武加標(biāo)，任 敏，成菊蘭，許聯(lián)紅，戚傳平

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是病因未明的慢性滑膜炎為主的自身免疫性疾病，其特征是外周多關(guān)節(jié)、對(duì)稱性、侵襲性炎癥，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫痛從而失去活動(dòng)能力，致使關(guān)節(jié)變形甚至殘疾。盡管RA確切的發(fā)病機(jī)制仍有待闡明，但某些研究表明T細(xì)胞異常活化是RA免疫病理進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，CD4+T細(xì)胞起著特別重要的作用[1]。T細(xì)胞活化通過雙信號(hào)模型介導(dǎo)發(fā)生，其中第二信號(hào)來自共刺激分子參與途徑，而協(xié)同刺激分子作為參與激活T細(xì)胞活化的信號(hào)分子被廣泛關(guān)注。程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmed cell death-1, PD-1)是T細(xì)胞活化后晚期表達(dá)的與CD28同源的抑制性蛋白。PD-1與程序性細(xì)胞死亡蛋白配體-1(programmed death ligand 1, PD-L1)和程序性細(xì)胞死亡蛋白配體-2(programmed death ligand 2, PD-L2)相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌及其他效應(yīng)功能受抑制[2]。異常表達(dá)的共刺激分子的功能與RA自身反應(yīng)性T細(xì)胞的持續(xù)激活有關(guān)[3]，研究發(fā)現(xiàn)敲除PD-1基因的小鼠不僅增加自發(fā)產(chǎn)生狼瘡樣癥狀，而且伴發(fā)自身免疫性腎小球腎炎，脾臟腫大，產(chǎn)生自身抗體等現(xiàn)象，證實(shí)PD-1在免疫應(yīng)答中起負(fù)向調(diào)節(jié)功能[4]。已有報(bào)道活動(dòng)性強(qiáng)直性脊柱炎外周血效應(yīng)性T(effector T,Teff)細(xì)胞膜表面PD-L1的表達(dá)量顯著低于健康對(duì)照組[5]，而PD-1在RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞上的表達(dá)尚未見報(bào)道，尤其是活動(dòng)期患者至今未有研究。因此，本研究應(yīng)用流式術(shù)檢測(cè)PD-1/PD-L1在RA患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上的表達(dá)變化，并分析PD-1/PD-L1表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

納入標(biāo)準(zhǔn)：選取2015年3月至2017年4月在江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)風(fēng)濕科就診的RA患者，納入患者符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn)，均排除并發(fā)感染、惡性腫瘤、、心腦血管疾病，且所有患者均按照疾病活動(dòng)評(píng)分(Disease Activity Score 28,DAS28)評(píng)估病情，即DAS28=0.56*√(TJC28)+0.28*√(SJC28)+0.7*ln(ESR)* +0.014*GH。根據(jù)DAS28評(píng)分將患者進(jìn)一步分為中低度活動(dòng)組(2.65.1)24例。選取本院體檢中心39例健康體檢者作為健康對(duì)照組，其中男4例，女35例；年齡29～70歲，平均年齡為(51.8±20.4)歲。研究對(duì)象在年齡構(gòu)成上均具可比性。所有患者簽署知情同意書，并經(jīng)江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器：HU CD279(PD-1) PE MAB 100TST EH 12.1(100T)、HU CD274(PD-L1) PE MAB 100TST MIH 1(100T)、HU1(100T)均購于BD Biosciences公司。CD25和CD4流式抗體購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司，BD FACS CantoⅡ型流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2.2 標(biāo)本采集:CD4 FITC MAB 100TST RPA-T4(100T)、HU C25 APC MAB 100TST M-A25 分別采集活動(dòng)期RA患者和健康人全血2ml于肝素抗凝管中。

1.2.3 RA患者外周血T細(xì)胞表面PD-1與PD-L1水平檢測(cè)：使用直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。取3只流式上樣管，標(biāo)記CON、S1和S2。S1管加入CD4 FITC/PD-1 PE/CD25 APC各5μl，S2管加入CD4 FITC/PDL-1 PE/CD25 APC各5 μl，CON管加入15 μl PBS；3支流式上樣管中各加全血50 μl，混均。置室溫，避光孵育15 min。加FACSLysing溶血素(1∶10稀釋)1 ml，置室溫，避光孵育15 min。300×g離心5 min，棄上清液。加2 ml PBS，300×g離心5 min，棄上清后加300 μl PBS，上機(jī)檢測(cè)并分析結(jié)果。每管收集10 000個(gè)細(xì)胞，先在前向角散射光(FSC)-側(cè)向散射光(SSC)散點(diǎn)圖上圈定淋巴群細(xì)胞群，再固定CD4及CD25染色雙陽性細(xì)胞。FLOWJO v10.3 進(jìn)一步分析CD4+CD25+PD-1+和CD4+CD25-PD-L1+雙陽性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)各組的表達(dá)率，并分析表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、抗環(huán)瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide,ACPA)抗體的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 活動(dòng)期RA患者組和健康對(duì)照組一般資料

62例RA患者中男9例，女53例；年齡32～81歲，平均年齡為(62.9±13.8)歲，平均病程(9.7±2.8)年，DAS28平均(4.2±0.1)分；RA組RF、CRP和抗ACPA抗體陽性率分別為90.3%、93.5%和77.4%。對(duì)照組平均年齡為(51.8±20.4)歲，2組具有可比性(P>0.05)。

2.2 PD-1在RA患者和健康對(duì)照組外周血CD4+CD25+和CD4+CD25-T細(xì)胞的表達(dá)

PD-1在高度活動(dòng)組和中低度活動(dòng)組RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)率分別為(2.27±0.56)%和(1.83±1.08)%，高于健康對(duì)照組的(1.42±0.49)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 PD-1在高度活動(dòng)組和中低度活動(dòng)組的RA患者CD4+CD25-細(xì)胞的表達(dá)率分別為(10.06±4.53)%和(10.26±3.27)%，高于健康對(duì)照組的(8.70±2.21)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.3 PD-L1在RA患者和健康對(duì)照組外周血CD4+CD25+和CD4+CD25-T細(xì)胞表達(dá)率比較

PD-L1在高度活動(dòng)組和中低度活動(dòng)組RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)率分別為(2.06±0.62)%和(1.83±0.63)%，高于健康對(duì)照組(0.80±0.43)%的表達(dá)率，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PD-L1在高度活動(dòng)組和中低度活動(dòng)組RA患者CD4+CD25-T細(xì)胞的表達(dá)率分別為(4.27±1.92)%和(4.42±2.14)%，高于健康對(duì)照組(3.52±1.37)%，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.4 RA患者 PD-1/PDL1表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室檢查和疾病活動(dòng)性的相關(guān)性分析

PD-1在活動(dòng)期RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)水平與DAS28呈正相關(guān)(r=0.712,P<0.01)(圖1)。PD-L1在CD4+CD25-T細(xì)胞表達(dá)水平與DAS28無相關(guān)性，PD-1、PD-L1在RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)水平與抗CCP抗體、RF、CRP、ESR和血小板計(jì)數(shù)亦無相關(guān)性。

3 討論

RA的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制主要是輔助性T細(xì)胞(T helper cells,Th)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)間的比例失衡，提示RA因復(fù)雜的免疫耐受系統(tǒng)功能障礙所致，其中Th細(xì)胞被視為加速RA進(jìn)展重要的輔助細(xì)胞[6]。PD-1/PD-L1通路作為負(fù)性調(diào)控參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，小鼠模型證明PD-1途徑對(duì)于預(yù)防自身免疫過程至關(guān)重要[7]，研究發(fā)現(xiàn)PD-1缺陷小鼠會(huì)發(fā)展為自身免疫性關(guān)節(jié)炎；同時(shí)，體外敲除PD-1基因膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)的小鼠淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致嚴(yán)重CIA的發(fā)展，產(chǎn)生異常增多的抗原誘導(dǎo)型Thl7細(xì)胞，表明PD-1參與調(diào)控T細(xì)胞的活化途徑[8-9]。

表1 PD-1在活動(dòng)期RA患者和健康對(duì)照組外周血CD4+CD25+和CD4+CD25-T細(xì)胞的表達(dá)Table 1 PD-1 in RA condition activity group and healthy control group’s expression

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較,△P<0.01；與中低度活動(dòng)組比較,*P<0.01

表2 PD-L1在RA患者和健康對(duì)照組外周血CD4+CD25+和CD4+CD25-T細(xì)胞表達(dá)Table 2 PD-L1 in RA condition activity group and healthy control group’s expression rate

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較,△P<0.001；與中低度活動(dòng)組比較,*P>0.05

圖 1 活動(dòng)期RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平與DAS28的相關(guān)性Fig 1 Correlation between the expression of PD-1 in CD4+CD25+T cells and DAS28 in patients with active RA

CD4+CD25+T細(xì)胞作為一群具有免疫抑制功能的Treg，炎癥環(huán)境中的促炎因子能顯著抑制過繼的Treg細(xì)胞的免疫活性，可將其轉(zhuǎn)化為致病T細(xì)胞[10]。本研究表明PD-1和PD-L1在活動(dòng)組RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)較對(duì)照組和中低活動(dòng)組均增加，這種微增加可能反映體內(nèi)慢性炎癥致自身抗原的持續(xù)刺激，從而使這群細(xì)胞處于持續(xù)活化狀態(tài)，最終致使T細(xì)胞耗竭表達(dá)上調(diào)，可能提示PD-1參與活動(dòng)性RA的發(fā)病進(jìn)程。同樣,作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群，PD-L、PD-L1在活動(dòng)期RA組CD4+CD25-T細(xì)胞群表達(dá)率也較其他2組高，其上調(diào)不同于RA患者PD-1+T細(xì)胞在滑液或滑膜組織的局部高表達(dá)[9,11]，說明在細(xì)胞群表達(dá)不同反映PD-1和PD-L1表達(dá)的可塑性，而CD4+CD25+以及CD4+CD25-T細(xì)胞群的表達(dá)模式變化，提示PD-1/PD-L1協(xié)同表達(dá)在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上，進(jìn)一步說明它們抑制T細(xì)胞的功能，使其在RA活動(dòng)的疾病狀態(tài)下最大限度調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答，保證機(jī)體平衡自身應(yīng)答的調(diào)節(jié)。

已報(bào)道RA患者表達(dá)高水平可溶性PD-1(soluble programmed cell death 1,sPD-1)，且與患者TNF-α水平增加相關(guān)[9,12-13]。提示sPD-1可代表RA免疫治療的生物標(biāo)志物或靶點(diǎn)[14]。國內(nèi)報(bào)道PD-1在RA外周血PD-L1+中性粒細(xì)胞百分率高于健康人[15]，而sPD-1常存在血清或體外培養(yǎng)液中，一般用ELISA和Western等方法證實(shí)，本研究用流式術(shù)檢測(cè)PD-1/PD-L1表達(dá)是膜型且發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群表達(dá)不同與報(bào)道存在差異，這種差異可能因患者不同年齡組、病程長短或炎性狀態(tài)不同所致。本研究還發(fā)現(xiàn)部分高度活動(dòng)組RA患者的CD4+CD25+細(xì)胞群PD-1水平高表達(dá)(相比對(duì)照組)，進(jìn)一步分析這種表達(dá)特殊性一方面因?yàn)镽A作為緩解與活動(dòng)交替“慢性炎癥”疾病，CRP水平明顯增高，提示T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)機(jī)制需達(dá)到控制慢性炎癥為目標(biāo)；另一方面，PD-1表達(dá)水平可能會(huì)隨炎癥組織微環(huán)境狀態(tài)的改變而變化。另外，研究表明，PD-1在誘導(dǎo)和維持免疫耐受方面具有雙重作用[16]，PD-1/PD-L1信號(hào)通路的傳遞具有雙向性，會(huì)導(dǎo)致呈持續(xù)性表達(dá)。因此，針對(duì)部分患者需動(dòng)態(tài)分析PD-1表達(dá)的變化。

DAS28是衡量RA病情活動(dòng)的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD-1在活動(dòng)期CD4+CD25+T表達(dá)水平與DAS28呈正相關(guān)，高表達(dá)患者DAS28評(píng)分高，伴隨著關(guān)節(jié)壓痛數(shù)和腫脹數(shù)增加。炎癥指標(biāo)高，提示機(jī)體炎癥狀態(tài)下PD-1可能在活動(dòng)期RA起作用。而在活動(dòng)期RA患者CD4+CD25-T細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)率與DAS28無相關(guān)，而有報(bào)道PD-L1的抗體水平與RA患者的疾病活動(dòng)性相關(guān)[17-18]。PD-1分子在維持外周耐受發(fā)揮重要作用，因而PD-1可作為負(fù)性調(diào)控分子參與自身免疫病的發(fā)病過程，已通過PD-1基因敲除小鼠得以證明[19]。而人類PD-1首先在全基因組關(guān)聯(lián)中提出PD-1基因多態(tài)性與自身免疫性的發(fā)展[19]。因此，諸上證據(jù)有助于深入理解RA的發(fā)病機(jī)制，可利用抑制PD-1/PD-L1信號(hào)通路作為治療RA的新途徑。

綜上，與對(duì)照組相比,PD-1/PD-L1在活動(dòng)期RA患者CD4+CD25+T細(xì)胞的，表達(dá)上調(diào)，PD-1、PD-L1的表達(dá)水平與DAS28呈相關(guān)性,提示PD-1/PD-L1途徑可能經(jīng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)控機(jī)制參與RA的發(fā)生。

志謝：感謝感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李柏青教授對(duì)流式細(xì)胞術(shù)方面的指導(dǎo)及對(duì)本文的審閱修改