、50、200、800、1 000 ng/mL 的血漿樣品，在“2.2”條件下進(jìn)行測(cè)定。以杠柳次苷的濃度（X）為橫坐標(biāo)，杠柳次苷與補(bǔ)骨脂素的峰面積比值（Y?）為縱坐標(biāo)進(jìn)行加權(quán)最小二乘法回歸，獲得杠柳次苷的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（Y?=0.179 249X+0.000 798 268 5，r=0.998 9）（權(quán)重系數(shù)為1/X），線性范圍為2~1 000 ng/mL，最低定量限為 0.5 ng/mL（S/N≥10）。

圖1 大鼠血漿中杠柳次苷（1）和內(nèi)標(biāo)（2）的MRM圖Fig.1 Extraction MRM chromatograms of periplocymarin（1）and IS（2）in plasma

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度 依據(jù)杠柳次苷的線性范圍，取“2.1”項(xiàng)下制得的不同濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入到大鼠空白血漿中，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，配制成含杠柳次苷終濃度為4、50和800 ng/mL的低、中、高3種濃度的質(zhì)控樣品，3種溶液各6份，在“2.2”條件下連續(xù)測(cè)定3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，記錄杠柳次苷在不同質(zhì)控水平下的濃度，求得方法的日內(nèi)精密度、日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 杠柳次苷在大鼠血漿中的精密度及準(zhǔn)確度Tab.1 Intra-day and inter-day precisions and accuracies of periplocymarin in rat plasma

2.4.4 回收率及基質(zhì)效應(yīng) 按照“2.3.2”項(xiàng)下方法配制杠柳次苷終濃度為4、50和800 ng/mL的質(zhì)控樣品各6份，在“2.2”條件下進(jìn)行分析測(cè)定，得到樣品峰面積（A1）后，將甲醇質(zhì)控樣品按照“2.3.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行處理后，在殘?jiān)屑尤?00μL相應(yīng)低、中、高3個(gè)濃度的杠柳次苷對(duì)照品溶液，在“2.2”條件下進(jìn)行分析測(cè)定，得到峰面積（A2），則提取回收率計(jì)算公式為R=A1/A2×100%；在“2.2”條件下測(cè)定相應(yīng)3個(gè)濃度的杠柳次苷對(duì)照品溶液，得到峰面積（A0）后，依據(jù)基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式M=A2/A0可得杠柳次苷對(duì)照品溶液的基質(zhì)效應(yīng)；內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算方法同上。結(jié)果表明各成分的回收率及基質(zhì)效應(yīng)符合生物樣品分析要求，見(jiàn)表2。

表2 杠柳次苷和內(nèi)標(biāo)補(bǔ)骨脂素在大鼠血漿中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)Tab.2 Recoveries and matrix effects of periplocymarin and IS in rat plasma

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取100μL空白血漿，按“2.3.2”項(xiàng)下方法配制杠柳次苷終濃度為4、50和800 ng/mL 3種濃度的質(zhì)控樣品，考察其在室溫下放置6 h再處理、-20℃反復(fù)凍融3次、血漿樣品處理后放置自動(dòng)進(jìn)樣器12 h和-70℃冰箱中冷凍14 d的穩(wěn)定性，血漿處理后按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，得到杠柳次苷RSD范圍為1.14%～11.12%。表明其穩(wěn)定性符合生物樣品分析要求，見(jiàn)表3。

2.5 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 對(duì)A、B、C 3組血漿樣品中杠柳次苷的血藥濃度進(jìn)行LC-MS/MS分析測(cè)定，得到杠柳次苷的平均血藥濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖2。將測(cè)得的各時(shí)間點(diǎn)的杠柳次苷血藥濃度以DAS 1.0軟件進(jìn)行處理，杠柳次苷在大鼠體內(nèi)的各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，得到A、B、C 3組間的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異。

3 結(jié)果與討論

對(duì)比分析3個(gè)給藥組中杠柳毒苷代謝產(chǎn)物杠柳次苷的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可以看出：杠柳毒苷和三七總皂苷配伍后，配伍組中杠柳次苷的藥代動(dòng)力學(xué)行為發(fā)生了明顯變化，具體表現(xiàn)為：配伍后杠柳次苷的Cmax較配伍前顯著降低（P＜0.05），而 Tmax則顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)高劑量三七總皂苷配伍后杠柳次苷的AUC0-t和 AUC0-∞較配伍前顯著降低（P＜0.01）。

表3 杠柳次苷在不同條件下的穩(wěn)定性Tab.3 Stability of periplocymarin in rat plasma

表4 不同組大鼠灌胃給藥后杠柳次苷的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of periplocymarin in different groups

圖2 大鼠灌胃給藥后血漿中杠柳次苷的藥-時(shí)曲線（x±s，n=6）Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of periplocymarin in rats after oral administration（x±s，n=6）

本課題組前期研究表明，隨著三七總皂苷配伍比例的增大，杠柳毒苷的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t和AUC0-∞值呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)[10]。據(jù)此分析，三七總皂苷可能通過(guò)影響杠柳毒苷在大鼠體內(nèi)的代謝，從而使其代謝產(chǎn)物杠柳次苷的藥代動(dòng)力學(xué)行為發(fā)生改變。