高晶萍 李珮瑤 王存連 張瑞華 范玉堂 程智慧 徐彤

摘? 要：目的：確定內(nèi)蒙古某奶牛場(chǎng)初生犢牛發(fā)生腹瀉并導(dǎo)致嚴(yán)重死亡的病因，以便針對(duì)性采取有效的防控措施。方法：采集發(fā)病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴以及小腸，無(wú)菌操作進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定;分離菌株純培養(yǎng)后進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果：在送檢3例犢牛肝臟、脾臟及小腸接種培養(yǎng)基上，具有大腸桿菌菌落的典型特征，生化鑒定為大腸桿菌;在1例犢牛肺接種培養(yǎng)基上分離1株符合綠膿桿菌的菌落特征，生化鑒定為綠膿桿菌。致病性試驗(yàn)顯示，大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物接種小鼠腹腔后24h內(nèi)全部死亡;綠膿桿菌菌株肉湯培養(yǎng)物也導(dǎo)致接種小鼠在48h死亡。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌對(duì)阿米卡星、頭孢哌酮和頭孢吡肟敏感;對(duì)諾氟沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明、新霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星耐藥;綠膿桿菌對(duì)頭孢吡肟、諾氟沙星、妥布霉素、慶大霉素和頭孢哌酮敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、新霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星耐藥。結(jié)論：大腸桿菌是引起該場(chǎng)犢牛腹瀉死亡的主要病原菌，在抵抗力下降的情況下，部分犢牛繼發(fā)感染了綠膿桿菌，也是導(dǎo)致死亡的原因之一。

關(guān)鍵詞：犢牛腹瀉;大腸桿菌;分離鑒定;藥敏試驗(yàn);防治

中圖分類(lèi)號(hào) S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）11-0085-3

犢牛腹瀉是犢牛常發(fā)的一種胃腸疾病，發(fā)病原因有病原性感染和營(yíng)養(yǎng)因素等。大多數(shù)犢牛腹瀉主要發(fā)生于犢牛出生后2周內(nèi)，但在環(huán)境條件較差時(shí)，3～4周齡也仍然具有較高的易感性。在傳染性因素中，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的一種主要致病菌。臨床表現(xiàn)為腹瀉、脫水，嚴(yán)重者因機(jī)體脫水、酸中毒死亡。大腸桿菌的發(fā)病率和死亡率，因飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境衛(wèi)生的不同，具有較大的差異[1-2]。犢牛腹瀉一般在氣溫驟降及陰雨連綿的時(shí)期多發(fā)，任何降低犢牛抵抗力的因素都會(huì)導(dǎo)致本病的發(fā)生[3]。近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)集約化程度的提高，犢牛大腸桿菌病的發(fā)病率日趨增加，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的威脅。

2019年2月份，內(nèi)蒙古某奶牛場(chǎng)飼養(yǎng)的犢牛發(fā)生腹瀉，引起大量的死亡，根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀懷疑為大腸桿菌，用慶大霉素、氟苯尼考和恩諾沙星等藥物后治療無(wú)效。為了進(jìn)一步確診病因，采集發(fā)病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴、小腸等到河北北方學(xué)院進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷，為臨床合理防控提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來(lái)源 內(nèi)蒙古某規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)奶牛約900余頭，采用集中發(fā)情和配種方式繁殖。2018年11月至2019年1月，在其1號(hào)和3號(hào)養(yǎng)殖棚內(nèi)出生犢牛陸續(xù)發(fā)生腹瀉，用氨芐西林鈉與慶大霉素、氟苯尼考及恩諾沙星等進(jìn)行治療，有效控制了此次犢牛腹瀉。然而，2019年2月初，該場(chǎng)2號(hào)棚陸續(xù)出生250余頭犢牛，出生不久后，部分犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便逐漸變成粥狀，內(nèi)含未消化的乳凝塊和血液，逐漸消瘦、虛弱、走路搖擺;至來(lái)校診斷時(shí)約有50%的犢牛發(fā)生腹瀉，病死率20%。剖檢變化主要在小腸，表現(xiàn)為小腸充盈、內(nèi)有液狀內(nèi)容物和灰白色的乳凝塊;腸黏膜變薄，有的嚴(yán)重出血，呈暗紅色;腸系膜淋巴結(jié)腫脹、出血。發(fā)病死亡犢牛的肺、肝、腎、脾、淋巴、小腸送檢，低溫保存，當(dāng)日檢查。

1.2 試劑與儀器 麥康凱培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染色液均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;生化反應(yīng)檢測(cè)管、藥敏紙片均購(gòu)自杭州天和微生物制劑有限公司。超凈臺(tái)購(gòu)自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus;電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠24只，由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離鑒定 將病料無(wú)菌操作、釣菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和肉湯培養(yǎng)基，置于37℃恒溫箱中24h過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)典型疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

2.2 細(xì)菌生化鑒定 將純化后的單個(gè)菌落接種于生化試驗(yàn)管中37℃培養(yǎng)24h后，觀察并記錄結(jié)果。

2.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 24只SPF小白鼠隨機(jī)分成2組，試驗(yàn)組為20只，對(duì)照組為4只。試驗(yàn)組的小鼠腹腔接種肉湯培養(yǎng)物，每只0.1mL，對(duì)照組用等量的滅菌普通肉湯進(jìn)行腹腔注射。48h內(nèi)觀察小鼠的精神狀態(tài)和記錄死亡情況。

2.4 藥敏試驗(yàn) 將分離到的菌落均勻地涂抹到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，用滅菌鑷子貼上藥敏片后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱24h后測(cè)量抑菌圈直徑的大小。結(jié)果判定參照NCCLS（2009）的[4]。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌的分離鑒定 從病料中共分離出4株細(xì)菌，分別編號(hào)為S1～S4。S1～S3在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出粉紅色、圓形凸起、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落，鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌;S4在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上長(zhǎng)出整體黃綠色的菌落，鏡檢為兩端鈍圓、長(zhǎng)短不一的革蘭陰性短桿菌。

3.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果 生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，S1～S3分離菌符合大腸桿菌的生化特性（表1）。S4分離菌符合綠膿桿菌的生化特性（表2）。

3.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 觀察接種肉湯培養(yǎng)物的小鼠，接種S1、S2、S3、S4以及S1～S4混合菌液肉湯培養(yǎng)物的小鼠，4只/組。接種S1肉湯培養(yǎng)物的4只小鼠在24h內(nèi)均死亡;S2和S3接種小鼠24h內(nèi)死亡2只，24～48h死亡2只;S4接種小鼠48h內(nèi)4只全部死亡;S1～S4混合菌液24h內(nèi)4只全部死亡。死亡小白鼠在接種12h后可見(jiàn)精神萎靡，腹瀉、被毛蓬松等癥狀。無(wú)菌條件下采取小鼠的肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，鑒定結(jié)果與分離菌相同。

3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3），分離大腸桿菌對(duì)阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢哌酮敏感，對(duì)諾氟沙星、慶大霉素、氨芐西林鈉、復(fù)方新諾明、新霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星耐藥;綠膿桿菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、諾氟沙星、頭孢吡肟、頭孢哌酮、妥布霉素敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、新霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星耐藥。

4 討論

經(jīng)細(xì)菌的分離鑒定，從送檢的3份病料中均分離出了大腸桿菌，從其中的1份病料的肺臟中分離出了綠膿桿菌。結(jié)合流行病學(xué)和臨床癥狀、小鼠的致病性試驗(yàn)以及送檢前后的臨床治療用藥情況，判定引起該場(chǎng)犢牛腹瀉死亡的主要原因?yàn)榇竽c桿菌感染。盡管1例犢牛肺部分離到綠膿桿菌且其具有較強(qiáng)的致病作用（導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)感染小鼠死亡），但是實(shí)驗(yàn)室藥敏試驗(yàn)確定為敏感的藥物如慶大霉素、諾氟沙星以及氨芐西林等在臨床治療時(shí)均未能減少犢牛死亡，因此，綠膿桿菌可能只是部分犢牛在機(jī)體抵抗力下降的情況下繼發(fā)感染的因素。綠膿桿菌主要引起水貂的出血性肺炎、或是在畜禽繼發(fā)感染[5-6]。但由綠膿桿菌引起的犢牛腹瀉不容忽視，1985年彭德勛報(bào)道過(guò)由綠膿桿菌引起犢牛腹瀉的診斷和治療[7]。因此，綠膿桿菌是否是導(dǎo)致本次犢牛腹瀉的致病菌還需進(jìn)一步研究。

腹瀉在犢牛中的發(fā)病率極高，導(dǎo)致?tīng)倥８篂a的原因有很多，主要的病原體有大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌、輪狀病毒等[8]。在治療疾病的過(guò)程中，雖然抗生素起到了重要作用，但在長(zhǎng)期使用過(guò)程中抗生素易產(chǎn)生耐藥性。在本次犢牛腹瀉的病例中，由于沒(méi)有及時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，盲目使用多種藥物，造成了犢牛大量死亡。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，采用阿米卡星配合頭孢哌酮有效控制住了本病，不再有新的病例發(fā)生。因此，臨床治療本病時(shí)，建議先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感藥物后再進(jìn)行治療。為防止?fàn)倥０l(fā)生脫水，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充5%葡萄糖生理鹽水，并在其中添加碳酸氫鈉，避免腹瀉引起的酸中毒。為保護(hù)胃腸道黏膜，可口服鞣酸蛋白或次硝酸鉍。經(jīng)過(guò)3～5d治療，即可有效控制犢牛死亡及新病例的出現(xiàn)。

大腸桿菌是一種條件性致病菌，只有在自身抵抗力弱時(shí)才會(huì)發(fā)病。這次犢牛嚴(yán)重腹瀉發(fā)生時(shí)，該地區(qū)出現(xiàn)降雪，加之壩上地區(qū)氣候寒冷，同時(shí)牛場(chǎng)環(huán)境相對(duì)較差，應(yīng)激及飼養(yǎng)管理差是導(dǎo)致此次犢牛腹瀉的主要原因，因此，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理是防治本病的重要措施。為了避免犢牛發(fā)生腹瀉，犢牛出生后應(yīng)盡早吃食初乳，增強(qiáng)自身的抗病能力;避免犢牛受潮、受寒、飲用不潔的水;母牛妊娠期間給予豐富的蛋白質(zhì)和維生素飼料，保持適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng);做好接產(chǎn)工作，母牛分娩前后徹底清洗消毒;在大腸桿菌常發(fā)的地區(qū)，可以根據(jù)血清型制備油乳劑滅活疫苗，從而進(jìn)行犢牛的免疫預(yù)防。只有采取綜合的防控措施，才能避免犢牛腹瀉的發(fā)生，提高養(yǎng)殖效益。

參考文獻(xiàn)

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[8]赫鳴睿.某牛場(chǎng)犢牛大腸桿菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷與藥敏試驗(yàn)[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2019（01）：39-43.

（責(zé)編：張宏民）