利用小RNA測序技術(shù)檢測貴州西番蓮病毒

嚴(yán)佳文 袁啟鳳 解璞 王立娟 馬玉華 王正媛

摘 ?要 ?病毒病害是西番蓮重要病害之一，明確病毒種類可為病害防治提供理論依據(jù)。本研究應(yīng)用小RNA測序技術(shù)對(duì)6份疑似病毒侵染的西番蓮葉片樣本進(jìn)行病毒種類鑒定，發(fā)現(xiàn)混合樣本中含有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和夜來香花葉病毒（Telosma mosaic virus， TeMV）。應(yīng)用RT-PCR分別擴(kuò)增6份樣本中2種病毒的外殼蛋白（coat protein， CP）基因序列，進(jìn)一步證實(shí)6份樣本中均含有CMV和TeMV。CMV的CP基因開放閱讀框大小為657 bp，與已報(bào)道的其他分離物的一致性為82.3%～95.9%;TeMV的CP基因開放閱讀框?yàn)?16 bp，與其他分離物的一致性分別為87.8%～99.3%和87.8%～98.3%。上述結(jié)果表明，貴州西番蓮中的病毒是CMV和TeMV的分離物，分別命名為CMV-GZ（CP基因登錄號(hào)為MH623077）、TeMV-GZ1（MH623078）和TeMV-GZ2（MH623079）。

關(guān)鍵詞 ?西番蓮;病毒;小RNA測序;鑒定

中圖分類號(hào) ?S436.67 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?Virus disease is one of the main diseases of Passiflora edulis， and the identification of virus species can provide a theoretical basis for the disease prevention. In this study， six suspected virus-infected leaf samples were mixed and analyzed by small RNA deep sequencing. Cucumber mosaic virus （CMV） and Telosma mosaic virus （TeMV） were detected from the mixed sample. Viruses identified by small RNA sequencing were validated by virus coat protein gene （CP） specific RT-PCR from the above six samples. CMV and TeMV was detected from all six samples， respectively. The open reading frame of CP gene of CMV and TeMV obtained by RT-PCR was 657 bp and 816 bp， correspondingly. The nucleotide sequence identity of CMV-GZ （accession number： MH623077）， TeMV-GZ1 （accession number： MH623078） and TeMV-GZ2 （accession number： MH623079） was 82.3%95.9%， 87.8%99.3% and 87.8%98.3%， respectively， with the reported CMV and TeMV isolates. CMV and TeMV in P. edulis was first reported Guizhou. The combined infection of the two viruses may be a potential threat to P. edulis.

Keywords ?Passiflora edulis; virus; small RNA sequencing; identification

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.018

西番蓮（Passiflora spp.）是西番蓮科（Passifl oraceae）西番蓮屬（Passiflora）果樹，原產(chǎn)于南美洲，約有530個(gè)種和400多個(gè)人工雜種，其中可食用的有80余種[1-2]。西番蓮兼具食用和藥用價(jià)值，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義[3]。我國早在1901年就引種西番蓮，目前在臺(tái)灣、廣東、海南、福建、貴州、廣西、云南和四川等省區(qū)廣泛種植[4]。近年來，西番蓮種植面積迅速擴(kuò)大，各省區(qū)之間引種、苗木銷售活動(dòng)頻繁，一定程度上加速了各種病害的傳播和蔓延[5]。病毒病害嚴(yán)重影響西番蓮的產(chǎn)量和品質(zhì)，是產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要限制因素之一[6]。

國內(nèi)外已報(bào)道了26種侵染西番蓮的病毒，包括馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）、菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）、香石竹潛隱病毒屬（Carl avirus）、黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）、蕪菁黃花葉病毒屬（Tymovirus）、柑橘粗糙病毒屬（Cilevirus）、煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）、線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）等[5]。我國主要有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、東亞西番蓮病毒（East Asian Passiflora virus， EAPV）、西番蓮斑駁病毒（Passion fruit mottle virus， PaMV）、廣東番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl Guangdong virus， PaLCuGdV）、大戟曲葉病毒（Euphorbia leaf curl virus， EuLCV）和夜來香花葉病毒（Telosma mosaic virus， TeMV）[6-9]。國內(nèi)西番蓮病毒病害主要發(fā)生在臺(tái)灣、福建、海南和廣東等省區(qū)[5]，貴州暫未見西番蓮病毒病相關(guān)報(bào)道。筆者通過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)貴州各個(gè)主產(chǎn)區(qū)均有疑似病毒病侵染的植株，部分果園尤為明顯。鑒定侵染貴州西番蓮病毒種類，對(duì)于病害防控具有重要意義。

目前已經(jīng)報(bào)道的西番蓮病毒鑒定方法主要有生物學(xué)檢測、電子顯微鏡檢測、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等[5]。這些方法在植物病毒鑒定方面均得以成功應(yīng)用，卻也存在一定的局限性。與逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）等傳統(tǒng)分子生物學(xué)檢測方法相比，小RNA測序技術(shù)（small RNA sequencing， sRNA-seq）不僅可以同時(shí)鑒定多種DNA或RNA病毒，還能發(fā)掘新病毒或新分離物，已被廣泛應(yīng)于各種植物病毒鑒定[10-15]。本研究應(yīng)用小RNA測序技術(shù)分析了貴州省疑似病毒侵染的西番蓮樣本，結(jié)合RT-PCR驗(yàn)證了鑒定結(jié)果，克隆了病毒外殼蛋白（coat protein， CP）基因開放閱讀框序列，并對(duì)所鑒定病毒的不同分離物進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，為貴州西番蓮病毒病的防控奠定了基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

2017年10月—2018年7月在貴州貞豐、鎮(zhèn)寧、望謨、羅甸、平塘和從江采集疑似病毒侵染的西番蓮葉片6份，其中采自平塘的西番蓮品種為‘平塘1號(hào)，其他樣本均為‘紫香1號(hào)，樣品信息見表1。以健康西番蓮植株作為陰性對(duì)照。

1.2 ?方法

1.2.1 ?西番蓮總RNA提取 ?采用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）提取6份疑似病毒侵染葉片混合樣品的總RNA，具體方法參照試劑說明書。應(yīng)用Nanodrop 2000檢測總RNA的濃度和純度，Agilent 2100測定RIN值。選取RIN值≥8.0、OD260/280≥1.8、濃度≥50 ng/μL的RNA用于測序文庫構(gòu)建。

1.2.2 ?西番蓮sRNA 測序 ?應(yīng)用Small RNA Sample Pre Kit （Illumina，美國）構(gòu)建文庫，使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，然后使用Agilent 2100對(duì)文庫的插入片段進(jìn)行檢測。庫檢合格后，用HiSeq2000進(jìn)行高通量測序，測序單端讀長為50 nt。sRNA測序委托北京百邁克生物科技有限公司完成。

1.2.3 ?sRNA的拼接和注釋 ?去除原始數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列，保留長度為18～35 nt的序列。應(yīng)用Velvet 1.2軟件對(duì)高質(zhì)量的sRNAs進(jìn)行拼接，獲得一系列contigs。將上述contigs在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn和BLASTx比對(duì)，得到可能存在的病毒序列并進(jìn)行分類和注釋，確定樣本中可能存在的病毒種類。

1.2.4 ?病毒RT-PCR驗(yàn)證 ?根據(jù)拼接得到的病毒核酸序列設(shè)計(jì)CMV和TeMV的特異引物（表2），用于RT-PCR檢測。分別以6份疑似病毒侵染的西番蓮葉片總RNA為模板，合成cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：總RNA 2?μg，5×M-MLV buffer 4?μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega，美國）40 U，10?μmol/μL隨機(jī)六聚體引物2?μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNA酶抑制劑20 U，以無RNA酶的去離子水補(bǔ)充體積至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7?℃孵育1 h，70?℃滅活10 min后備用。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L的dNTPs 2 μL、2.5 μmol/L的上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 U，cDNA 2 μL，去離子水補(bǔ)充體積至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4?℃預(yù)變性3 min;94?℃變性30 s，復(fù)性30?s（退火溫度見表1），72?℃延伸90 s，35次循環(huán)，最后72?℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，純化、克隆并測序。TA克隆及陽性克隆篩選方法參照pGM-T連接克隆試劑盒 （天根生化科技有限公司，北京），隨機(jī)選擇5個(gè)陽性克隆送上海生工測序。獲得的序列應(yīng)用DNAMAN 8進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.5 ?病毒CP基因克隆及系統(tǒng)發(fā)育分析 ?根據(jù)拼接得到的病毒核酸序列設(shè)計(jì)CMV和TeMV的CP基因開放閱讀框（open reading frame， ORF）擴(kuò)增引物（表2），用于CP基因克隆。PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物克隆測序方法參照1.2.4。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已經(jīng)報(bào)道的侵染西番蓮的CMV以及侵染西番蓮等植物的TeMV的CP基因序列，應(yīng)用MEGA 7.0對(duì)兩種病毒不同分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)，設(shè)置自展值為1000，以Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?西番蓮sRNA測序結(jié)果分析

經(jīng)檢測，西番蓮總RNA濃度為422?ng/μL，OD260/280為8.4，總量為9.7?μg，完全符合sRNA測序要求。sRNA測序獲得28 964 784個(gè)reads，除去接頭和低質(zhì)序列后得到了25?994?547個(gè)clean reads，占reads總數(shù)的89.76%。sRNA長度為18～35?nt，其中長度為21 nt的數(shù)量最多，高達(dá)117 303個(gè)，其次是22 nt（92 920個(gè)）、20 nt （60?100個(gè)）和19 nt（38 724個(gè)），25～35 nt的sRNA較少，總和為27 940個(gè)（圖1）。

序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，183個(gè)contig可以比對(duì)到2種病毒序列，其中69個(gè)contig可比對(duì)到CMV序列，同源性為90%～ 100%;114個(gè)contig可以比對(duì)到TeMV序列，同源性為65%～93%。以CMV和TeMV基因組序列為參照，將所有contig組裝成4段核酸序列，其中3段序列與CMV的RNA1、RNA2和RNA3全長的覆蓋率分別為85.6%、86.1%和72.5%;1段序列與TeMV基因組的覆蓋率為63.3%（表3）。sRNA序列分析結(jié)果表明，6份混合樣本中可能存在CMV和TeMV。

2.3 ?RT-PCR分析

為驗(yàn)證sRNA注釋結(jié)果的可靠性，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)了CMV和TeMV的特異性引物，分別對(duì)6份樣本進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，所有樣品均擴(kuò)增到2種病毒的核酸片段，大小分別為506 bp和398 bp，與預(yù)期大小一致（圖2）。

將PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)：6個(gè)樣本的CMV擴(kuò)增產(chǎn)物序列完全一致，該序列與侵染香蕉（Musanana）的CMV分離物HS-5（KT302188）的CP基因序列一致性為98%，將侵染貴州西番蓮的CMV命名為CMV-GZ;樣本PT的TeMV擴(kuò)增產(chǎn)物序列與廣西分離物GX1（KJ789129）的CP基因序列一致性最高為99%，將該侵染貴州西番蓮的TeMV命名為TeMV-GZ1;樣本ZF、ZN、WM、LD和CJ的TeMV擴(kuò)增產(chǎn)物得到2種核酸序列，其中一種與樣本PT的擴(kuò)增序列完全一致，另一種與GX1的CP基因序列一致性為94%，將此分離物命名為TeMV-GZ2。以上結(jié)果說明RT-PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，與sRNA拼接及注釋結(jié)果一致。樣本ZF、ZN、WM、LD和CJ中含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2 2種分離物。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序后，分別在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析。其中CMV-GZ（MH623077）的CP基因ORF及其氨基酸序列與侵染胡椒（Piper nigrum）的CMV分離物FT （KU255786）的一致性分別為97.1%和100%，與其他侵染西番蓮的分離物CP基因全序列或部分序列的一致性為82.3%～95.9%，與相應(yīng)氨基酸序列的一致性為97.3%～98.6%（表4）;TeMV-GZ1（MH623078）與TeMV-GZ2（MH623079）的CP基因ORF及其氨基酸序列一致性分別為96.5%和96.7%，兩者與其他TeMV分離物的CP基因全序列或部分序列的一致性分別為87.8%～ 99.3%和87.8%～98.3%，與相應(yīng)氨基酸序列的一致性為88.3%～98.2%和88.3%～96.7%（表5）。

為進(jìn)一步明確CMV-GZ、TeMV-GZ1和TeMV-GZ2與已經(jīng)報(bào)道的CMV和TeMV分離物的進(jìn)化關(guān)系，分別以花生矮縮病毒（Peanut stunt virus， PSV， KM823528）和大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus， SMV， FJ548849）為外組，基于CP基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。侵染西番蓮的CMV分離物分成2支，其中CMV-GZ（MH623077）與巴西的4個(gè)分離物（AF418574， AF418575， AF418576， AF418577）、韓國分離物CMV-KoPF（KR 535 607）、中國福建分離物CMV-xm-pf來自不同國家和地區(qū)的14個(gè)TeMV分離物分成兩個(gè)類群（圖5），來自印度尼西亞的8個(gè)分離物和來自越南的1個(gè)分離物以較高的后驗(yàn)概率聚為一支，本研究獲得的TeMV-GZ1（MH623078）、TeMV-GZ2（MH623079）分離物與廣西分離物GX1（KJ789129）、泰國分離物Pangda12（AM 40 9187Pangda15（AM409188）組成第2大類群，其中分離物GZ1與中國廣西分離物GX1以較高的后驗(yàn)概率（PP=100%）先聚為一個(gè)分支，而后與分離物GZ2和泰國分離物Pangda12和Pangda15進(jìn)一步相聚成簇（圖5）。相同地區(qū)或寄主來源的分離物優(yōu)先相聚成簇，表現(xiàn)出較強(qiáng)的地理和寄主特異性。

3 ?討論

本研究應(yīng)用小RNA測序技術(shù)，從6個(gè)疑似病毒侵染樣品的混合cDNA文庫中檢測到CMV和TeMV兩種病毒，進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。CMV是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員。紫果西番蓮（Passiflora edulis）被CMV侵染后，嫩葉上有明顯黃點(diǎn)或黃斑，頂部新抽出嫩葉卷曲;老葉有褪綠及黃化現(xiàn)象。病株矮化，花、果明顯減少。黃果西番蓮（Passiflora edulis f. flavicarpa）受侵染也呈典型花葉，老葉上有黃化斑點(diǎn)，但病株無明顯矮化現(xiàn)象[16]。TeMV是馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus，PVY）成員之一，侵染西番蓮引起花葉、葉片皺褶和畸形[17]。這兩種病毒侵染西番蓮在貴州省均為首次報(bào)道。

按照國際病毒分類委員會(huì)關(guān)于馬鈴薯Y病毒的劃分標(biāo)準(zhǔn)，即CP基因氨基酸序列一致性低于80%;CP基因或整個(gè)基因組的核苷酸序列一致性低于76%[18]。本研究測定的TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分離物CP基因氨基酸、核苷酸序列與已報(bào)道的TeMV分離物一致性最高分別為99.3%、98.3%和98.2%、96.7%，高于80%、76%標(biāo)準(zhǔn)，與馬鈴薯Y病毒的劃分標(biāo)準(zhǔn)相符。因此，TeMV-GZ1和TeMV-GZ2是TeMV的兩個(gè)分離物。CMV-GZ的CP基因序列與已報(bào)道的其他分離物的一致性為82.3%～95.9%，介于張璇等[19]報(bào)道的77.1%～100.0%之間，由此可以確定CMV-GZ是CMV的一個(gè)分離物。根據(jù)寄主范圍、致病性、血清性分析和CP核酸序列分析等，CMV株系或分離物可分為亞組I、亞組II[20]以及兩者的重組型[21]，其中亞組I進(jìn)一步分為亞組IA和亞組IB。CMV-GZ的CP基因及其氨基酸序列與侵染胡椒的CMV分離物FT（KU255786）CP基因的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為97.1%和100%，CMV-GZ可能與FT同屬于亞組IB[22]。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，6份樣品中均存在兩種病毒，且樣品ZF、ZN、WM、LD和CJ同時(shí)含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分離物。

綜合文獻(xiàn)報(bào)道和NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的病毒序列信息來看，侵染西番蓮的CMV主要分布于澳大利亞、美國、南非、巴西、厄瓜多爾、意大利、中國和韓國[5， 16， 23]，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，意大利分離物單獨(dú)聚為一支，巴西、厄瓜多爾、中國和韓國分離物聚為一支。侵染西番蓮的TeMV僅在泰國和中國有報(bào)道，而TeMV的其他自然寄主植物廣藿香（Pogostemon cablin）和夜來香（Telosma cordata）主要分布于越南、印度尼西亞等南亞國家。侵染西番蓮的CMV分布更為廣泛，遍布全球西番蓮主產(chǎn)區(qū);TeMV可能源于南亞地區(qū)，通過引種或其他途徑傳播到中國。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，西番蓮TeMV的貴州分離物TeMV-GZ1、TeMV-GZ2與廣西分離物GX1的遺傳距離最小，其次是泰國分離物Pangda12和Pangda15。相同地區(qū)或寄主來源的分離物優(yōu)先相聚成簇，表現(xiàn)出較強(qiáng)的地理和寄主特異性，這與謝麗雪等[6]的研究結(jié)果較為一致，該病毒的適應(yīng)性進(jìn)化可能同時(shí)受地域和寄主植物驅(qū)動(dòng)。

參考文獻(xiàn)

Cerqueira-Silva C B M， Concei??o L D H C S， Souza A P， et al. A history of passion fruit woodiness disease with emphasis on the current situation in Brazil and prospects for Brazilian passion fruit cultivation[J]. European Journal of Plant Pathology， 2014， 139： 261-270.

Ocampo J， Arias J C， Urrea R. Interspecific hybridization between cultivated and wild species of genus Passiflora L. [J]. Euphytica， 2016， 209（2）： 395-408.

李莉萍. 西番蓮綜合開發(fā)利用研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（28）： 13840-13843， 13846.

王秀榮， 段安安， 許玉蘭. 國內(nèi)西番蓮引種栽培現(xiàn)狀及改良思路[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2003， 23（2）： 88-91.

嚴(yán)佳文， 袁啟鳳， 彭志軍， 等. 西番蓮病毒病害研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 38（4）： 85-94.

謝麗雪， 張小艷， 鄭 ?姍， 等. 侵染西番蓮的夜來香花葉病毒的分子鑒定及特異性檢測[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， ?50（24）： 4725-4734.

徐平東， 李 ?梅， 柯 ?沖. 福建西番蓮病毒病的發(fā)生及其病原黃瓜花葉病毒亞組鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 1999， 26（1）： 50-54.

Chang C A. Characterizarion and comparation of passion fruit mottle virus， a newly recognized potyvirus， with passion fruit woodiness virus[J]. Phytopathology， 1992， 82（11）： 1358-1363.

Cheng Y H， Deng T C， Chen C C， et al. First report of Euphorbia leaf curl virus and Papaya leaf curl Guangdong virus on passion fruit in Taiwan[J]. Plant Disease， 2014， 98 （12）： 1746.

蘇 ?秀， 徐 ?毅， 陳 ?莎， 等. 利用小RNA深度測序和組裝技術(shù)鑒定紫藤花葉病病原[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2015， 45（1）： 88-92.

王 ?芳， 高正良， 周本國， 等. 利用小RNA高通量測序技術(shù)檢測玉米病毒[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2017， 47（3）： 422-427.

劉華珍， 楊作坤， 周友斌， 等. 侵染梨的蘋果莖痘病毒基因組序列及小RNA分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2017， 47（5）： 584-590.

馮 ?耿， 辛 ?敏， 曹孟籍， 等. 深度測序發(fā)現(xiàn)貴陽發(fā)生的辣椒病毒病由多種病毒復(fù)合侵染所致[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， ?2017， 47（5）： 591-597.

車海彥， 曹學(xué)仁， 劉 ?勇， 等. 利用小RNA深度測序技術(shù)鑒定海南南瓜病毒種類[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2017， 38（11）： ?2106-2111.

于 ?翠， 乾義柯， 于子翔， 等. 利用小RNA深度測序技術(shù)從新疆葡萄上檢出8種病毒[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2018， 45（3）： 649-650.

Fischer I H， Rezende J A M. Diseases of passion flower （Passiflora spp.） [J]. Pest Technology， 2008， 2（1）： 1-19.

Chiemsombat P， Prammanee S， Pipattanawong N. Occurrence of Telosma mosaic virus causing passion fruit severe mosaic disease in Thailand and immunostrip test for rapid virus detection[J]. Crop Protection， 2014， 63（5）： 41-47.

Adams M J， Antoniw J F， Fauquet C M. Molecular criteria for genus and species discrimination within the family Potyviridae[J]. Archives of Virology， 2005， 150（3）： 459-479.

張 ?璇， 趙慧琪， 王德富， 等. 黃瓜花葉病毒（CMV）2個(gè)山西分離物CP序列測定及亞組分類分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2018， 48（1）： 35-45.

Wahyuni W S， Dietzgen R G， Hanada K， et al. Serological and biological variation between and within subgroup I and II strains of cucumber mosaic virus[J]. Plant Pathology， 1992， 41（3）： 282-297.

Maoka T， Hayano Y S， Iwasaki M， et al. Mixed infection in tomato to ensure frequent generation of a natural reassortant between two subgroups of Cucumber mosaic virus[J]. Virus genes， 2010， 40（1）： 148-150.

劉培培， 車海彥， 曹學(xué)仁， 等. 侵染胡椒的黃瓜花葉病毒海南分離物全序列分析及亞組鑒定[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 2016， 7（2）： 265-269.

Parrella G， Sorrentino D. Identification of a cucumber mosaic virus isolate from Passiflora edulis in southern Italy and validation of subgroup identification by In silico restriction fragment length polymorphism[J]. Journal of Phytopathology， 2009， 157： 762-767.