趙林 王林會 鄭方亮 侯彬彬

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，大連 116021；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)院，大連 116024；3.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，沈陽 110031)

RNA干擾是真核生物中相對保守的基因沉默機(jī)制，它通過內(nèi)源或外源雙鏈RNA介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解或翻譯的抑制，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，并產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。

1992年，Macino首次在粗糙脈胞菌中發(fā)現(xiàn)真菌中存在RNAi的現(xiàn)象后，RNAi技術(shù)漸成為一種對真菌進(jìn)行遺傳改造的新手段[1-3]。在絲狀真菌中RNAi技術(shù)具有特殊的優(yōu)勢：不受絲狀真菌的多核現(xiàn)象、異核現(xiàn)象和非同源重組頻率高的干擾，特別是當(dāng)需要使多個基因的表達(dá)同時下調(diào)時，使用RNA干擾比基因敲除更加方便。然而，真正將RNAi技術(shù)用在絲狀真菌的各項研究時還存在很多問題：真菌細(xì)胞多為多倍體，細(xì)胞壁含有較多的多糖及多糖蛋白等成分，使得RNA沉默的效果并不如在原生、動物細(xì)胞中理想，存在干擾效率低下、有脫靶效應(yīng)等缺陷。因此選擇恰當(dāng)?shù)倪z傳轉(zhuǎn)化方法并制備合適的轉(zhuǎn)染載體，可以更高效的導(dǎo)入siRNA，保證導(dǎo)入siRNA的穩(wěn)定性，有效延長RNAi的作用時間，進(jìn)而大大提高靶基因抑制效率，更好的對絲狀真菌進(jìn)行基因改造。

本文對現(xiàn)有的植物雙元表達(dá)載體進(jìn)行改造，加入多克隆位點(diǎn)，引入真菌通用啟動子Ptrpc、間隔序列和終止子Ttrpc，并引入潮霉素抗性基因，使其在間隔序列兩側(cè)加上目的基因的正反向干擾序列后即可廣泛用在多種真菌基因干擾的研究中[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 DH5α，EHA105。

質(zhì)粒 PCB-309，PUC-PUT。

酶和主要試劑XbaⅠ，XhoⅠ，SpeⅠ,SacⅠ,KpnⅠ，BglⅡ，HindⅢ等限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Taq酶、T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA分子量Marker(Marker 2000, 5000)購自大連Takara公司。質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。

培養(yǎng)基 LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(g/l)。Tryptone 10g；Yeast extract 5g；NaCl 10gLB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基(g/l)。Tryptone 10g；Yeast extract 5g；NaCl 10g；瓊脂 15g。

實驗所用引物STE20-F: 5’-CGGGGTACCCTCGAGTTGCAGCTCCAAGCACAAC -3’ 酶切位點(diǎn)：KpnI,XhoI

STE20-R: 5’-GAAGATCTAAGCTTCAGTGAGTTTGCCTCGGTAC -3’ 酶切位點(diǎn)：BglⅡ，HindⅢ

(擴(kuò)增STE20基因引物)

CUT-F：5’-TACCCACTGGAGATTTGTTGG-3’

CUT-R：5’-CAACAAATCTCCAGTGGGTAC-3’

(pUC-PUT質(zhì)粒中間間隔序列引物)

1.2 實驗方法

質(zhì)粒提取、DNA純化回收 見天根試劑盒說明書。

總RNA提取 總RNA提取使用RNA提取試劑盒，方法如下：①提取RNA實驗中使用的耗材等均為無RNase污染，水為RNase-Free超純水。②菌體離心后，加入350 μL細(xì)胞裂解液RL(使用前加入β-巰基乙醇)。③裂解3 min后，將裂解液轉(zhuǎn)移到過濾柱CS柱上，12000 r/min離心2 min，收集濾液。④加入等體積的70%乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移至吸附柱CR3中，12000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管上。⑤吸附柱中加入350 μL去蛋白液RW1，12000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液。⑥吸附柱CR3膜上加入80 μL稀釋的DNase I工作液，室溫靜置15 min。⑦吸附柱中加入350 μL去蛋白液RW1，12000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液。⑧取500 μL漂洗液RW加到吸附柱中，室溫靜置2 min，12000 r/min離心1 min，倒掉收集管中廢液。重復(fù)操作1次。⑨12000 r/min離心2 min，倒掉廢液。室溫靜置5 min，徹底晾干殘留的漂洗液。⑩將吸附柱放入1個新的RNase-Free離心管中，取50 μL RNase-Free水加到吸附柱中膜上，靜置2 min，12000 r/min離心2 min，得到RNA溶液。11用新配的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳液也為新鮮配制，鑒定提取RNA的質(zhì)量。

RNA反轉(zhuǎn)錄 將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板。具體方法如下：① 在RNase-Free PCR管中配制下列混合液:

Oligo dT Primer(50 μmol/L) 1 μLdNTP Mixture(10 mmol/L each) 1 μLTotal RNA1 μLRNase-Free ddH2O 7 μLTotal10 μL

② 在PCR儀上進(jìn)行變性反應(yīng)，65 ℃ 5 min，冰上立即冷卻。

③ 在該P(yáng)CR管中繼續(xù)配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

變性后反應(yīng)液10 μLRnase Inhibitor(40 U/μL) 0.5 μLPrimeScript RTase(200 U/μL) 1 μL5×buffer4 μLRNase-Free ddH2O4.5 μLTotal20 μL

④ 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min使酶失活，冰上冷卻。

感受態(tài)細(xì)胞的制備 將DH5α菌保接到LB液體培養(yǎng)基中，將接菌后的試管于溫度37℃，220 r/min，培養(yǎng)16 h。然后轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基中(按約1∶100的量轉(zhuǎn)接)，220 r/min，37℃培養(yǎng)到OD6000.6。然后，將培養(yǎng)物加到50 mL離心管中冰上預(yù)冷10 min。4℃，4000 r/min離心5 min，棄去上清。用預(yù)冷30 mL的CaC12(0.l mol/L)重懸，冰上放置30 min，然后，4℃，4000 r/min離心5 min，棄上清。最后用l mL預(yù)冷的CaC12(0.l mol/L)重懸，用槍吹吸，使其均勻，按100 μL一管分裝。

轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 每管感受態(tài)細(xì)胞加入連接產(chǎn)物10 μL，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻，在冰上放置30 min。將管放入預(yù)加溫至42℃的水浴中，熱激70s?？焖賹⒐苻D(zhuǎn)移到冰浴中，使感受態(tài)細(xì)胞冷卻2 min。每管加入90 μL的液體LB，37℃搖床溫育60 min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素標(biāo)記抗性基因。4000 r/min離心后用100 μL液體LB重懸，涂布于含有相應(yīng)抗生素的固體LB平板上。倒置于37℃培養(yǎng)，16 h后挑選所需陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切驗證。

RNA干擾載體pCB309-PSUST的構(gòu)建 ①構(gòu)建PUC-PSUT：a.以cDNA為模板，用引物STE20-F和STE20-R擴(kuò)增STE20基因的干擾序列，得到片段長度約540 bp。b.將PCR片段純化回收，用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切；將PUC-PUT用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切。酶切后再分別純化回收。c.將酶切后的純化PCR片段與酶切后純化的PUC-PUT載體進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PUC-PSUT(見圖1)。d.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，測序驗證[5]。

酶切體系：

PCR片段(50～100 ng/μL)5 μLXhoⅠ1 μLHindⅢ1 μL 10×buffer2 μLddH2O11 μLTotal 20μL

酶切溫度：37℃，時間：3h。

連接體系：

PCR片段(50～100 ng/μL)8μLpUC-PUT載體2μLT4連接酶1 μL10×buffer2 μLddH2O7 μLTotal 20μL

連接溫度：16℃，時間：16 h。

圖1 載體構(gòu)建模式圖

②構(gòu)建PUC-PSUST：a.以cDNA為模板，用引物STE20-F和STE20-R擴(kuò)增STE20基因的干擾序列，得到片段長度約540 bp。b.將PCR片段純化回收，用BglⅡ和KpnⅠ雙酶切；將PUC-PSUT用BglⅡ和KpnⅠ雙酶切。酶切后再分別純化回收。c.將酶切后的純化PCR片段與酶切后純化的PUC-PSUT載體進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PUC-PSUST。d.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，提質(zhì)粒，測序驗證。

酶切體系：

PCR片段或質(zhì)粒(50～100 ng/μL)5 μLXhoⅠ1 μLHindⅢ1 μL 10×buffer2 μLddH2O11 μLTotal20 μL

酶切溫度：37℃，時間：3 h。

連接體系：

PCR片段(50～100 ng/μL)8μLPUC-PSUT載體2μLT4連接酶1 μL10×buffer2 μLddH2O7 μLTotal 20 μL

連接溫度：16℃，時間：16 h。

③構(gòu)建pCB309-PSUST：a.將PUC-PSUST和PCB309分別用SpeⅠ和SacⅠ雙酶切。酶切后再分別純化回收。b.將從PUC-PSUST酶切并純化的PSUST片段與酶切后純化的PCB-309載體進(jìn)行連接，連接為環(huán)形質(zhì)粒得到PCB309-PSUST。c.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α、挑取單菌落、提質(zhì)粒、SpeⅠ和SacⅠ雙酶切酶切驗證及PCR鑒定。鑒定時用引物STE20-F分別與CUT-F、CUT-R搭配鑒定。

酶切體系：

質(zhì)粒(50～100 ng/μL)5 μLSpeⅠ1 μLSacⅠ1 μL 10×buffer2 μLddH2O11 μLTotal20 μL

酶切溫度：37℃，時間：3 h。

連接體系：

PSUST片段(50～100 ng/μL)8μLPCB-309載體2μLT4連接酶1 μL10×buffer2 μLddH2O7 μLTotal 20 μL

連接溫度：16℃，時間：16 h。

電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備 ①取EHA105菌保加入LB(含利福平抗生素)培養(yǎng)基中，30 ℃搖床過夜培養(yǎng)。②200 μl的過夜培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)接于新鮮的20 mL LB(含利福平抗生素)培養(yǎng)基中。③30 ℃搖床培養(yǎng)3～4 h，待OD600值達(dá)0.4～0.6時停止培養(yǎng)。4 ℃，4000 r/min，離心5 min，棄上清，收集菌體。④用20 mL 10%的甘油洗兩遍(第2遍時甘油量減半)。

⑤離心后的菌體沉淀用150 μL 10%的甘油溶解，冰上放置2 h。使用時分裝，每管50 μL。若不當(dāng)天使用，與等體積的30%的甘油混合，于-80 ℃保存。

電轉(zhuǎn)感受態(tài)的轉(zhuǎn)化 ①回收的PCR產(chǎn)物跑電泳粗略估算濃度，取適量質(zhì)粒加入電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭混勻。②取電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞至冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中。③將電轉(zhuǎn)杯放置于電轉(zhuǎn)儀上電激。一般電激條件為：0.1 cm的電轉(zhuǎn)杯，1350 V，10 μF，600 ohms；理想的電激時間為4.5～4.9 ms。④電激后，冰上放置1 min。加入1 mL無抗性的LB培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)1 h。⑤培養(yǎng)液4000 r/min離心5 min，棄掉大部分上清，留200 μL溶解沉淀。涂布于LB(含利福平和卡那抗生素)固體平板上，30 ℃過夜培養(yǎng)，待長出重組子，PCR鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 RNA干擾載體pCB309-PSUST的構(gòu)建

①將STE20正向干擾序列540 bp連接到PUC-PUT載體的Ptrpc啟動子和間隔序列之間，得到載體PUC-PSUT載體，雙酶切鑒定3400bp，再通過測序鑒定(見圖2)。②再將STE20反向干擾序列540 bp連接到PUC-PSUT載體的間隔序列和Ttrpc終止子之間，得到載體PUC-PSUST，雙酶切鑒定5000 bp，再通過測序鑒定(見圖3)。③將PUC-PSUST上的PSUST片段通過酶切切下來，與PCB309 (5.4 kb)連接，得到載體PCB309-PSUST(見圖4)。④PCB309-PSUST質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：將上步構(gòu)建的PCB309-PSUST質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105中，對陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定(見圖5)。⑤含有載體PCB309-PSUST的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化孢子絲菌的實驗進(jìn)行了3批次，每批次平均每皿所獲得的轉(zhuǎn)化子是比較恒定的。證明根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法比較穩(wěn)定且重復(fù)性好。

圖2PUC-PSUT質(zhì)粒雙酶切鑒定圖，XhoⅠ和HindⅢ雙酶切圖3PUC-PSUST質(zhì)粒雙酶切鑒定圖，用BglⅡ和KpnⅠ雙酶切圖4PCB309-PSUST 酶切鑒定圖5PCB309-PSUST轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒PCR鑒定圖，鑒定引物STE20-F/CUT-F，STE20-F/CUT-R

Fig.2Identification of pUC-PSUT plasmid by double digestion and double digestion byXhoⅠ andHindⅢFig.3Identification of PUC-PSUST plasmid by double digestion withBglⅡ andKpnⅠFig.4Identification of PCB309-PSUST by restriction enzyme digestionFig.5PCR identification map of PCB309-PSUST transformants plasmid, identification primers STE20-F/CUT-F, STE20-F/CUT-R

3 討 論

載體的構(gòu)建復(fù)雜又精細(xì)，每一步的改造都至關(guān)重要。目前使用的雙元載體多數(shù)在10kB以上，不利于載體構(gòu)建等基因工程方面的操作。實驗中保留雙元載體pBI121的必須元件和序列，將其改造為較小的雙元載體，并具卡那霉素抗性。為方便進(jìn)一步的操作，將pBlueScriptII的多克隆位點(diǎn)(MCS)酶切下來構(gòu)建干擾載體中；為使載體適于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，加入了T-DNA邊界重復(fù)序列；為便于轉(zhuǎn)化后的篩選，又將潮霉素抗性基因構(gòu)建到干擾載體上。改造以前的干擾載體僅適于青霉菌屬的RNA干擾，為擴(kuò)大干擾范圍，擴(kuò)增了pSilent-1質(zhì)粒中的真菌通用啟動子Ptrpc，并將其置于干擾載體中，至此成功構(gòu)建一種適于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的，能對多種絲狀真菌基因進(jìn)行RNA干擾研究用的載體[6-7]。

利用本實驗構(gòu)建的載體PCB309-PSUST 及優(yōu)化的反應(yīng)體系成功實現(xiàn)了對孢子絲菌STE20基因的有效干擾，操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，具有很好的應(yīng)用前景。該方法的研發(fā)可使RNA干擾技術(shù)更廣泛的用在真菌基因功能的研究中，有可能設(shè)計出RNAi芯片，高通量的篩選藥物靶基因，并可望用于新型藥物的研究及更廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中。近年來，RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)據(jù)報道，已成功應(yīng)用于一些病原性真菌的基因功能研究中，如新生隱球菌、煙曲霉和莢膜組織胞漿菌等[8-10]，本試驗成功構(gòu)建針對孢子絲菌STE20的RNAi表達(dá)載體，這將給深入系統(tǒng)的研究病原性真菌的致病機(jī)制提供更有力的技術(shù)手段，也為將來在基因組水平上開展大規(guī)模的基因功能研究打下堅實的基礎(chǔ)。