牦牛出血性敗血癥病原的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

郭占宏

青海省西寧市大通縣樺林鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，青海大通810100

2019年3月5日，青海省大通縣某牧民飼養(yǎng)的成年牦牛發(fā)病，發(fā)病率和死亡率分別為48%、50%，病程短，致死率高。發(fā)病初期牦牛體溫升高達(dá)40 ℃，喜臥不食，咽喉、頸部和胸前部發(fā)生炎性水腫，隨病情加重發(fā)展，病牦牛腹式呼吸、流涎，可視黏膜發(fā)紺，下痢。剖檢病死牦?？梢娏馨徒Y(jié)腫脹，皮下組織和肌肉有出血性膠樣浸潤(rùn)，流出透明的淡黃色液體，胃腸黏膜出血，肺臟呈大理石樣病變。通過采取病死牦牛臟器進(jìn)行病原分離鑒定，結(jié)合臨床癥狀和剖檢病變，確診為牦牛出血性敗血癥，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）病料采集。無(wú)菌采集青海省大通縣某牧民牧場(chǎng)中病死牦牛實(shí)質(zhì)臟器（心、肝、脾、肺、腎等）。

2）主要試劑和培養(yǎng)基。TSA 瓊脂平板、TSB 肉湯、生化培養(yǎng)基、TSA 瓊脂斜面、MH（A）培養(yǎng)基，獸醫(yī)臨床常用藥敏紙片：卡那霉素、萬(wàn)古霉素、頭孢哌酮、羧芐青霉素、鏈霉素、氟哌酸、頭孢噻肟、紅霉素、頭孢呋新、妥布霉素、氯霉素、頭孢唑啉。

3）試驗(yàn)動(dòng)物。6 只健康昆明系小鼠，體重為16～18 g，不分雌雄。

1.2 方 法

1）病料觸片、染色鏡檢。將無(wú)菌采集的實(shí)質(zhì)臟器進(jìn)行觸片，革蘭染色、美藍(lán)染色鏡檢。

2）細(xì)菌分離與純化。在TSB 肉湯上接種采集的病料，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，搖勻，然后在TSA 瓊脂平板上劃線接種勾取2～3 環(huán)TSB 肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌的數(shù)次純化培養(yǎng)，之后在TSA 血斜面上接種純化好的細(xì)菌，于37 ℃培養(yǎng)24 h。

3）生化鑒定。將分離純化的菌株分別接種于各種糖培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水、鄧亨氏蛋白胨水、尿素、枸櫞酸鹽等生化培養(yǎng)基中，37 ℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察生化反應(yīng)特性。

4）動(dòng)物試驗(yàn)。將6 只健康昆明系小鼠分成2 組：I 組（試驗(yàn)組）、II 組（對(duì)照組），每組3 只小鼠。將病料在無(wú)菌條件下制成乳劑，給I 組（試驗(yàn)組）3 只小鼠進(jìn)行腹腔注射，0.5 mL/只；II 組（對(duì)照組）小鼠采用滅菌生理鹽水進(jìn)行腹腔注射，0.5 mL/只，對(duì)小鼠生長(zhǎng)、病死情況進(jìn)行觀察。

5）藥敏試驗(yàn)。通過滅菌棉拭子蘸取菌液涂布在MH（A）培養(yǎng)基表面，確保涂布均勻，分別貼上藥敏紙片，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，并且測(cè)量抑菌圈直徑（cm）大小。判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑＜1.5 cm，耐藥；1.5 cm≤抑菌圈直徑≤2.0 cm，中介；抑菌圈直徑＞2.0 cm，高敏。

2 結(jié)果與分析

1）觸片、染色鏡檢。病死牦牛實(shí)質(zhì)臟器觸片，革蘭和美藍(lán)染色鏡檢可見陰性、大量?jī)蓸O濃染的小桿菌。

2）菌落形態(tài)。在TSA 瓊脂平板上菌落邊緣整齊、濕潤(rùn)光滑，TSB 肉湯培養(yǎng)后均勻渾濁。

3）生化鑒定結(jié)果。生化鑒定詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

4）動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果。在注射24 h 后，I 組（試驗(yàn)組）3 只小鼠全部死亡，剖檢病死小鼠觀察到全身出血性變化顯著，皮下組織水腫，肝臟有壞死灶呈灰白色，腸道出血顯著。采集病死小鼠脾臟、肝臟等臟器病料進(jìn)行觸片、革蘭與美藍(lán)染色、鏡檢，發(fā)現(xiàn)陰性、兩極濃染的小桿菌，與上述分離菌株形態(tài)一致。II 組（對(duì)照組）3 只小鼠健活，沒有致病死亡。

5）藥敏試驗(yàn)結(jié)果。分離菌株對(duì)藥敏紙片的敏感性見表2。

表2 分離菌株抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果

3 討 論

1）本研究對(duì)分離自青海省大通縣某牧民牧場(chǎng)病死牦牛實(shí)質(zhì)臟器中的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了鑒定與藥敏試驗(yàn)，通過病原菌株分離鑒定，確診為牦牛出血性敗血癥。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對(duì)頭孢哌酮、氟哌酸、紅霉素、妥布霉素敏感，對(duì)萬(wàn)古霉素、頭孢噻肟、頭孢呋新、頭孢唑啉中度敏感，對(duì)羧芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、鏈霉素耐藥。

2）牦牛出血性敗血癥是一種由多殺性巴氏桿菌為主要病原體的傳染疾病，又稱牦牛巴氏桿菌病。多殺性巴氏桿菌屬于條件性致病菌，該病原菌主要通過患病動(dòng)物的分泌物和糞便進(jìn)行傳播[1]。本病常年發(fā)生，尤其是在青海牧區(qū)，因氣溫驟降致使牦牛抵抗力下降，病原菌經(jīng)外源性和內(nèi)源性傳染侵入牦牛機(jī)體致病。

3）牦牛出血性敗血癥發(fā)病急，病程短，治療不及時(shí)極易導(dǎo)致病牛死亡。一旦發(fā)病，需要盡早治療，通過藥敏試驗(yàn)，選取對(duì)病原菌敏感藥物，如頭孢哌酮、氟哌酸等，同時(shí)采用對(duì)病原菌中度敏感藥物，如萬(wàn)古霉素、頭孢噻肟等進(jìn)行藥物交替治療，臨床療效顯著，疫情得到控制，無(wú)新發(fā)病例。

4）控制牦牛出血性敗血癥重在日常預(yù)防，一方面加強(qiáng)牦牛飼養(yǎng)管理，適當(dāng)進(jìn)行季節(jié)性補(bǔ)飼，提高牦牛群抗病力，同時(shí)嚴(yán)格衛(wèi)生消毒制度，切斷病原菌傳播[2]；另一方面對(duì)牦牛免疫接種牛出敗氫氧化鋁滅活疫苗，確保牦牛群保持較高的抗體水平，可以有效防控牦牛出血性敗血癥的發(fā)生。