施高翔 姜晶晶 汪云霞 趙婷 邵菁 汪天明 汪長(zhǎng)中,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合研究所；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012)

白念珠菌(Candidaalbicans，C.albicans)是常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病性真菌，常引起皮膚黏膜感染[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，近75%的女性一生中至少感染1次念珠菌，引起外陰陰道念珠菌病(vulvovaginalcandidiasis，VVC)[2-3]。目前，臨床用于治療VVC的抗真菌制劑種類(lèi)有限，且表現(xiàn)出一定的毒副作用和耐藥性[4-5]，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。

我國(guó)中藥資源豐富，來(lái)源廣泛。中藥抗真菌感染的記載由來(lái)已久，目前從中藥中篩選抗真菌藥物并研究其作用機(jī)制已成為抗真菌藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要方向。通過(guò)大量文獻(xiàn)調(diào)研并結(jié)合課題組近幾年的藥物篩選發(fā)現(xiàn)，苦參(SophoraflavescensAit.)、蛇床子(Cnidiummonnieri(L.) Cuss.)兩味中藥單用無(wú)顯著抗真菌作用，但兩者在臨床上經(jīng)常以藥對(duì)形式在抗VVC的復(fù)方中配伍使用，兩藥在此類(lèi)復(fù)方中使用頻率排在前2位[6-7]。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，苦參與蛇床子兩味藥按1∶1比例所得水提物具有顯著的抗真菌作用。本文著重考察苦參-蛇床子1∶1藥對(duì)水提物(Extract ofSophoraeFlavescentisRadix—CnidiiFructuscouplet medicines，ESCC)對(duì)引發(fā)VVC的白念珠菌主要毒力因子即酵母-菌絲二相轉(zhuǎn)換與生物膜形成的影響，為進(jìn)一步探尋苦參-蛇床子藥對(duì)抗真菌的機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C.albicansSC5314由第二軍醫(yī)大學(xué)姜遠(yuǎn)英教授惠贈(zèng)；白念珠菌VVC臨床株由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科分離。

培養(yǎng)基和試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(life technologies公司)；沙氏固體、液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；超純水(18.2Ω Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng))；YPD培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(Dimethyl Sulphoxide，國(guó)藥集團(tuán))；戊二醛(國(guó)藥集團(tuán))；PBS緩沖液(pH 7.0±2.0，實(shí)驗(yàn)室配制)；無(wú)水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，石油醚(天津市華東試劑廠)，乙酸乙酯(江蘇省強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)，正丁醇(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司)，XTT[2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide][生工生物工程(上海)股份有限公司]。

儀器 聚苯乙烯96孔和6孔微量培養(yǎng)板(Corning公司，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Labserv K3)；倒置熒光顯微鏡(Olympus IX81，日本)；恒溫培養(yǎng)箱(博迅實(shí)業(yè)公司，上海)；DSX-280B 型手提式壓力蒸汽滅菌器(申安醫(yī)療器械廠，上海)；流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer，BD Accuri C6)。

藥物 苦參、蛇床子購(gòu)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)方成武教授鑒定；氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LZ，博美生物科技)。

1.2 方法

苦參-蛇床子藥對(duì)水提取物的制備 按照1∶1比例稱取苦參和蛇床子單味藥各20 g，加入10倍量蒸餾水浸泡過(guò)夜。接冷凝回流裝置，加熱套煮沸并保持沸騰2 h，回收提取液。重復(fù)以上操作3次并混合提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100mL，真空冷凍干燥成固體粉末得苦參-蛇床子1∶1藥對(duì)水提取物(Extract ofSophoraeFlavescentisRadix—CnidiiFructusCouplet medicines，ESCC)，EP管封裝低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

白念珠菌懸液的制備 在超凈工作臺(tái)中，使用接種環(huán)挑取YPD平板上白念珠菌單菌落，移種至沙氏液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，37℃恒溫箱中活化18～20 h，連續(xù)活化2次。以RPMI-1640培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整成2×106CFU/mL和2×103CFU/mL備用。

酶標(biāo)儀檢測(cè)白念珠菌的MIC80利用微量液基稀釋法[8]檢測(cè)ESCC對(duì)白念珠菌VVC臨床株的MIC80。實(shí)驗(yàn)稱取ESCC凍干粉，用RPMI-1640配制終濃度為2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4 μg/mL的提取物藥液。將不同濃度的ESCC藥液和菌液(2×103CFU/mL)各100 μL加入96孔微量培養(yǎng)板，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(2 μg/mL FLZ +菌液)和空白對(duì)照(不含任何藥液)。37℃恒溫箱中孵育24h。用多功能酶標(biāo)儀于600nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(optical density，OD)值。相比于空白組，以吸光度減少為空白組80%的藥物稀釋度為MIC80。

XTT法檢測(cè)白念珠菌細(xì)胞的增殖活性 實(shí)驗(yàn)采用XTT法考察ESCC對(duì)白念珠菌VVC臨床株細(xì)胞增殖活性的影響[9]。實(shí)驗(yàn)將ESCC干粉以RPMI-1640配制終濃度為8～4096 μg/mL。將不同濃度ESCC藥液和菌液(2×106CFU/mL)各100 μL加入96孔微量培養(yǎng)板，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(32 μg/mL FLZ +菌液)和空白對(duì)照組(不含任何藥液)，37℃恒溫箱中孵育24 h。

配制XTT溶液并濾過(guò)除菌，臨用前加入維生素K3(2 μmol/L)配制成XTT-VK3。96孔板每孔加入50 μL XTT-VK3，37℃恒溫箱繼續(xù)避光孵育2 h，以多功能酶標(biāo)儀于492 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

正斷層是常見(jiàn)的斷層形式，指斷層上盤(pán)在重力或水平張力作用下沿著斷層面向下運(yùn)動(dòng)。當(dāng)周?chē)临|(zhì)硬度較低，管子在正斷層斜拉作用下易發(fā)生拉伸破壞。該項(xiàng)研究利用ADINA有限元軟件模擬管子在正斷層位移錯(cuò)動(dòng)及管道內(nèi)壓共同作用下的破壞變形，以此來(lái)研究不同內(nèi)壓對(duì)輸液管道抗震性能的影響。

倒置顯微鏡觀察白念珠菌酵母-菌絲二相轉(zhuǎn)換 配制不同濃度ESCC(256、512、1024 μg/mL)與白念珠菌VVC臨床株菌懸液(2×106CFU/mL)各3 mL加入12孔板，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(32 μg/mL FLZ+菌液)和空白對(duì)照組(不含任何藥液)，37℃恒溫培養(yǎng)4、8、12 h，置于倒置顯微鏡下觀察白念珠菌VVC臨床株酵母相和菌絲相生長(zhǎng)情況，并拍照。

掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy，SEM)觀察白念珠菌生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu) 將蓋玻片(75%酒精過(guò)夜預(yù)處理)放入 6 孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度ESCC(256、512、1024 μg/mL)，與白念珠菌VVC臨床株菌懸液(2×106CFU/mL)共孵育，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(32 μg/mL FLZ+菌液)和空白對(duì)照組(不含任何藥液)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后以無(wú)菌 PBS 緩沖液輕洗玻片上未黏附菌體，放入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定2 h，以30%、50%、70%、90%和無(wú)水乙醇逐級(jí)脫水各20 min，室溫干燥后，經(jīng)HVS-GB 型真空蒸鍍儀噴金，掃描電鏡觀察并拍照[10]。

微孔板觀察白念珠菌成熟生物膜的生長(zhǎng) 取玻片至于75%乙醇溶液中浸泡24 h，取出后用無(wú)菌PBS洗凈置于6孔板中，將RPMI-1640培養(yǎng)基與同體積白念珠菌VVC臨床株菌液(濃度為2×106CFU/mL)依次加入6孔微量培養(yǎng)板中混合，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，待白念珠菌生物膜形成后加藥干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)空白對(duì)照組(不含任何藥液)、陰性對(duì)照組(只含RPMI-1640培養(yǎng)基)，陽(yáng)性對(duì)照組(1024 μg/mL FLZ)、不同濃度ESCC干預(yù)組(2048、1024、512 μg/mL)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察ESCC對(duì)白念珠菌VVC臨床株成熟生物膜的影響。

qRT-PCR 檢測(cè)白念珠菌菌絲、生物膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 苦參-蛇床子1∶1藥對(duì)水提物(256、512、1024 μg/mL)干預(yù)白念珠菌VVC臨床株后，5000 r/min離心5 min收集菌體，參照Mag Extractor-RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。依逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，按 SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒，預(yù)變性(95℃/60 s)后，設(shè)置反應(yīng)條件為：變性(95℃/15 s)→退火(55℃/15 s)→延伸(72℃/45 s)，40循環(huán)。基因轉(zhuǎn)錄水平用倍數(shù)變化(Relative Fold Change)來(lái)表示(2-ΔΔCt法)[11]。

據(jù)NCBI基因庫(kù)查得基因序列，并用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物(見(jiàn)表1)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 苦參-蛇床子藥對(duì)水提物對(duì)白念珠菌的MIC80

通過(guò)檢測(cè)苦參-蛇床子藥對(duì)水提物對(duì)白念珠菌浮游菌的的最低抑菌濃度(MIC)，ESCC抗VVC臨床耐藥白念珠菌效果顯著，介于512～1024 μg/mL之間(見(jiàn)表2)。

2.2 苦參-蛇床子藥對(duì)水提物可影響白念珠菌細(xì)胞的增殖活性

表1 菌絲和生物膜相關(guān)基因引物序列表

表2 ESCC對(duì)白念珠菌的MIC80(μg/mL)

圖1XTT法檢測(cè)ESCC對(duì)白念珠菌代謝活性的影響(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.1The effect of ESCC on the metabolic activityC.albicans(*P<0.05，**P<0.01)

2.3 苦參-蛇床子藥對(duì)水提物可影響白念珠菌酵母-菌絲二相性轉(zhuǎn)換

實(shí)驗(yàn)將ESCC和白念珠菌VVC臨床株共培養(yǎng)4h、8h、12h后，通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組有菌絲相和酵母相交織形成的生物膜。而加藥組，隨著ESCC濃度的增加，菌絲形成較少，菌體數(shù)量也逐漸減少。其中當(dāng)ESCC濃度為1024μg/mL時(shí)菌體數(shù)量明顯減少，且只見(jiàn)有酵母相菌體，幾乎無(wú)菌絲形成(見(jiàn)圖2)。

2.4 苦參-蛇床子藥對(duì)水提物可影響白念珠菌生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)

通過(guò)SEM觀察發(fā)現(xiàn)，空白組白念珠菌VVC臨床株酵母-菌絲相互交織，包裹著細(xì)胞外基質(zhì)，形成三維立體的生物膜結(jié)構(gòu)，但經(jīng)不同濃度ESCC干預(yù)后，酵母相和菌絲相均不同程度減少，其中1024 μg/mL水提物組可抑制白念珠菌生物膜的形成(見(jiàn)圖3)。

2.5 苦參-蛇床子藥對(duì)水提物可破壞白念珠菌成熟生物膜的完整性

實(shí)驗(yàn)將ESCC加入預(yù)先培養(yǎng)成熟的白念珠菌VVC臨床株生物膜中，觀察其對(duì)白念珠菌成熟生物膜的影響。結(jié)果如圖4顯示，空白對(duì)照組(圖4A/a)中白念珠菌形成致密的生物膜，而加入ESCC干預(yù)24h后(圖4D/d、E/e、F/f)，抑制了白念珠菌生物膜的形成，且隨藥對(duì)提取物濃度的增加，白念珠菌成熟生物膜的完整性受到嚴(yán)重破壞。

2.6 苦參-蛇床子藥對(duì)水提物可影響白念珠菌菌絲和生物膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于內(nèi)參基因，白念珠菌VVC臨床株經(jīng)ESCC(256、512、1024 μg/mL)干預(yù)后，可降低菌絲和生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。其中1024 μg/mL藥對(duì)水提物影響最為明顯，分別使ALS1、ALS3、HWP1下調(diào)78.12%、85.73%、84.92%(見(jiàn)圖5)。

3 討 論

由白念珠菌引起的外陰陰道念珠菌病是困擾女性的常見(jiàn)病，影響女性的身體健康和生活質(zhì)量[12]。而臨床常見(jiàn)治療藥物如氟康唑、酮康唑等的廣泛使用甚至濫用，已致出現(xiàn)大量白念珠菌耐藥菌株[13]，極大限制了VVC的治療。

近些年，中醫(yī)藥治療VVC越發(fā)受到學(xué)者們的關(guān)注。藥對(duì)是方劑中最小的配伍形式，是中醫(yī)藥學(xué)家在遣方用藥中的經(jīng)驗(yàn)?zāi)?，體現(xiàn)中藥方劑的規(guī)律特征與辯證施治的內(nèi)涵[14-15]。中醫(yī)認(rèn)為VVC多是由濕、熱、蟲(chóng)三邪所致[16]。臨床常用復(fù)方苦參洗劑和苦參蛇床子栓劑等均是以苦參、蛇床子等為主要藥物，用于治療VVC，發(fā)揮清熱燥濕、殺蟲(chóng)利尿、瀉火解毒等功效[17-19]。文獻(xiàn)報(bào)道[20-22]苦參有效成分(苦參堿和氧化苦參堿)與蛇床子提取物單用時(shí)抗白念珠菌效果較差，二者聯(lián)用即可大大增加抗菌效應(yīng)，且對(duì)陰道炎治療效果顯著。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)微量液基稀釋法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)苦參-蛇床子1∶1藥對(duì)水提物(ESCC)具有一定的抗真菌效果，XTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，藥對(duì)水提物可劑量依賴性的降低白念珠菌VVC臨床株細(xì)胞的增殖活性。

圖2倒置顯微鏡觀察ESCC對(duì)白念珠菌酵母-菌絲二相性轉(zhuǎn)換的影響(×400)圖3ESCC對(duì)白念珠菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(1500×).A.空白對(duì)照組；B.陽(yáng)性對(duì)照組(32 μg/mL FLZ)；C.1024 μg/mL ESCC組；D.512 μg/mL ESCC組;E.256 μg/mL ESCC組圖4ESCC對(duì)白念珠菌成熟生物膜的影響(200×).A(a).2048μg/mL ESCC組；B(b). 1024 μg/mL ESCC組；C(c). 512 μg/mL ESCC組；D(d). RPMI-1640培養(yǎng)基組；E(e). 空白對(duì)照組；F(f). 陽(yáng)性對(duì)照組(FLZ:1024 μg/mL)

Fig.2Effects of ESCC on yeast-hypha conversion ofC.albicans(×400)Fig.3The effect of ESCC on the morphology ofC.albicansbiofilms(1500×).A.Control;B.positive control group (32 μg/mL FLZ);C.1024 μg/mL ESCC;D.512 μg/mL ESCC;E.256 μg/mL ESCCFig.4The effect of ESCC onC.albicansmature biofilms(200×).A(a).2048μg/mL ESCC; B(b). 1024 μg/mL ESCC; C(c). 512 μg/mL ESCC; D(d). RPMI-1640 medium; E(e). Control; F(f). positive control group(FLZ:1024 μg/mL)

圖5ESCC對(duì)白念珠菌菌絲、生物膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.5Effects of ESCC on the expression ofC.albicanshypha and biofilms-related genes(*P<0.05,**P<0.01)

在實(shí)驗(yàn)觀察中發(fā)現(xiàn)ESCC在早期對(duì)白念珠菌VVC臨床株的抑制作用顯著，而白念珠菌生長(zhǎng)周期的早期正是酵母-菌絲二相型轉(zhuǎn)換的重要階段[23]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察4 h、8 h、12 h三個(gè)時(shí)間段，ESCC對(duì)白念珠菌的抑制作用。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，白念珠菌在4～12 h為菌絲生長(zhǎng)期，空白組可見(jiàn)大量菌絲，但藥對(duì)水提物不同濃度組可顯著抑制菌絲的形成，提示ESCC的抗真菌作用可能是與抑制白念珠菌的主要毒力因子即酵母-菌絲二相轉(zhuǎn)換有關(guān)。

菌絲的形成，一方面可大大增強(qiáng)菌體的黏附性[23]，另一方面也是白念珠菌生物膜的形成重要組成部分[24]。生物膜是由白念珠菌生長(zhǎng)過(guò)程中分泌到菌體外的細(xì)胞外基質(zhì)包裹酵母相和菌絲相形成的致密的三維立體結(jié)構(gòu)，可明顯增強(qiáng)白念珠菌的毒力和致病性。掃描電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組形成酵母與菌絲交織的致密的生物膜結(jié)構(gòu)，但經(jīng)ESCC干預(yù)后，生物膜結(jié)構(gòu)不典型，菌體數(shù)量顯著減少，且菌絲形成較少。提示ESCC可影響白念珠菌的生物膜的形成。

實(shí)驗(yàn)還設(shè)計(jì)觀察了ESCC對(duì)白念珠菌成熟生物膜的影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)預(yù)先在玻片上培養(yǎng)成熟的生物膜，加藥物干預(yù)后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于空白組的致密生物膜結(jié)構(gòu)，不同濃度加藥組均可破壞成熟生物膜的完整性，導(dǎo)致生物膜松散，從玻片上脫落。

目前認(rèn)為，ALS1、ALS3、HWP1編碼產(chǎn)物與菌絲及生物膜形成密切相關(guān)，被敲除或抑制將導(dǎo)致酵母-菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化受抑制，毒力隨之下降[25-27]。為了從基因水平找尋ESCC抗真菌機(jī)理，實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)白念珠菌VVC臨床株的菌絲、生物膜形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)ESCC干預(yù)后，ALS1、ALS3、HWP1基因轉(zhuǎn)錄水平均有明顯下調(diào)趨勢(shì)，提示ESCC可影響菌絲、生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，降低其轉(zhuǎn)錄水平和編碼產(chǎn)物。

綜上，苦參-蛇床子1∶1藥對(duì)水提物的抗真菌活性可能是通過(guò)影響白念珠菌菌絲及生物膜形成相關(guān)基因，進(jìn)而使其編碼的相關(guān)產(chǎn)物降低，影響酵母-菌絲二相轉(zhuǎn)化，以及生物膜的形成，從而起到抗白念珠菌作用。