齊氏姬鼠-大絨鼠鼠疫疫源地內(nèi)鼠疫主要宿主動物和指示動物攜帶非鼠疫耶爾森菌的調(diào)查研究

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinaenterocolitica)、假結(jié)核耶爾森菌(Yersinapseudotuberculosis)和鼠疫耶爾森菌(Yersinapestis)是耶爾森菌屬中對人類致病的3個種[1]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染可引起自限性腸道疾病和腸外自身免疫性并發(fā)癥，全球都有分布，近些年來備受重視。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在自然界中宿主動物繁多，在野生和家養(yǎng)的溫血動物中均能發(fā)現(xiàn)。鼠疫的主要宿主嚙齒動物與指示動物犬類也都是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的重要天然宿主[2]。在鼠疫自然疫源地的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的嚙齒動物帶菌率內(nèi)呈現(xiàn)以豬為中心的同心圓分布現(xiàn)象，并與鼠疫耶爾森菌的分布具有密切關(guān)聯(lián)[3]。

近年來，齊氏姬鼠-大絨鼠鼠疫疫源地內(nèi)鼠間鼠疫持續(xù)流行，為研究該疫源地內(nèi)致病性耶爾森菌的生態(tài)分布特征，對該疫源地內(nèi)鼠疫主要宿主動物和指示動物的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌帶菌情況進行調(diào)查。

1 材料與方法

1.1樣本來源 設(shè)鼠籠捕捉鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村西坡腳耕地內(nèi)鼠疫主要宿主動物，解剖采集回盲部腸段；采集鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村、新峰村、沙子坪和古城區(qū)七河鎮(zhèn)西哨村、新民村、后山村農(nóng)家犬的肛拭子。標(biāo)本直接置于改良PBS增菌液(英國OXOID公司)內(nèi)，低溫轉(zhuǎn)運回實驗室，4 ℃冷增菌20 d。

1.2菌株分離與鑒定 根據(jù)文獻[2]，將增菌液中的培養(yǎng)物接種至CIN瓊脂(Cefsulondin-Irgasan-NovobiocinAgar)選擇培養(yǎng)基(英國OXOID公司)，經(jīng)26 ℃培養(yǎng)48 h后，挑選疑似小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌落(菌落較大，扁平，中間為深紅色，周圍有半透明圓環(huán)，邊緣明顯，呈“公牛眼”狀)，進行純培養(yǎng)，然后用法國梅里埃全自動細(xì)菌鑒定儀和API-20E生化鑒定條(法國Bio-Merieux公司)按照使用說明進行菌種的鑒定。

1.3 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物分型和血清分型

1.3.1生物分型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌根據(jù)文獻[4]生化反應(yīng)可分為1A、1B、2、3、4、5共6個生物型。

1.3.2七葉苷代謝反應(yīng)鑒定將純培養(yǎng)的菌株點種于膽鹽-七葉苷(英國OXOID公司)平板，在25 ℃培養(yǎng)24 h。若菌株能分解七葉苷，使接種點周邊培養(yǎng)基變?yōu)楹谏?，此菌株生物型?A型；若菌株不分解七葉苷，接種點周邊培養(yǎng)基不變色，則為其他生物型菌株。

1.3.3使用玻片凝集法進行血清分型分型血清(O∶3型)購買自日本生研株式會社；血清特異性單克隆抗體(O∶3型)由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所應(yīng)急室景懷琦研究員研制。

1.4小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因檢測 使用文獻[5-6]的方法對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因進行鑒定, 判斷致病性。普通PCR儀為德國senso梯度PCR儀，LabCycler Standard plus型；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化(北京)有限公司。

2 結(jié) 果

2.1樣本分離菌株鑒定結(jié)果 捕獲鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村西坡腳耕地內(nèi)齊氏姬鼠、大絨鼠、黃胸鼠共62只，采集鼠類回盲部腸段樣本62份。其中齊氏姬鼠11只，有3只攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；大絨鼠50只，有18只攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；黃胸鼠1只攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。嚙齒動物小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的攜帶率為35.5%(22/62)。采集鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村、新峰村、沙子坪和古城區(qū)七河鎮(zhèn)西哨村、新民村、后山村農(nóng)家犬171只，采集肛拭子樣本共171份。其中，小型犬30份，有3份攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；中型犬119份，有36份攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；大型犬22份，有6份攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。犬類小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的攜帶率為26.3%(45/171)。共分離到非鼠疫耶爾森菌的菌株139株，鑒定為耶爾森菌屬菌株具體結(jié)果見表1。

2.2小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物分型及血清分型結(jié)果 對分離到的139株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的菌株做七葉苷代謝反應(yīng)試驗，其中有138株被鑒定為生物1A型，占99.3%；將1株非1A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株采用活菌抗原做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水自然凝集試驗做對照，鑒定為生物3型、O∶3血清型。

2.3小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因檢測結(jié)果 利用小腸結(jié)腸炎耶爾森菌黏附侵襲位點基因(ail基因)對樣本菌株進行毒力基因檢測，檢測結(jié)果為：138株生物1A型菌株陰性，屬于非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；1株生物3型菌株為陽性，屬于致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。

表1 分離鑒定的耶爾森菌屬菌株名稱及數(shù)量
Tab.1 Name and quantity ofYersiniastrain isolated and identified

菌種嚙齒動物(62只)、陽性率 (%)犬類(171只)、陽性率 (%)齊氏姬鼠(11只)大絨鼠(50只)黃胸鼠(1只)小型犬(30只)中型犬(119只)大型犬(22只)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌7(4.8)34(29.0)2(1.6)6(1.8)80(21.1)10(3.5)假結(jié)核耶爾森菌0(0)1(1.6)0(0)0(0)0(0)0(0)克氏耶爾森菌1(1.6)2(1.6)0(0)0(0)0(0)0(0)弗氏/中間型耶爾森菌2(1.6)0(0)0(0)2(0.6)7(1.8)2(0.6)

3 討 論

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株的生物分型與其致病性密切相關(guān)，在臨床上具有重大意義。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物分型的鑒定主要依據(jù)生化反應(yīng)。有報道稱小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物1A型均為非致病性菌株[7]，本研究中的138株生物1A型菌株經(jīng)ail基因檢測全為陰性，這與該報道一致，為分離的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的優(yōu)勢菌型。有1株生物3型菌株，這與學(xué)者研究認(rèn)為我國致病性菌株的生物型以生物2型和3型為主的報道一致[8]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌可分為6種生物型，而本研究只發(fā)現(xiàn)了生物1A型和生物3型兩種型別的菌株，這可能與菌株的生物型分布具有獨特地域性特征有關(guān)。雖然僅從犬肛拭子中分離到1株生物3型菌株，占7‰(1/139)，但仍然可能存在動物致病與傳染給人類的潛在能力及流行危險，因為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌主要依靠糞-口途徑傳播，人類感染主要是通過接觸被感染動物糞便污染的食物和水[9]。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的血清型眾多，在世界上已發(fā)現(xiàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的血清型有60多個，而我國已報道的血清型有58個[2]，但具有致病性的血清型僅占少數(shù)，現(xiàn)已證實對人類有致病性的血清型有 O∶3、O∶5、O∶8等多種[4]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌血清型的分布也呈現(xiàn)獨特地域性的特征。本研究中僅發(fā)現(xiàn)1株血清O∶3型菌株，這與國內(nèi)學(xué)者研究認(rèn)為我國分離的致病性菌株僅分布于O∶3和O∶9兩個血清型別的報道一致[6,10]。該血清O∶3型菌株同時也是生物3型，這和肖玉春等[8]研究證實的生物3型是我國致病性O(shè)∶3血清型菌株的優(yōu)勢生物型的說法一致。

對致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌來說，侵襲性涉及到許多基因的表達。通過組織培養(yǎng)侵襲實驗的研究，確定了粘附侵襲位點基因(attachmentinvasionlocus,ail)是一種侵襲相關(guān)基因[11]，只存在于致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株中。ail表達的蛋白與侵襲素相似，可以介導(dǎo)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的侵襲性，與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的致病性密切相關(guān)。

動物的耶爾森菌感染只限于初感染，在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌流行的區(qū)域鼠疫耶爾森菌的流行相對較弱，這佐證了近幾年內(nèi)齊氏姬鼠-大絨鼠鼠疫疫源地內(nèi)鼠疫疫情的流行態(tài)勢：僅局限于流行鼠間鼠疫，甚至出現(xiàn)活鼠帶菌的現(xiàn)象。本研究還分離、檢測到克氏耶爾森菌、弗氏/中間型耶爾森菌。雖然這兩種耶爾森菌均為非致病性的，但能為從菌屬水平上探討不同耶爾森菌菌種之間的相互關(guān)系提供生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，為進一步深入研究該疫源地內(nèi)鼠疫菌的保存相關(guān)機制提供數(shù)據(jù)支持。

總之，研究鼠疫疫源地內(nèi)致病性耶爾森菌的分布及生物學(xué)特征具有重大意義，尤其對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的研究不容忽視，有助于探討致病性耶爾森菌在自然界長期保存、變化的機理以及相互關(guān)系，為制訂防治耶爾森菌所致相關(guān)疾病的策略提供科學(xué)依據(jù)。