不同絕經時期婦女雌激素受體亞型在陰道組織中的表達*

蘇 婷 ，宋殿榮，郭 潔 ，張 崴 ，陳然然

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

隨著人類平均壽命的延長，絕經人口比例日益增加，絕經問題日趨凸顯，絕經綜合征是絕經相關的最常見疾病，涉及人體多個系統(tǒng)、多個器官，其癥狀表現(xiàn)多樣[1]。雌激素缺乏在許多癥狀的病因學中起主要作用，從而導致了許多慢性和老化性的疾病如骨質疏松癥、心血管疾病和泌尿生殖道萎縮。在陰道組織中雌激素缺乏導致陰道黏膜萎縮，陰道上皮變薄，皺褶消失，陰道潤滑作用下降[2-3]。雌激素通過雌激素受體（ER）發(fā)揮生物學作用，以前的研究已經證明在陰道壁中存在ER，但對ER在陰道組織中的表達情況國內外存在爭議。

在組織中ER的表達水平不同，組織對雌激素的反應可能不同，了解受體亞型的表達水平可以更好地理解雌激素對泌尿生殖道的作用，并可針對特定的亞型治療泌尿生殖道疾病。因此，本研究擬探討不同絕經時期婦女ER亞型在陰道組織中的表達，為絕經泌尿生殖道疾病的治療提供基礎證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年11月—2017年11月天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院婦科因良性疾病行陰式或腹式全子宮切除術的61例患者納入本研究，分為育齡期（月經周期規(guī)律）24例、圍絕經期（月經周期長度可變性持續(xù)增加，近10個月經周期中反復出現(xiàn)相鄰周期提前或延后≥7 d，或月經周期間隔>60 d）18例，絕經后期（末次月經后停經≥12個月）19例，所有研究對象術前半年內未服用過類固醇激素類藥物。本研究經天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準并取得患者及家屬知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 每例樣本取足夠的陰道壁組織，沿前穹窿環(huán)向取陰道前壁全層組織2份，大小均為0.8×0.8×0.8 cm3；一份用 4%多聚甲醛固定 24~48 h，常規(guī)石蠟包埋待檢，另一份立即放入RNAlater后轉運到實驗室置-80℃冰箱凍存用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）分析標本。

1.2.2 qPCR檢測陰道組織中ERα、ERβmRNA表達 用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度及純度，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，High-capacity cDNAreverse transcription kits（invitrogen）將 RNA 逆轉錄為模板 cDNA，應用熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD）進行PCR擴增（SYBR Green MIX購自DBI公司）目的基因，實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及其產物長度見表1。

表1 qPCR引物序列及產物長度Tab.1 qPCR primer sequences and product length

1.2.3 免疫組化法（IHC）檢測陰道組織中ERα、ERβ蛋白表達 將1.2.1中獲得的陰道壁組織石蠟包埋后切片，厚度約3~5μm，將組織切片附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃烘烤過夜；二甲苯脫蠟，1%甲醇雙氧水滅活內源性過氧化物酶，將切片浸泡在0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中，放入微波爐內高火熱修復抗原10 min；0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次×5 min，切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置20 min，滴加第一抗體（所有抗體均購自英國Abcam公司），4℃過夜，PBS洗 3次×5 min，滴加第二抗體，37℃，20 min，PBS洗3次×5 min，DAB顯色，蘇木素復染細胞核1 min，將IHC染色切片置于顯微鏡100、400倍下觀察，陽性染色為細胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒。隨機選取每張切片中的5個視野，每個視野中各計數(shù)100個細胞，計算陽性率。參考Soslow等[4]文獻進行評分，評分標準：1）陽性細胞百分比對應的值：陽性細胞數(shù)0為0分，1%~10%為1分，11%~50%為2分，51%~80%為3分，81%~100%為4分。2）陽性細胞顯色強度分級0為陰性，1為弱陽性，2為陽性，3為強陽性。IHS=陽性細胞顯色強度×陽性細胞百分比對應值。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用SNK法。以α=0.05為檢驗標準，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qPCR檢測陰道組織中ERα、ERβmRNA表達 qPCR結果分析，與育齡期組相比，圍絕經期和絕經后婦女陰道組織中ERαmRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同時絕經后婦女陰道組織中ERαmRNA表達低于圍絕經期組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與育齡期組相比，圍絕經期和絕經后婦女陰道組織中ERβmRNA表達高于育齡期組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同時絕經后婦女陰道組織中ERβmRNA表達高于圍絕經期組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 ERα、ERβmRNA相對定量qPCR結果（x±s）Tab.2 Relative quantitative qPCR results of ERαand ERβ mRNA（x±s）

2.2 檢測陰道組織中ERα、ERβ蛋白表達 IHC結果分析，ERα和ERβ兩種受體均表達于細胞核，呈棕黃色顆粒，見圖1。與育齡期組相比，圍絕經期和絕經后婦女陰道組織中ERα蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同時絕經后婦女陰道組織中ERα蛋白表達低于圍絕經期組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與育齡期組相比，圍絕經期和絕經后婦女陰道組織中ERβ蛋白表達高于育齡期組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同時絕經后婦女陰道組織中ERβ蛋白表達高于圍絕經期組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

雌激素是女性重要的生殖激素，雌激素生物學作用的發(fā)揮需要特異性、高親和力的ER介導[5-7]，在人類細胞中已經發(fā)現(xiàn)了兩種經典的ER亞型，即ERα和ERβ。研究表明[8-9]，ERα和ERβ具有幾乎相同的DNA結合域，但其配體結合結構域表現(xiàn)出很大的差異，并且兩者在參與靶基因啟動子轉錄的N-末端區(qū)域也有很大差異，導致兩種受體與化合物的親和力不同，表現(xiàn)出轉錄活性不同，不同組織中兩種受體亞型的表達水平不同，因此不同的ER配體組織選擇性作用不同。

關于不同絕經時期陰道組織中ERα、ERβ的分布及含量變化，兩種受體亞型介導雌激素生物效應的作用差異研究結果不一致。如Chen等[10]發(fā)現(xiàn)ERα和ERβ均存在于絕經前婦女的陰道壁組織中，但絕經后婦女陰道壁中ERβ的表達缺失。Perez等[11]發(fā)現(xiàn)，絕經后陰道組織中ER與血清中雌激素呈負相關，但ER與絕經的時間表現(xiàn)出明顯的相關性，隨著絕經時間的延長，ER在逐漸增加。Skala等[12]研究ERα、ERβ在陰道壁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)ERα在絕經后明顯升高，ERβ在絕經后明顯降低。Fu等[13]研究表明，絕經后婦女陰道壁組織中ERα的表達水平顯著下降，激素替代療法治療后能明顯升高ERα的表達，無論有無激素替代治療ERβ的表達水平在絕經前后未見明顯變化。

圖1 ERα、ERβ免疫組化染色結果Fig.1 Result of ERαand ERβimmunohistochemical staining

表3 ERα、ERβ蛋白IHS結果（x±s）Tab.3 r ESULTS of ERα，ERβ protein IHS（x±s）

而本研究結果表明，ERα和ERβ在育齡期、圍絕經期和絕經后婦女陰道組織中均有表達，但表現(xiàn)出不同的表達模式，圍絕經期及絕經后婦女陰道組織中ERα的表達水平較育齡期婦女顯著下降，而且隨著年齡的增長及絕經年限的延長，絕經后婦女陰道組織中ERα的表達水平較圍絕經期婦女顯著下降，但圍絕經期及絕經后婦女陰道組織中ERβ的表達水平較育齡期婦女顯著升高，而且絕經后婦女陰道組織中ERβ的表達水平高于圍絕經期，說明絕經影響陰道組織中ER的表達。本研究結果與Fu等人研究基本一致，ERα在所有婦女的陰道壁組織中均有表達，絕經后ERα的表達降低且與絕經時間表現(xiàn)出明顯的相關性，隨著絕經時間延長，ERα的表達大幅度下降；Fu等研究表明，ERβ在絕經前后均有表達，但表達未見明顯差異，本研究也證明ERβ在絕經前后婦女陰道組織中有表達，然而，表達似乎受到絕經的影響。上述研究結果不一致的原因考慮與年齡、絕經年限、研究方法有關，正如Ewies等[14]描述不同絕經時期和陰道脫垂均影響陰道組織中ER的表達。

本實驗揭示了不同絕經時期患者陰道組織中ERα和ERβ的表達形式不同，說明兩者在介導雌激素作用方面有不同的功能，是造成雌激素作用的組織特異性的物質基礎，了解不同絕經狀態(tài)患者陰道組織中ER的表達變化，可針對特定的受體亞型治療絕經后婦女泌尿生殖道疾患，為絕經后婦女泌尿生殖道疾患的雌激素治療提供實驗依據(jù)。