楊文娟,程世蕊,馬養(yǎng)民,龔 頻,何亞娟,胡 媛,毛跟年

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021;2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710021)

糖尿病是危害人體健康的非傳染性慢性疾病之一,持續(xù)高血糖狀態(tài)可造成肝臟損傷,據(jù)報(bào)道,糖尿病人群中肝病發(fā)病率約50%[10]。由于肝臟代償作用較強(qiáng),早期糖尿病并發(fā)肝臟損傷不明顯,但其累積效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致肝功能喪失而危及生命[11-12]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明糖尿病性肝病病因與高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激異常有關(guān),引起機(jī)體特異性免疫反應(yīng),以致糖脂代謝紊亂、微血管病變及微循環(huán)障礙[13]。目前關(guān)于裂葉蕁麻對(duì)糖尿病引起肝臟損傷的保護(hù)作用未見報(bào)道。

本研究采用STZ誘導(dǎo)構(gòu)建Ⅱ型糖尿病小鼠模型,從氧化應(yīng)激角度探討裂葉蕁麻在糖尿病性肝損傷的保護(hù)作用,以期為裂葉蕁麻相關(guān)保健產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級(jí)ICR小鼠 60只,雄性,體質(zhì)量(20±2) g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(陜)2017-003,自由飲食飲水,12 h交替光照,SPF環(huán)境飼養(yǎng);裂葉蕁麻藥材 采自陜西省旬陽(yáng)縣,經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)顏永剛教授鑒定為蕁麻科裂葉蕁麻(UrticafissaE.Pritz.)的根莖;鏈脲佐菌素(STZ) 美國(guó)Sigma公司,溶解于0.1 mol/L(pH4.4)檸檬酸鹽緩沖液,臨用前配制;ACCU-CHEK活力型血糖試紙 羅氏診斷試劑公司;考馬斯亮藍(lán)G-250 瑞士阿達(dá)瑪斯公司;SOD、MDA、CAT試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

全活力血糖儀 德國(guó)羅氏公司;Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀 芬蘭THERMO;BSASS2S電子天平 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C精密PH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;WH3微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;DM2500/DFC正置式顯微鏡 德國(guó)Leica。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裂葉蕁麻提取物的制備 取裂葉蕁麻根莖適量,粉碎,過40目篩,10倍量70%乙醇回流提取2 次,每次1 h,減壓濃縮,凍干(-50 ℃,6 h),臨用前配制1 g生藥/mL的溶液。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立及給藥 健康ICR小鼠60只,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,隨機(jī)取10只作為空白組,其余小鼠禁食12 h后,腹腔注射STZ溶液(75 mg/kg),連續(xù)注射2 d,1次/d,72 h后小鼠尾靜脈取血測(cè)空腹血糖,血糖值高于11.1 mmol/L即為造模成功。取造模成功的小鼠40 只隨機(jī)分為模型組、蕁麻低劑量組(100 mg/kg)、蕁麻中劑量組(200 mg/kg)、蕁麻高劑量組(400 mg/kg),每組10只;空白組和模型組給予生理鹽水,各藥物組按照相應(yīng)劑量灌胃,給藥量均為0.1 mL/10 g,1次/d,連續(xù)給藥30 d。

1.2.3 體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的測(cè)定 小鼠體質(zhì)量的測(cè)定:于實(shí)驗(yàn)的第0、5、10、15、20、25、30 d測(cè)定小鼠體質(zhì)量,并記錄。

肝臟指數(shù)的測(cè)定:末次給藥后小鼠脫頸椎處死,迅速取出肝臟,冷生理鹽水漂洗,稱濕重,計(jì)算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(%)=(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)×100

1.2.4 肝臟組織病理觀察 取相同部位肝臟組織,生理鹽水沖洗后用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片厚度5 μm,蘇木素-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理觀察。

1.2.5 MDA、PCO含量及SOD、CAT活性的測(cè)定 取適量肝臟制備10%的肝組織勻漿,3000 r/min離心10 min,取上清,測(cè)定MDA、PCO含量及SOD、CAT活性,肝臟蛋白羰基化程度用2,4-二硝基苯肼法測(cè)定,其余指標(biāo)測(cè)定的具體操作按照試劑盒方法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Origin 8.5作圖,SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用ANOVA分析,p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

如圖1所示,給藥前各組小鼠體質(zhì)量較為均一,空白組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)符合小鼠生長(zhǎng)規(guī)律,模型組小鼠由于STZ造成胰島細(xì)胞損傷,血糖升高,體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯減緩,與糖尿病“三多一少”中體重減少的臨床癥狀相符;裂葉蕁麻各劑量組小鼠從給藥15 d起,體質(zhì)量出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)趨勢(shì),高劑量組小鼠給藥30 d時(shí)的體質(zhì)量接近正常小鼠,表明裂葉蕁麻提取物可以一定程度緩解糖尿病引起的體重降低。

圖1 裂葉蕁麻對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

由圖2可知,與空白組相比,模型組小鼠的肝臟指數(shù)增加(p<0.01),表明糖尿病小鼠肝臟可能出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷,引起肝臟質(zhì)量增大;與模型組相比,裂葉蕁麻高、中劑量組小鼠肝臟指數(shù)顯著低于模型組(p<0.01,p<0.05),表明經(jīng)裂葉蕁麻提取物處理后,糖尿病小鼠的肝臟損傷有一定程度改善。

圖2 裂葉蕁麻對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響

2.2 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

如圖3所示,空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,排列整齊,圍繞中央靜脈向四周放射狀排列,肝細(xì)胞多角形,無腫脹,細(xì)胞中間有圓形細(xì)胞核(★);模型組小鼠可見肝小葉界限不清,肝細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)腫脹、氣泡樣病變(☆),細(xì)胞密度減低,形態(tài)不規(guī)則,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。蕁麻各劑量組治療后肝臟病變有不同程度減輕,細(xì)胞腫脹減輕(▲),高、中劑量組緩解作用較明顯。由此可知,裂葉蕁麻能夠緩解糖尿病小鼠肝臟形態(tài)病理?yè)p傷,具有一定程度保護(hù)作用。

圖3 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠肝臟形態(tài)組織學(xué)改變的影響(HE,200×)

2.3 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠肝臟氧化損傷指標(biāo)的影響

如圖4所示,模型組糖尿病小鼠肝臟組織脂質(zhì)過氧化物MDA增多,與空白組相比,有顯著性差異(p<0.05),經(jīng)蕁麻提取物處理后,可以減少肝組織MDA的生成,高劑量組差異有顯著性(p<0.05),表明糖尿病可以誘發(fā)肝臟的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),而裂葉蕁麻可以抑制體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。

圖4 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的影響

由圖5可知,糖尿病組小鼠PCO含量增加,與空白組相比,差異極顯著(p<0.01),表明糖尿病對(duì)肝臟蛋白質(zhì)產(chǎn)生明顯損傷,而裂葉蕁麻各劑量組能夠降低體內(nèi)PCO水平,高劑量組保護(hù)作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。結(jié)果表明,糖尿病可以加速肝臟蛋白質(zhì)羰基化[14],而裂葉蕁麻可以減輕肝臟蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖5 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠肝臟蛋白羰基化的影響

2.4 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響

如圖6所示,與空白組相比,糖尿病組小鼠SOD活力降低,差異極顯著(p<0.01),裂葉蕁麻各劑量組能夠恢復(fù)酶的活性,提高SOD水平,高、中劑量組保護(hù)作用顯著(p<0.01,p<0.05),表明糖尿病顯著抑制了肝臟超氧化物歧化酶的活性,而裂葉蕁麻可以減輕肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖6 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠肝臟超氧化物歧化酶的影響

由圖7可知,模型組糖尿病小鼠肝臟CAT活性明顯降低,與空白組相比,差異極顯著(p<0.01),而裂葉蕁麻各劑量組可以延緩肝臟組織CAT活力的降低,各劑量組均有顯著性差異(p<0.01,p<0.05),表明糖尿病降低了肝臟過氧化氫酶的活性,裂葉蕁麻可以一定程度恢復(fù)酶的活性,緩解CAT的降低。

圖7 裂葉蕁麻對(duì)糖尿病小鼠肝臟過氧化氫酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

糖尿病長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可造成代謝紊亂,誘發(fā)肝臟、心臟、腎臟等重要臟器損傷,導(dǎo)致許多并發(fā)癥的出現(xiàn)[15]。其中肝病在糖尿病中發(fā)病率較高,高血糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在糖尿病性肝臟損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,由于血糖累積,肝臟代償有限,最終可發(fā)展為非酒精性肝病、肝纖維化、肝硬化等,嚴(yán)重危及生命[16-18]。研究表明蕁麻中黃酮類、多酚、鞣質(zhì)等成分能夠調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)SOD、CAT、GSH活性,減少M(fèi)DA、PCO水平,也具有較強(qiáng)的體外清除自由基能力[19]。本研究通過建立STZ誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病小鼠模型,STZ損傷小鼠胰島β細(xì)胞,使胰島素分泌不足造成糖尿病。糖尿病典型癥狀為“三多一少”,即飲食飲水尿量增多、體重減少,裂葉蕁麻提取物能夠緩解糖尿病引起的體重減輕,控制糖尿病小鼠體重,并且減輕了肝臟損傷,降低了肝臟指數(shù);糖脂代謝紊亂可導(dǎo)致肝臟組織形態(tài)學(xué)改變,肝細(xì)胞受損,本研究通過HE染色觀察肝臟組織基本形態(tài),糖尿病小鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂,腫脹明顯,細(xì)胞密度減低,裂葉蕁麻高、中劑量組對(duì)上述組織病理形態(tài)均有所改善,高劑量組改善作用明顯。因此,從上述生理指標(biāo)及組織形態(tài)學(xué)反映出裂葉蕁麻具有對(duì)糖尿病小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,其可進(jìn)一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián),使細(xì)胞脆性增加和變形性降低,從而導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能的改變[20],PCO是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的一個(gè)重要標(biāo)志物,它產(chǎn)生于活性氧攻擊氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基后最終生成的NH3和相應(yīng)的羰基衍生物,因此,測(cè)定MDA和PCO含量能間接反映氧化應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體受損傷的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,裂葉蕁麻減少了MDA、PCO含量,具有降低糖尿病小鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷的作用。

SOD和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶,是調(diào)節(jié)機(jī)體自由基及活性氧生成的重要因素,而糖尿病代謝紊亂狀態(tài)導(dǎo)致抗氧化酶活性被破壞[21-23],糖尿病小鼠的SOD和CAT活性顯著降低,裂葉蕁麻提取物可能通過對(duì)體內(nèi)自由基的清除作用,減少氧化物的生成,進(jìn)而提高肝臟中SOD和CAT活性,這可能是其保護(hù)糖尿病小鼠肝臟損傷的作用機(jī)制之一。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究了裂葉蕁麻提取物在不同劑量下對(duì)肝臟氧化損傷指標(biāo)及抗氧化酶活性的影響,證明了裂葉蕁麻能夠顯著改善糖尿病小鼠肝臟損傷狀態(tài),減輕肝臟病理形態(tài),對(duì)肝臟氧化損傷具有明確的緩解作用,這一結(jié)論為裂葉蕁麻在糖尿病人群的保健食品開發(fā)領(lǐng)域提供了新的方向和思路,但有待進(jìn)一步研究,以期探討具體物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。