孫英富 ，張孟周 ，王帥 ，董雯雯 ，陳京偉 ，郭相伸 ，溫書恒 ，趙銳 ，官大威

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)司法鑒定中心，遼寧 沈陽(yáng) 110122；2.智慧檢務(wù)創(chuàng)新研究院 智慧司法鑒定聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110122）

損傷時(shí)間推斷一直是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。骨骼肌在人體分布廣泛，骨骼肌損傷在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中十分常見(jiàn)，因此，研究骨骼肌挫傷對(duì)損傷時(shí)間推斷具有重要意義。近年來(lái)，骨骼肌損傷時(shí)間推斷的研究主要集中于骨骼肌損傷后炎癥反應(yīng)和纖維修復(fù)過(guò)程中相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的變化。柳丹鳳等[1]通過(guò)研究證明，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）陽(yáng)性細(xì)胞率的變化可用于早期損傷時(shí)間的推斷。張小紅等[2-3]證實(shí)，卷曲受體4和核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）蛋白在骨骼肌損傷愈合過(guò)程中呈時(shí)序性變化。本課題組前期研究[4-7]證實(shí)，多形核白細(xì)胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）、單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cell，MNC）和成纖維細(xì)胞（fibroblastic cell，F(xiàn)BC）改變，以及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比值的變化與骨骼肌損傷時(shí)間具有相關(guān)性。此外，衛(wèi)星細(xì)胞中α7亞型煙堿型乙酰膽堿能受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）、配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子7（paired-box transcription factor 7，Pax7）和生肌決定因子（myoblast determination，MyoD）等蛋白在骨骼肌損傷愈合過(guò)程中呈時(shí)序性表達(dá)[8-9]。

骨骼肌挫傷后，繼發(fā)出血、水腫、壞死等一系列炎癥反應(yīng)，亦可造成與骨骼肌相連接的神經(jīng)損傷，而支配骨骼肌的終末神經(jīng)再生可促進(jìn)骨骼肌損傷的愈合[10]，在骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中具有重要意義。神經(jīng)絲（neurofilament，NF）是神經(jīng)細(xì)胞的骨架蛋白，同時(shí)參與軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，在有髓鞘的軸突中含量較多、長(zhǎng)度較長(zhǎng)、直行、無(wú)分支、呈束狀分布，是構(gòu)成運(yùn)動(dòng)單位的主要成分之一[11]。突觸囊泡蛋白（synaptophysin，Syn）是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質(zhì)，是突觸的特異標(biāo)記物之一。乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）主要存在于突觸后膜，并常被用于標(biāo)記突觸后膜。高分子量神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein-H，NF-H）及Syn是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配目標(biāo)骨骼肌必不可少的蛋白成分。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突抵達(dá)所支配的骨骼肌時(shí)失去髓鞘，其軸突反復(fù)分支，每一分支形成葡萄狀膨大，與一條骨骼肌纖維接觸，形成化學(xué)突觸連接，連接處呈橢圓形板狀膨大，即為神經(jīng)肌肉接頭（neuromuscular junction，NMJ），亦稱運(yùn)動(dòng)終板。有研究[12]指出，NMJ的缺失會(huì)導(dǎo)致骨骼肌萎縮，不能行使其正常的生理功能。只有NMJ完全再生，骨骼肌的功能才能恢復(fù)[13]。因此，本研究通過(guò)對(duì)NF-H、Syn和AChR進(jìn)行免疫熒光染色，觀察小鼠骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)NMJ的形態(tài)學(xué)變化與損傷時(shí)間的相關(guān)性，探討其作為推斷骨骼肌損傷時(shí)間指標(biāo)的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

羊抗兔NF-H多克隆抗體、羊抗兔Syn多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），驢抗兔IgG 488熒光二抗（1∶200，美國(guó)Invitrogen公司），熒光594標(biāo)記α-銀環(huán)蛇毒抗體（1∶200，美國(guó)Life Technologies公司），含DAPI抗熒光淬滅封片劑（ZLI9557，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

VT1000 S振動(dòng)切片機(jī)、DMi8激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司），DP22顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌挫傷模型及動(dòng)物分組

健康雄性C57BL/6小鼠50只，12周齡，體質(zhì)量22～25g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置方法經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

將小鼠分為10組，9組為實(shí)驗(yàn)組，1組為對(duì)照組，每組5只。參照大鼠骨骼肌急性鈍挫傷模型[14]，自制自由落體式鈍力打擊器。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（30 mg/kg）麻醉小鼠，將其后肢置于伸膝、踝背曲90°位置，應(yīng)用鈍力打擊器以3m/s的速度和壓深調(diào)控桿超出封閉螺扣2mm的長(zhǎng)度（即形變量）一次性打擊小鼠左后肢距跟骨1 cm處，致骨骼肌挫傷。挫傷后予每只小鼠以消毒飼料及蒸餾水分籠飼養(yǎng)。對(duì)照組僅施行麻醉，不進(jìn)行打擊。

1.2.2 取材及制片

分別于傷后3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d麻醉小鼠，并用生理鹽水灌流后取挫傷處腓腸肌，對(duì)照組小鼠取相同部位肌肉組織并等分為兩部分。其中一半檢材放入由磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）配制的4%多聚甲醛溶液中固定24h后用于制作石蠟切片，應(yīng)用振動(dòng)切片機(jī)將另一半檢材制作成100μm厚度的連續(xù)切片。

1.2.3 蘇木素-伊紅染色

取常規(guī)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化，用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后梯度乙醇脫水，二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片，在顯微成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察。

1.2.4 免疫熒光染色

切片用PBS沖洗3次，每次15min，再用10%驢血清封閉1h，以NF-H標(biāo)記神經(jīng)絲，Syn標(biāo)記突觸前膜，AChR標(biāo)記突觸后膜，并以其作為一抗，4℃過(guò)夜。第2天，用PBS沖洗3次，每次5 min，然后加入驢抗兔IgG 488熒光二抗（綠色熒光）和熒光594標(biāo)記α-銀環(huán)蛇毒抗體（紅色熒光）室溫孵育2 h，封片劑封片后在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

HE染色：顯微鏡下（×200）在每張切片的挫傷區(qū)及挫傷交界區(qū)（距挫傷區(qū)200 μm范圍內(nèi)）隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察骨骼肌愈合過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化。

免疫熒光染色：由于挫傷區(qū)損傷程度較重，NMJ結(jié)構(gòu)被破壞顯著，不易觀察其再生進(jìn)程，且再生進(jìn)程明顯滯后，而挫傷交界區(qū)骨骼肌細(xì)胞及NMJ結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，且神經(jīng)再生最為活躍，因此本研究選擇挫傷交界區(qū)進(jìn)行NMJ觀察和檢測(cè)。按上述方法選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)NMJ數(shù)量及其結(jié)構(gòu)的完整性情況。突觸前膜與突觸后膜成分完全重合時(shí)認(rèn)為是正常的NMJ結(jié)構(gòu)[15]，通過(guò)計(jì)數(shù)Syn染色陽(yáng)性的突觸前膜個(gè)數(shù)與AChR染色陽(yáng)性的突觸后膜個(gè)數(shù)，以兩者的比值作為評(píng)價(jià)NMJ完整性程度的指標(biāo)，取值范圍為0～100%，對(duì)照組中突觸前膜和突觸后膜的比值為100%。采用SPSS 13.0軟件，應(yīng)用方差分析對(duì)上述比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

小鼠骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)挫傷區(qū)的組織病理學(xué)改變見(jiàn)圖1。傷后3h，骨骼肌局部水腫、變性，部分肌纖維斷裂，肌間隙增寬，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)出血；傷后6 h，肌細(xì)胞形態(tài)不清，可見(jiàn)多核粒細(xì)胞，偶見(jiàn)單核細(xì)胞；傷后12h，骨骼肌胞質(zhì)進(jìn)一步均質(zhì)化，嗜伊紅染色增強(qiáng)，細(xì)胞核消失，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞增多，以多核粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主；傷后1d，骨骼肌纖維大部分胞質(zhì)均質(zhì)化、間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核細(xì)胞為主，并見(jiàn)少量多核粒細(xì)胞；傷后3 d，間質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞以單核細(xì)胞為主，并可見(jiàn)梭形成纖維細(xì)胞增生；傷后5～7 d，單核細(xì)胞數(shù)量減少，大量成纖維細(xì)胞增生，并可見(jiàn)膠原纖維和新生骨骼肌細(xì)胞形成；傷后14 d，挫傷區(qū)大量膠原纖維形成，壞死的骨骼肌被新生骨骼肌及膠原纖維取代；傷后21 d，肌細(xì)胞核邊聚，大部分骨骼肌再生完成，挫傷區(qū)仍可見(jiàn)少量膠原纖維。

挫傷交界區(qū)：傷后各時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)不同程度的骨骼肌均質(zhì)變，胞質(zhì)嗜伊紅染色增強(qiáng)，肌間隙增寬，間質(zhì)內(nèi)血管淤血。

圖1 小鼠骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)挫傷區(qū)的組織病理學(xué)改變（HE×200）

2.2 免疫熒光染色

正常NMJ在免疫熒光染色下呈“爪”樣結(jié)構(gòu)，NF-H陽(yáng)性染色的神經(jīng)絲末端與Syn陽(yáng)性染色的突觸前膜相連接，突觸前膜與AChR陽(yáng)性染色的突觸后膜完全重合（圖2A）。骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)NMJ的熒光染色結(jié)果見(jiàn)圖2B～J。傷后3～6h，大部分NMJ仍呈現(xiàn)正常結(jié)構(gòu)，少數(shù)突觸前膜出現(xiàn)崩解或部分缺失，不能與突觸后膜完全重合，偶見(jiàn)神經(jīng)絲節(jié)段性斷裂；傷后12 h，突觸前膜繼續(xù)崩解，部分NMJ中突觸前膜完全消失，可見(jiàn)神經(jīng)絲呈節(jié)段性斷裂；傷后1 d，突觸前膜少量殘存，呈不規(guī)則、不連續(xù)的碎片狀，突觸后膜較為清晰；傷后3 d，只能觀察到突觸后膜，幾乎看不到突觸前膜，無(wú)正常NMJ結(jié)構(gòu)，個(gè)別突觸后膜結(jié)構(gòu)不規(guī)則；傷后5d，NF-H染色陽(yáng)性的神經(jīng)絲再次出現(xiàn)，數(shù)量較少，分布較分散，未見(jiàn)Syn染色陽(yáng)性的突觸素；傷后7 d，神經(jīng)絲數(shù)量較多，可見(jiàn)分支，同時(shí)部分神經(jīng)絲末端可見(jiàn)突觸前膜再生，并與突觸后膜部分重合；傷后14 d，大部分NMJ突觸前膜與后膜相重合，呈正常機(jī)構(gòu)，殘存少量無(wú)突觸前膜的NMJ；傷后21d，NMJ中突觸前膜與后膜完全重合，形態(tài)與對(duì)照組大致相同，仍可見(jiàn)少量神經(jīng)絲分支存在。

骨骼肌挫傷后，NMJ中突觸前膜與后膜數(shù)量的比值開(kāi)始下降，傷后3h約為80%，傷后6h約為70%，傷后12 h為50%左右，繼續(xù)下降，傷后1 d降至10%左右，傷后3 d最低，在5%左右，之后該比值開(kāi)始上升，傷后5d在10%左右，傷后7d可達(dá)到25%，至傷后14 d再次達(dá)到50%左右，傷后21 d可達(dá)到90%，詳見(jiàn)表1。

圖2 小鼠骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)NMJ的熒光染色結(jié)果（×200）

表1 小鼠骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)NMJ中突觸前膜與后膜數(shù)量比值（n=5， ±s，%）

表1 小鼠骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)NMJ中突觸前膜與后膜數(shù)量比值（n=5， ±s，%）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別對(duì)照傷后3h傷后6h傷后12h傷后1d傷后3d傷后5d傷后7d傷后14d傷后21d前膜數(shù)/后膜數(shù)100.00±0.00 81.62±7.951）70.07±3.201）50.79±8.661）10.20±4.331）2）4.57±2.251）11.83±1.621）27.53±2.171）53.40±9.921）2）90.10±9.892）

3 討 論

骨骼肌挫傷致終末神經(jīng)損傷后，神經(jīng)軸突膜破裂，Na+和Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致軸突膜去極化，促進(jìn)破裂處再封閉。神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始分泌細(xì)胞因子促進(jìn)再生，同時(shí)損傷處及其遠(yuǎn)端由于缺乏神經(jīng)元胞體營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)而發(fā)生沃勒變性。在此過(guò)程中，軸索中斷，髓鞘降解，導(dǎo)致神經(jīng)絲和微管的崩解，同時(shí)誘導(dǎo)施萬(wàn)細(xì)胞增殖及蛋白合成增加[16]。此外，施萬(wàn)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子誘導(dǎo)損傷處原有的及血源性的單核細(xì)胞增殖分化，將損傷的神經(jīng)、髓鞘殘骸吞噬清除，形成一個(gè)適合神經(jīng)生長(zhǎng)的微環(huán)境，施萬(wàn)細(xì)胞增生形成細(xì)胞帶（即Büngner帶），引導(dǎo)近端軸芽沿Büngner帶向損傷遠(yuǎn)端生長(zhǎng)。再生過(guò)程大致分為兩個(gè)階段：（1）新生軸突按照原有的神經(jīng)管通道生長(zhǎng)；（2）形成NMJ再支配目標(biāo)骨骼肌。軸突再生時(shí)會(huì)發(fā)出多個(gè)分支同時(shí)向損傷遠(yuǎn)端延伸，接觸到骨骼肌靶點(diǎn)后產(chǎn)生接觸抑制，誘導(dǎo)多余的分支降解，最終完成神經(jīng)的再生愈合[17]。神經(jīng)愈合與骨骼肌愈合同步進(jìn)行，若神經(jīng)愈合滯后，將導(dǎo)致骨骼肌萎縮及生理功能的喪失[18]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外涌現(xiàn)出大量對(duì)NMJ再生機(jī)制的研究，不同損傷模型中的再生過(guò)程如下：在骨骼肌神經(jīng)毒素?fù)p傷模型中，注射蛛毒素或銀環(huán)蛇毒素的肌肉中，NMJ于1d內(nèi)降解完成，神經(jīng)絲消失，傷后8d再生完成[19]，神經(jīng)毒素的反應(yīng)過(guò)程較快；在坐骨神經(jīng)挫壓傷模型中，脛前肌中NMJ的突觸前膜于傷后1周完全降解，2周可見(jiàn)新生突觸前膜長(zhǎng)入，6周再生完成[20]；而缺血再灌注損傷模型中，不僅突觸前膜崩解消失（傷后1d突觸前膜降解消失，傷后7d可見(jiàn)神經(jīng)絲再生，傷后28d再生完成），部分突觸后膜也受到損傷而破碎[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠骨骼肌挫傷后1 d時(shí)突觸前膜成分大部分崩解，神經(jīng)絲連續(xù)性被破壞，突觸前膜呈碎片狀并有部分缺失，傷后3d時(shí)挫傷交界區(qū)NMJ的突觸前膜成分幾乎全部降解，傷后7d可見(jiàn)突觸前膜再生，傷后21 d NMJ再生基本完成。通過(guò)對(duì)NMJ突觸前膜與后膜數(shù)量的比值及再生形態(tài)學(xué)所見(jiàn)與損傷時(shí)間的相關(guān)性分析顯示：突觸前膜與后膜數(shù)量的比值大于20%，且可見(jiàn)突觸前膜崩解時(shí)，可以判定損傷時(shí)間為1d以內(nèi)；當(dāng)比值小于20%或比值接近0，且未檢見(jiàn)神經(jīng)絲和突觸前膜結(jié)構(gòu)時(shí)，可判定為傷后1～5d，或傷后3 d左右；比值大于20%，并可見(jiàn)神經(jīng)絲再生時(shí)，可判定為傷后7d左右；比值大于50%，并可見(jiàn)突觸前膜再生時(shí)，可判定為傷后14d左右；當(dāng)比值接近100%，且可見(jiàn)完整NMJ及正常肌纖維結(jié)構(gòu)，并伴有灶狀纖維化，可推斷損傷時(shí)間為21d左右。本研究結(jié)果表明，骨骼肌挫傷后，通過(guò)NMJ再生并結(jié)合骨骼肌的形態(tài)學(xué)所見(jiàn)更有利于損傷時(shí)間推斷。

雖然本研究證明NMJ再生過(guò)程中的形態(tài)學(xué)所見(jiàn)有望作為推斷骨骼肌損傷時(shí)間的生物學(xué)指標(biāo)之一，但仍存在不足之處：一方面，本研究采用小鼠骨骼肌挫傷模型進(jìn)行觀察，缺乏人體檢材的驗(yàn)證；另一方面，法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中不同個(gè)體或同一個(gè)體肌肉挫傷的程度、范圍等并不均一，且受體內(nèi)外多種因素的共同影響。因此，在實(shí)際應(yīng)用中要注重結(jié)合其他生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行全面評(píng)價(jià)與分析，綜合推斷損傷時(shí)間。