張雨薇 王艷杰 張 博 尹麗麗 戴巧妹 劉 宏②* 黃樹明

傳統(tǒng)醫(yī)學認為缺血性腦病的發(fā)生建立在腎虛的病理基礎之上，亦開展了大量的從腎論治腦病的臨床及實驗研究[1]。多項研究結果顯示，中醫(yī)學益腎法對缺血性腦病顯示良好的治療效果，但其機制尚不清楚[2-5]。本研究采用永久性大腦中動脈阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)法和注射氫化可的松法建立腦缺血和腎虛模型，以雄性腦缺血模型大鼠為研究對象，采用傳統(tǒng)滋陰補腎、填精益髓的經典方劑右歸丸(YouGui Pill，YGP)進行干預，觀察其對缺血后腦損傷的修復作用，并闡明其可能的作用機制，以期從分子生物學角度探討中醫(yī)學“益腎健腦”治則的神經生物學機制，為傳統(tǒng)中醫(yī)理論的現代科學解析及臨床應用提供實驗依據，并為臨床缺血性腦病的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

選用120只無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級SD雄性大鼠(由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供)，體重(250±20)g，所有動物均在溫度為(25±1)℃，相對濕度為45%～50%的標準條件下飼養(yǎng)。將120只大鼠隨機分為假手術組(sham operation group，SOG)，15只；單純腦缺血組(simple cerebral ischemia group，SCIG)，21只；腎虛腦缺血組(renal asthenia cerebral ischemia group，RACIG)，21只；YGP低劑量組(YouGui pill low dose group，YGPLG)，21只；YGP高劑量組(YouGui pill high dose group，YGPHG)，21只；尼莫地平組(Nimodipine group，NpG)，21只。

1.2 實驗藥品與試劑

(1)實驗藥品:YGP由熟地黃24 g、山藥(炒)12 g、山茱萸(微炒)9 g、枸杞(微炒)12 g、鹿角膠(炒珠)12 g、菟絲子12 g、杜仲(姜湯炒)12 g、當歸9 g、肉桂6 g及制附子6 g的10味中藥飲片組成，飲片購于北京同仁堂藥店，由黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院制備成水煎劑，置于冰箱中(4 ℃)備用。

(2)實驗試劑:使用10%水合氯醛溶液、無菌生理鹽水、75%醫(yī)用酒精、青霉素鈉粉劑、無水乙醇、95%乙醇、二甲苯、正丁醇、石蠟、蘇木素、伊紅、氧化汞、硫酸鋁鉀、蒸餾水、冰醋酸、氨水、甲苯胺藍、中性樹膠及稀鹽酸等，氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉。

(3)生物試劑:兔抗大鼠Caspase-3抗體、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Caspase-3抗體貨號PB0813，DAB顯色試劑盒貨號AR1022。

1.3 模型制備方法

1.3.1 pMCAO大鼠模型制備

將各組大鼠進行如下操作:①大鼠的麻醉，使用10%水合氯醛溶液，以0.3～0.4 ml/100g的劑量腹腔注射[6]；②確定麻醉成功后固定、備皮及消毒手術區(qū)；③頸部正中做切口，鈍性皮膚分離筋膜和肌肉組織，在氣管深部找到右側的頸動脈鞘；④小心游離出頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)及頸內動脈(internal carotid artery，ICA)；⑤結扎ECA根部及CCA近心端，血管夾夾住CCA遠心端，虹膜剪剪一傾斜V型小口，將線栓自剪口處插入，固定好切口遠端，松開血管夾，將魚線通過ICA插至大腦中動脈開口處，至有阻力為止，根據實際情況決定是否需更換線栓；⑥手術完畢后清創(chuàng)、縫合并涂少量青霉素粉劑，預防感染。SOG大鼠除CCA不插入線栓，大鼠麻醉、固定、頸部手術、游離CCA過程均同SCIG大鼠。

1.3.2 腎虛大鼠模型制備

除SOG、SCIG外，其余各組大鼠每日上午同一時間點肌注氫化可的松注射液15 mg/kg，共14 d[7]。大鼠出現活動減少、畏寒喜暖、弓背蜷縮、食欲降低、反應遲鈍、四肢消瘦、脫毛、多尿以及體質量降低等情況，表明腎陽虛大鼠模型造模成功[8]。

1.4 實驗方法

1.4.1 生理鹽水與YGP灌胃

(1)6組大鼠于術前3 d預先進行捉拿和生理鹽水灌胃，以適應以后的捉拿及灌胃過程。于術前預先進行橫木行走實驗(beam walking test，BWT)訓練7 d，去除本身有肢體障礙以及有視覺功能障礙的大鼠。術后24 h按照1次/d開始灌胃，每隔3 d重新稱量大鼠體重，按體重調整給藥劑量，連續(xù)灌胃14 d。SOG與SCIG大鼠灌胃等體積的生理鹽水；YGPG大鼠灌胃YGP分別為5.13 g/kg和10.26 g/kg；NpG注射尼莫地平注射液0.7 mg/kg。給藥后的3 d、7 d及14 d進行BWT，檢測運動能力。行為學結束后，腦組織取材，尼氏染色法觀察尼氏小體，免疫組化法檢測Caspase-3的蛋白表達。

1.4.2 大鼠大腦皮質區(qū)神經元的尼氏小體

行為學結束后，腦組織取材。先將腦組織經先包埋過程制成蠟塊，進行切片，其流程為洗滌→常規(guī)脫水→組織包埋→切片→撈片→烘片。將切片進行尼氏染色，常規(guī)脫蠟→染色:將切片浸入60 ℃、1%的甲苯胺藍溶液中浸染30 min，自來水沖洗，脫水至透明后封片。光鏡下觀察大腦皮質區(qū)神經細胞尼氏體的情況，神經細胞胞漿中藍色顆粒即為尼氏小體。

1.4.3 大鼠大腦皮質區(qū)Caspase-3的蛋白表達

免疫組化法檢測大腦皮質區(qū)Caspase-3的蛋白表達[11]方法如下。

(1)標本制備:①取預先用石蠟包埋好的組織，經過輪轉式切片機將組織按常規(guī)約4 μm厚度石蠟切片，然后經過漂片、撈片、烘片等工序，準備好切片；②常規(guī)脫蠟，用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各5 min，100%乙醇2 min、95%乙醇2 min、85%乙醇1 min和70%乙醇1 min，PBS沖洗3次，每次5 min；③用3%的過氧化氫(H2O2)滅活內源性過氧化物酶；④熱修復抗原，將裝有切片的檸檬酸緩沖液染色盒放入微波爐中，高火5 min，然后中火10 min，再高火5 min，完成修復后冷卻至室溫沖洗，沖洗后參照說明書滴加一抗(Caspase-3)，按照1∶50或1∶100比例進行稀釋，放入濕盒內4 ℃過夜或者37 ℃放置1.5 h；⑤按照說明書滴加二抗(辣根酶標記山羊抗兔)IgG后，將其放入37 ℃電熱溫箱中30 min后沖洗；⑥使用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，取DAB染色液，將1 ml蒸餾水加入與試劑盒中的試劑A、B、C各一滴混勻，滴加到切片上，室溫孵育8～15 min，鏡下觀察切片的顯色反應，顯色結束后用流水沖洗終止顯色反應；⑦蘇木素復染1 min，水洗；⑧梯度酒精脫水、透明后封片，待2 d充分干燥后光鏡下觀察數字成像記錄。

(2)應用Image Pro Plus 6.0免疫組化分析軟件進行累積光密度(integral optical density，IOD)法分析。

1.5 檢測與評價指標

(1)神經功能缺陷評分:大鼠術后清醒狀態(tài)下，參照Longa評分原則[9]評分，1～3分為造模成功，選擇pMCAO造模成功的有效模型進行實驗，在pMCAO造模后的3 d、7 d及14 d不同的時間點，進行BWT評分，以此評價各組大鼠精細運動的恢復情況。

(2)檢測各組大鼠運動能力:于術后第3 d、7 d及14 d進行BWT，記錄各時間點的評分，評價精細運動能力[10]。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，各組數據均以均值±標準差(x-±s)表示。多組數據差異性檢驗用單因素方差分析，組間均數兩兩比較應用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 YGP對大鼠一般狀態(tài)的影響

各缺血組大鼠與SOG比較，體重明顯減輕，走路時步態(tài)搖晃，自主活動明顯減少，毛發(fā)干枯雜亂，進食、飲水量明顯較少，眼瞼下垂，損傷側眼分泌物明顯增多；與各缺血組比較，YGPG大鼠狀態(tài)明顯改善。

2.2 各組大鼠運動能力檢測結果

pMCAO術后2 h左右，大鼠開始清醒，pMCAO造模成功的大鼠表現出明顯的運動障礙。pMCAO造模3 d后，SCIG大鼠與SOG比較，BWT評分顯著降低，其差異有統(tǒng)計學意義(t=7.86，P＜0.01)，表明大腦中動脈阻塞造成了大鼠精細運動出現障礙；RACIG與SCIG比較，大鼠BWT評分顯著降低，其差異有統(tǒng)計學意義(t=3.61，P＜0.05)，表明腎虛和大腦中動脈阻塞同時發(fā)生，大鼠精細運動障礙加重；YGPG及NpG與RACIG比較，大鼠BWT評分升高。pMCAO造模后7 d與3 d比較，SOG大鼠BWT評分無明顯變化，缺血組大鼠的BWT評分升高，表明運動功能開始恢復。pMCAO造模后7 d，SCIG與SOG比較，大鼠BWT評分顯著降低，其差異有統(tǒng)計學意義(t=8.40，P＜0.01)；與RACIG相比，YGPG(即YGPLG及YGPHG)大鼠BWT評分顯著升高，其差異有統(tǒng)計學意義(t=4.59，t=5.46；P＜0.01)(高劑量組P＜0.01，低劑量組P＜0.05)，但仍較SOG降低，表明YGP能夠促進缺血后運動功能的恢復，但是用藥時程短，藥效尚未完全發(fā)揮。pMCAO造模后14 d與7 d比較，各組BWT評分明顯升高。SCIG與SOG比較，BWT評分仍然低于SOG，其差異有統(tǒng)計學意義(t=5.33，P＜0.01)；YGPLG、YGPHG與RACIG比較，BWT評分明顯升高，其差異有統(tǒng)計學意義(t=2.67，t=3.02；P＜0.01)，見表1。

2.3 尼氏染色結果

SOG大鼠尼氏染色為清晰的藍色塊狀，皮質區(qū)神經細胞輪廓清晰完整，細胞內尼氏體較豐富，各缺血組大鼠與SOG比較，皮質半暗帶區(qū)細胞排列松散，大量神經元消失，殘存的神經元胞核固縮，尼氏體明顯減少；RACIG與SCIG比較，神經元損傷明顯加重，尼氏體嚴重減少；YGPHG與RACIG比較，神經損傷

表1 各組大鼠BWT評分比較(x-±s)

圖1 各組大鼠腦皮質區(qū)尼氏小體(尼氏染色，×100)

2.4 各組大鼠皮質區(qū)Caspase-3表達檢測

各組大鼠DAB染色，光鏡下觀察到Caspase-3表達于皮質和海馬區(qū)的神經元，選擇右側皮質區(qū)進行測量。DAB染色陽性細胞的胞漿、胞核內呈棕黃色及黃褐色顆粒。而用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)替代一抗孵育的陰性，切片著色非常淺或不著色。Caspase-3的蛋白表達量越多，顏色越深。Caspase-3的蛋白表達結果顯示:SOG大鼠Caspase-3的蛋白表達較弱，IOD較??；SCIG與SOG相比，大鼠Caspase-3的蛋白表達明顯上調，其差異有統(tǒng)計學意義(t=10.38，P＜0.01)；RACIG與SCIG相比，大鼠Caspase-3的表達明顯增多，其差異有統(tǒng)計學意義(t=13.84，P＜0.01)；YGPHG與RACIG相比， 大鼠缺血皮質區(qū)的Caspase-3的蛋白表達均明顯下調，其差異有統(tǒng)計學意義(t=6.97，P＜0.01)，見表2和圖2。

3 討論

近年來，缺血性腦血管病的發(fā)病出現逐年攀升和日趨年輕化的令人擔憂趨勢，尤其繼發(fā)于該病的致死、致殘及復發(fā)率極高嚴重困擾世界，該病已經成為急待解決的社會問題。因此，迫切需要找到治療和預防缺血性腦血管疾病的有效措施。目前，缺血性腦血管病的治療方法仍然很有限，現代醫(yī)學尚無良好的防治對策。傳統(tǒng)醫(yī)學認為，缺血性腦血管病的發(fā)生與“腎精虧虛”密切相關。益腎治則是根據傳統(tǒng)中醫(yī)理論制定的臨床預防和治療腦部疾病的最重要、最基本的治則，對于缺血性腦病如腦梗死等展現出不容置疑的治療效果。但是迄今為止，“益腎健腦”治則的神經生物學機制尚未完全明了，因而本研究中將腎虛腦缺血損傷同時發(fā)生與單純腦缺血損傷進行對比，其結果顯示，腎虛可明顯加重腦損傷；選取補腎的經典方劑YGP作為治療藥物對腦缺血進行干預，其結果顯示，YGP對缺血后腦損傷具有一定的修復作用。在此結果基礎上，進一步探究YGP發(fā)揮作用的分子機制。

表2 各組大鼠皮質區(qū)Caspase-3的IOD

圖2 各組大鼠腦皮質區(qū)Caspase-3的表達(DAB，×200)

本研究采用被廣泛公認、可有效模擬人類缺血性腦血管病理生理過程的pMCAO法建立腦缺血模型。pMCAO術后，造成大鼠大腦中動脈供應的皮質腦區(qū)出現損傷，皮質區(qū)與機體的運動功能密切相關，因而大鼠出現精細運動功能的障礙，表現出與臨床上缺血性中風癥狀相似的行為學改變。BWT被廣泛用以檢測大鼠的運動協(xié)調能力，作為評價缺血后腦損傷程度及觀察藥物療效的重要指征。本研究中大鼠BWT評分顯示，缺血后運動評分降低，精細運動能力減弱；腎虛與腦缺血同時發(fā)生時，BWT評分較單純缺血明顯降低，動物運動障礙亦更加明顯，表明腎虛可加重腦缺血損傷。YGP干預后，BWT評分升高，運動障礙明顯改善，提示YGP可對抗缺血后腦損傷。

為探究運動障礙的原因所在，本研究采用尼氏染色技術進一步從微觀上進行直觀的形態(tài)學觀察加以印證。結果顯示，pMCAO造成的缺血梗死灶出現在皮層下或者紋狀體區(qū)，梗死中心區(qū)細胞變性壞死，因而淡染偏于白色，梗死半暗帶細胞丟失嚴重，排列紊亂，水腫現象明顯，同時尼氏小體數量減少，表明缺血對腦組織造成了形態(tài)和功能上的損傷性改變。腎虛后腦組織形態(tài)和功能上損傷明顯加重，而YGP治療后，損傷明顯改善，由此從形態(tài)學上證實YGP對缺血性腦損傷有確切的治療作用。

近年的研究表明，缺血后腦損傷的發(fā)生是氨基酸的興奮毒性、能量代謝障礙、自由基的產生、鈣超載、炎性反應及凋亡等諸多因素綜合引起的級聯(lián)反應[12]。缺血半暗帶區(qū)神經細胞凋亡在缺血損傷中的作用日益受到重視，抗凋亡治療途徑成為保護缺血腦組織的新切入點。凋亡過程的啟動是在多種復雜因素的調節(jié)下發(fā)生，凋亡過程主要通過線粒體和死亡受體通路被啟動，通路上的促凋亡及抑凋亡基因雙重調控著凋亡過程[13]。Caspase家族作為凋亡的啟動者和執(zhí)行者作用關鍵，而Caspase-3是家族成員中觸發(fā)級聯(lián)反應的樞紐[14]。因此，本研究選擇Caspase-3為切入點進行研究，其結果顯示，大鼠缺血后皮質區(qū)Caspase-3蛋白表達明顯增加，與苗光新等[15]的研究結果一致，而YGP可使上調的Caspase-3蛋白表達明顯下降。

本實驗研究從大鼠的行為學、形態(tài)學以分子生物學實驗上的逐級相互補充印證，證實補腎方劑YGP不失為治療缺血后腦損傷的良方，亦證實其發(fā)揮腦保護作用的可能機制之一是抑制缺血半暗帶區(qū)神經細胞的凋亡過程。YGP發(fā)揮腦保護作用的其他可能機制，尚需進一步的研究。