王昭昕 楊 莉 盧國(guó)彥 王躍飛 張 玥,2 周 昆,2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院, 天津 300193)(2.天津中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193)

補(bǔ)骨脂是傳統(tǒng)中藥材，為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，含香豆素類、黃酮類和單帖酚類等化合物[1]，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉的功能，外用可治牛皮癬、斑禿、銀屑病等皮膚?。谎a(bǔ)骨脂應(yīng)用廣泛，僅藥典中收載的含補(bǔ)骨脂的中成藥就有30余種，其他標(biāo)準(zhǔn)和臨床醫(yī)師處方中就更多。補(bǔ)骨脂最早見(jiàn)于《雷公炮灸論》云：“性本大燥，毒?！焙笫泪t(yī)家對(duì)補(bǔ)骨脂也有論述，《開(kāi)寶本草》云：“治五勞七傷，風(fēng)虛冷，骨髓傷敗，腎冷精流及婦人血?dú)鈮櫶??！钡珜?duì)其毒性記載甚少。近年來(lái)，隨著醫(yī)藥科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)補(bǔ)骨脂的研究也越來(lái)越深入，臨床不良反應(yīng)以及毒性研究的報(bào)道也越來(lái)越多，補(bǔ)骨脂藥材乃至水提物對(duì)動(dòng)物的肝毒性也被不同的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[2-6]，但是中藥的提取方式眾多，獲取的提取物的成分和安全性也會(huì)有差別，我們對(duì)補(bǔ)骨脂的三種不同提取物進(jìn)行了口服給藥4周的大鼠毒性實(shí)驗(yàn)研究，以評(píng)價(jià)不同提取物的安全性，為后續(xù)補(bǔ)骨脂提取工藝的改進(jìn)和入藥的選擇提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 受試樣品

補(bǔ)骨脂藥材(原藥材)、補(bǔ)骨脂生藥粉、補(bǔ)骨脂下層滲漉液、補(bǔ)骨脂上層滲漉液、補(bǔ)骨脂滲漉藥渣：均為天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院王躍飛副研究員團(tuán)隊(duì)制備提供，產(chǎn)品批號(hào)：20120920。

補(bǔ)骨脂生藥粉：補(bǔ)骨脂藥材直接粉碎，制成的棕色補(bǔ)骨脂生藥粉；

補(bǔ)骨脂下層滲漉液(每克提取物折合生藥2.66 g)：補(bǔ)骨脂原藥材經(jīng)70%乙醇浸泡后滲漉，滲漉液減壓回收，靜置分層，稠浸膏與環(huán)糊精混合制得補(bǔ)骨脂提取物；

補(bǔ)骨脂上層滲漉液(每克提取物折合生藥18.43 g)：補(bǔ)骨脂原藥材經(jīng)70%乙醇浸泡后滲漉，滲漉液減壓回收，靜置分層，上層60 ℃減壓烘干，制得滲漉上層干膏提取物。

補(bǔ)骨脂滲漉藥渣(每克提取物折合生藥1.18 g)：補(bǔ)骨脂原藥材經(jīng)70%乙醇浸泡后滲漉，滲漉藥渣再次水提，60 ℃減壓烘干，制得滲漉藥渣提取物。各受試樣品成分含量如下(表1)。

表1 受試樣品成分含量Table 1 Contents of the components of the test sample

1.2 動(dòng)物及飼養(yǎng)

SPF級(jí)SD大鼠112只，雌雄各半，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0015。動(dòng)物飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK(津)2014-0002。所用飼料為全價(jià)顆粒飼料，天津市華榮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑與儀器

TBA(總膽汁酸)、CRE(血清肌酐)、TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、TP(總蛋白)、ALT(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶)、ALP(堿性磷酸酶)、ALB(白蛋白)、BUN(尿素氮)以及AST(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶)試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒(比色法)均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

離心機(jī)(賽默飛，Legend Micro17型)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，SPH-103B型)；全自動(dòng)封閉脫水機(jī)(Leica，ASP300S型)，切片機(jī)(Leica，RM2135型)；顯微鏡(OLYMPUS，BX51型)；包埋機(jī)(天津航空機(jī)電公司，BMJ-1型)；多功能酶標(biāo)儀(Tecan，InfiniteM200型)；全自動(dòng)生化分析儀(日立，7020型)。

1.4 方法

具體實(shí)驗(yàn)方法參考了文獻(xiàn)[4]中描述的中藥長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)方法。

1.4.1分組與給藥:將大鼠按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為8組：對(duì)照組(對(duì)照組與補(bǔ)骨脂水提物與水提藥渣的毒性比較研究相同)、補(bǔ)骨脂生藥3 g生藥/kg劑量組，補(bǔ)骨脂下層滲漉液6 g生藥/kg、3 g生藥/kg劑量組，補(bǔ)骨脂上層滲漉液6 g生藥/kg、3 g生藥/kg劑量組，補(bǔ)骨脂滲漉藥渣6 g生藥/kg、3 g生藥/kg劑量組，每組14只，連續(xù)灌胃給藥4周，最大給藥劑量為2015版藥典規(guī)定給藥劑量的6倍。

1.4.2一般狀況觀察:給藥期間，每周稱體質(zhì)量一次，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量；每天給藥前后觀察動(dòng)物的毛色、進(jìn)食、活動(dòng)等情況。

1.4.3血清生化檢測(cè):給藥期結(jié)束，動(dòng)物禁食不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉。由腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離得到血清，通過(guò)自動(dòng)生化儀檢測(cè)TBA、CRE、TC、TG、TP、ALT、ALP、ALB、BUN、AST。

1.4.4MDA和T-AOC的含量測(cè)定:肝臟加生理鹽水研磨制備10%的勻漿，用南京建成T-AOC和MDA試劑盒測(cè)定大鼠肝臟中T-AOC和MDA的含量。

1.4.5臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢查:剖腹小心摘取心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺稱重，計(jì)算臟器系數(shù)(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量)。切取大鼠肝臟一葉、左腎于10%中性甲醛溶液中固定，固定液為組織體積的5～10倍，固定48 h，石蠟切片，常規(guī) HE染色，光鏡下觀察組織病變。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠一般情況和體質(zhì)量的影響

給藥期間，大鼠進(jìn)食、活動(dòng)情況正常，毛色無(wú)異，各組動(dòng)物均無(wú)死亡。補(bǔ)骨脂不同提取物灌胃給藥4周對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響如下(表2,表3)：與對(duì)照組相比，雄性大鼠下層滲漉液高劑量組在第2周體質(zhì)量顯著降低；雌性大鼠滲漉藥渣高劑量組第4周的體質(zhì)量顯著升高，其他組無(wú)顯著變化。

表2 不同提取物的補(bǔ)骨脂對(duì)雄性大鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effects of Psoralen from different extractions on Body Weight of Male Rats

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

Note:*P<0.05 vs control group

表3 不同提取物的補(bǔ)骨脂對(duì)雌性大鼠體質(zhì)量的影響Table 3 Effects of Psoralen from different extractions on Body Weight of Female Rats

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

Note:*P<0.05 vs control group

2.2 對(duì)大鼠血清生化影響

與對(duì)照組比較，雄性大鼠生藥組ALT、ALP、TBA、T-CHO、ALB顯著降低；下層滲漉液高劑量組ALT、BUN顯著升高，T-CHO、ALB顯著降低；下層滲漉液低劑量組TBA、TG、T-CHO顯著降低；滲漉藥渣低劑量組ALT、TBA、ALB顯著降低；上層滲漉液高、低劑量組、滲漉藥渣高劑量組無(wú)顯著性差異。雌性大鼠生藥低劑量組ALP顯著升高；下層滲漉液高劑量組BUN顯著升高，ALB顯著降低；下層滲漉液低劑量組ALT顯著升高，CRE顯著降低；上層滲漉液高劑量組BUN顯著升高；滲漉藥渣高劑量組ALT、AST顯著降低，TBA、T-CHO、BUN顯著升高；滲漉藥渣低劑量組TP顯著升高(表4,表5)。

2.3 對(duì)大鼠肝臟MDA和T-AOC的影響

與對(duì)照組比較，雄性大鼠生藥低劑量組，滲漉藥渣高劑量組MDA顯著升高；下層滲漉液高、低劑量組，滲漉藥渣低劑量組T-AOC顯著升高。雌性大鼠生藥低劑量組，滲漉藥渣高劑量組MDA顯著升高，T-AOC顯著降低；下層滲漉液高劑量組T-AOC顯著降低；滲漉藥渣低劑量組MDA顯著降低，T-AOC顯著降低(見(jiàn)表6,表7)。

表4 不同提取物的補(bǔ)骨脂對(duì)雄性大鼠血清生化指標(biāo)的影響(一)Table 4 Effects of Psoralen from different extractions on serum biochemical parameters in Male Rats(1)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group

表4 不同提取物的補(bǔ)骨脂對(duì)雄性大鼠血清生化指標(biāo)的影響(二)Table 4 Effects of Psoralen from different extractions on serum biochemical parameters in Male Rats(2)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group

表5 不同提取物的補(bǔ)骨脂對(duì)雌性大鼠血清生化指標(biāo)的影響(一)Table 5 Effects of Psoralen from different extractions on serum biochemical parameters in Female Rats(1)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group

表5 不同提取物的補(bǔ)骨脂對(duì)雌性大鼠血清生化指標(biāo)的影響(二)Table 5 Effects of Psoralen from different extractions on serum biochemical parameters in Female Rats (2)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group

表6 不同提取物的補(bǔ)骨脂對(duì)雄性大鼠MDA的影響Table 6 Effects of Psoralen from different extractionson MDA in Male Rats

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group

表7 不同提取物的補(bǔ)骨脂對(duì)雌性大鼠MDA的影響Table7 Effects of Psoralen from different extractionson MDA in Female Rats

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01,***P<0.001

Note:**P<0.01,***P<0.001 vs control group

2.4 對(duì)大鼠臟器系數(shù)及組織病理學(xué)的影響

與對(duì)照組相比，雄性大鼠生藥低劑量組胸腺系數(shù)顯著降低而肝、腎系數(shù)顯著升高；下層滲漉液高劑量組，滲漉藥渣高、低劑量組肝、腎系數(shù)顯著升高而胸腺系數(shù)顯著降低。雌性大鼠下層滲漉液低劑量組，滲漉藥渣低劑量組肝、腎系數(shù)顯著升高而胸腺系數(shù)顯著降低；生藥低劑量組，滲漉藥渣高劑量組肝、腎系數(shù)顯著升高；下層滲漉液高劑量組肝系數(shù)顯著升高而胸腺系數(shù)顯著降低；上層滲漉液低劑量組肝系數(shù)顯著升高，其他各組的值比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表8,表9)。

光鏡下觀察，給藥組大鼠的肝臟、腎臟和生殖器官未見(jiàn)明顯的組織病變，與對(duì)照組無(wú)明顯差別。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs control group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)為研究不同提取物補(bǔ)骨脂大鼠口服給藥毒性，分別設(shè)立對(duì)照組、補(bǔ)骨脂生藥組，補(bǔ)骨脂下層滲漉液低、高劑量組，補(bǔ)骨脂上層滲漉液低、高劑量組，補(bǔ)骨脂滲漉藥渣低、高劑量組。實(shí)驗(yàn)所需補(bǔ)骨脂生藥和不同提取物的最大給藥量為2015版藥典規(guī)定的6倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，補(bǔ)骨脂生藥組肝臟臟器系數(shù)、ALP、MDA明顯升高，胸腺臟器系數(shù)、T-AOC顯著降低，再次證明補(bǔ)骨脂生藥給藥4周即對(duì)大鼠肝臟有一定的損傷。補(bǔ)骨脂下層滲漉液組肝臟臟器系數(shù)、T-AOC、ALT也顯著升高，表明補(bǔ)骨脂下層滲漉液也對(duì)肝臟有一定的損傷，但雄性大鼠T-AOC值明顯升高；補(bǔ)骨脂滲漉藥渣高劑量組肝臟臟器系數(shù)、MDA顯著升高而雌性大鼠T-AOC值顯著降低；表明補(bǔ)骨脂滲漉藥渣高劑量給藥4周對(duì)肝臟有一定的損傷，而滲漉藥渣低劑量組并沒(méi)有肝、腎毒性指標(biāo)出現(xiàn)顯著性，表現(xiàn)出較好的劑量相關(guān)性；補(bǔ)骨脂上層滲漉液沒(méi)有明顯毒性?？偨Y(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示三種不同提取物中滲漉藥渣的肝毒性最大，其次為下層滲漉液，上層滲漉液的安全性最高。

對(duì)三個(gè)不同提取物中有效成分的含量測(cè)定結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂上層滲漉液中有效成分的含量極少，其中含量最多的補(bǔ)骨脂酚也只有2.26‰，滲漉藥渣中含有較多的補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷，而補(bǔ)骨脂酚含量極少僅0.58‰，因此二者不適合用作藥用；而下層滲漉液中沒(méi)有檢測(cè)到補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量也不多，但補(bǔ)骨脂酚的含量高達(dá)58.72‰，有研究認(rèn)為，補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂中的主要毒性成分[4]。白茹玉等[8]研究結(jié)果表明，大劑量補(bǔ)骨脂素給予小鼠時(shí)，引起藥物急性毒性反應(yīng)；異補(bǔ)骨脂素可引起 HepG2 細(xì)胞內(nèi)膽汁酸升高和細(xì)胞毒性[9]；還有研究表明異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂素對(duì)小鼠肝功能有一定影響[10]；補(bǔ)骨脂乙素可抑制Tca8113細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。同時(shí)，已有研究證實(shí)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)小鼠骨質(zhì)疏松有較好的治療作用[12]，劉穎等[13]的研究表明，補(bǔ)骨脂對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松有治療作用。而補(bǔ)骨脂酚是毒性相對(duì)較小有效成分，有抗菌、抗腫瘤、降糖降血脂、抗氧化、消炎、雌激素樣等作用[14-18]。綜上，下層滲漉液更合適入藥。當(dāng)然，這一結(jié)論尚需更多的藥效和安全性評(píng)價(jià)研究來(lái)支持。