黑小斌，李 歡，李依民，沈 霞，高 靜，顏永剛，張 崗

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，西安 712046)

ATP酶(ATPase)是一類對小陽離子以及磷脂具有特異性的轉(zhuǎn)運蛋白。植物ATPase因轉(zhuǎn)運Zn+、Cu+、Ca2+、Na+、K+、Mn+、H+等離子特性而分為P1～P5 五種類型[1]。H+-ATPase屬于P3類型，可水解ATP產(chǎn)生能量而進(jìn)行逆濃度梯度運輸H+，又稱為質(zhì)子泵。根據(jù)亞細(xì)胞定位差異，H+-ATPase主要分為線粒體內(nèi)膜和葉綠體類囊體膜F型(Factor-type)、液泡膜V型(Vacuolar-type)、質(zhì)膜P型(Plasma membrane-type)3種類型[2]。

P型H+-ATPase通過磷酸化或去磷酸化水解ATP建立電化學(xué)梯度并形成離子和代謝物跨膜轉(zhuǎn)運的原初動力，被稱為植物細(xì)胞的“主宰酶”[3]。研究表明，P型H+-ATPase與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)，廣泛參與植物細(xì)胞pH穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞伸長、氣孔開閉及響應(yīng)環(huán)境脅迫等生物學(xué)過程[4]。極度缺磷時，擬南芥P型H+-ATPase AHA家族成員高度表達(dá)，AHA2在根伸長區(qū)調(diào)節(jié)初生根的伸長，AHA7調(diào)控根毛形成[5]。在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中過量表達(dá)AHA2增強了光誘導(dǎo)的氣孔開放程度并促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的生長[6]。轉(zhuǎn)NpPMA4的煙草耐鹽能力顯著提高[7]。此外，P型H+-ATPase還參與調(diào)控植物-微生物互作。在水稻、苜蓿-叢枝菌根共生系統(tǒng)中，OsHA1和MtHA1能促進(jìn)宿主對無機(jī)磷養(yǎng)分的吸收[8]。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科最為珍稀的石斛屬多年生草本植物，以新鮮或干燥莖藥用，有益胃生津、滋陰清熱等多種功效，是重要的名貴中藥材之一[9]。鐵皮石斛因多種活性成分而具備多種藥理活性，石斛多糖作為其指標(biāo)成分之一，具有抗衰老、抗炎、抗腫瘤和提高免疫力等作用[10]。前期，本研究組構(gòu)建了真菌侵染石斛種子共生萌發(fā)的抑制性差減雜交cDNA文庫，篩序獲得大量差異基因[11]。其中，2條序列C1168和C223，分別為750 bp和 1 149 bp，與植物H+-ATPase家族成員相似性大于84%。鑒于P型H+-ATPase在植物生理代謝過程中的重要作用，本研究以這2條序列為基礎(chǔ)，利用RACE克隆鐵皮石斛2個P型H+-ATPase基因全長DoPMA1和DoPMA2，進(jìn)行表達(dá)模式和生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步發(fā)掘其分子功能與機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和取樣

野生鐵皮石斛采自浙江金華(2017年10月)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)張崗教授鑒定為蘭科石斛屬鐵皮石斛。鐵皮石斛幼苗正直營養(yǎng)生長時期，株高(10±2)cm，取根、莖、葉，液氮速凍后置于 -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和cDNA合成

按照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒(北京愛德萊)說明提取各樣品總RNA，RQ1Rnase-free DNaseI (Promega, USA)消解去除基因組DNA；NanoDropTM2000(Thermo Fisher, USA)測定RNA質(zhì)量、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。使用M-MLV Reverse Transcriptase kit(Promega, USA)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RACE反應(yīng)和RT-PCR驗證

BLASTx分析表明C1168編碼一段H+-ATPase的中間肽段，N端和C端都不完整，因此需要進(jìn)行3′-RACE和5′-RACE克隆DoPMA1全長。C223編碼H+-ATPase N段317個氨基酸，C端缺失，因此需進(jìn)行3′-RACE克隆DoPMA2全長。根據(jù)C1168和C223序列設(shè)計基因特異引物，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clotech, Japan)說明書，與試劑盒UPM引物組合進(jìn)行各自RACE反應(yīng) (表1)。

表1 引物及其序列Table 1 Primer and sequences used in this study

1.4 序列分析

使用相關(guān)在線網(wǎng)絡(luò)工具對DoPMA1和DoPMA2基因及編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用NCBI的BLASTx和ORF Finder分析cDNA序列；用InterProScan、PROSITE和PROSITE SCAN分析2個基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和基元；用Protparam和SOPMA分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)；用SignalP 4.0和TMHMM預(yù)測信號肽和跨膜區(qū)域；用Plant-mPLoc進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。利用DNASTAR 7.0對氨基酸序列進(jìn)行比對分析；借助MEGA 7.0構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.5 實時熒光定量PCR分析

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

經(jīng)過2輪RACE反應(yīng)，DoPMA15′-RACE、DoPMA13′-RACE和DoPMA23′-RACE的第2次PCR，分別獲得預(yù)期長度的目標(biāo)條帶(圖1)，經(jīng)克隆、測序分別產(chǎn)生長1 801 bp 、1 586 bp、1 303 bp的3條序列，分別與EST原始序列拼接，獲得2條cDNA序列，分別為3 366 bp和3 374 bp。BLASTx分析顯示二者與GenBank中已注冊植物質(zhì)膜ATPases家族成員有較高的一致性(>76%)，因此，分別定名為DoPMA1和DoPMA2，提交GenBank獲得注冊號為KU160470和KU160471。DoPMA1的開放閱讀框ORF(open reading frame)長2 922 bp，5′-UTR 181 bp，3′-UTR 263 bp；DoPMA2ORF長2 856 bp，5′-UTR 198 bp且具有uORF(13～93 bp)，3′-UTR 320 bp。2個基因cDNAs末端均含有真核生物特有的polyA結(jié)構(gòu)，起始密碼子附近堿基序列AAGATGG和AAAATGG遵循KOZAK規(guī)則，即A/GNNATGG[13]。BLASTn分析還顯示DoPMA1和DoPMA2全長cDNAs與鐵皮石斛基因組Predicted H+-ATPase(LOC110100541、LOC110111407)[14]相似度達(dá)到99%，進(jìn)一步說明RACE獲得2個基因全長的可靠性(圖1)。

M.DL 2000; 1.DoPMA1-5′ RACE;2.DoPMA1-3′RACE;3.DoPMA2-3′RACE

圖1DoPMA1和DoPMA2基因RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of full lengthDoPMA1andDoPMA2RACE amplicons

2.2 組織表達(dá)特異性分析

分別提取鐵皮石斛根、莖、葉樣品的總RNA，利用qPCR技術(shù)檢測2個基因的組織表達(dá)模式。圖2結(jié)果表明，DoPMA1和DoPMA2基因在3種組織中的相對表達(dá)量存在差異，分別在莖中、葉中表達(dá)量最高。以葉為校正樣本，DoPMA1在莖中的相對表達(dá)量為葉中的2.98倍，根中次之，為其1.95倍，葉中最低；DoPMA2在根中的相對表達(dá)量為葉中的0.86倍，莖中最低，為葉中的0.65倍。

2.3 蛋白理化特性分析

PROTPARAM預(yù)測DoPMA1和DoPMA2基因編碼蛋白質(zhì)的分子式分別為C4821H7685N1289O1392S34和C4731H7542N1254O1360S33，包含973和951個氨基酸殘基，分子質(zhì)量107.06 ku和 104.78 ku，等電點6.30和6.11。蛋白正電殘基(Arg+Lys)為107和104，負(fù)電殘基(Asp+Glu)為114和112，不穩(wěn)定系數(shù)為38.12和 35.03，脂肪系數(shù)為102.81和102.80，親水性系數(shù)為0.065和0.095。SOPMA分析表明， DoPMA1和DoPMA2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋(alpha helix, 48.61%和50.47%)、延伸鏈(extended strand, 15.01%和14.83%)、隨機(jī)卷曲(random coil, 31.35%和29.76%)及少量的β轉(zhuǎn)角(beta turn, 5.04%和4.49%)組成。

2.4 蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

InterProScan分析表明， DoPMA1與DoPMA2蛋白均含有2個保守的P型ATPase結(jié)構(gòu)域、5個H+轉(zhuǎn)運ATPase基序、1個E1-E2 ATPase磷酸化位點(表2)。PROSITE Scan分析表明，2個蛋白均含有一定數(shù)目的酰胺化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點、蛋白激酶C的磷酸化位點、N-肉豆蔻?；稽c和N-糖基化位點(表2)。

SignalP 4.0分析表明,2個蛋白均無信號肽序列，不隸屬分泌蛋白。TMHMM分析 DoPMA1蛋白存在8個跨膜域(68～90, 105～124, 252～274, 289～311, 657～679, 721～743, 808～830, 840～973)，DoPMA2蛋白存在10個跨膜域(66～88, 98～120, 242～264, 279～301, 641～669, 673～690, 711～733, 755～774, 787～809, 819～836)。Plant-mPLoc預(yù)測2個蛋白都定位在質(zhì)膜。

圖2 qPCR分析 DoPAM1和 DoPAM2基因的組織表達(dá)Fig.2 Tissue-specific expressions of DoPMA1 and DoPMA2 genes using qPCR analyses

結(jié)構(gòu)域和基序Domains and motifs氨基酸位點Amino acid sites DoPMA1 DoPMA2P型ATPase結(jié)構(gòu)域P-ATPase domain111～359,573～677101～350,563～676H+-轉(zhuǎn)運ATPase基序H+-transporting ATPase motif455～473,570～586,598～614,629～654,783～804445～463,560～576,588～604,619～644,760～781E1-E2 ATPase磷酸化位點E1-E2 ATPase phosphorylation site341～347331～337酪氨酸激酶磷酸化位點Tyrosine kinase phosphorylation site202～209386～392cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點cAMP and cGMP-dependent phosphoryla-tion sites of protein kinases324～327314～317酰胺化位點Amidation site278～281,533～536523～526酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點Phosphorylation sites of casein kinase Ⅱ4～7,40～43,122～125,284～287,327～330,378～381,422～425,449～452,626～629,803～806,922～9258～11,39～42,112～115,143～146,193～196,317～320,356～359,368～371,412～415,447～450,616～619,751～754,854～857,864～867,901～904蛋白激酶C的磷酸化位點Phosphorylation sites of protein kinase C167～169,213～215,241～243,313～314,323～325,340～342,415～417,508～510,518～520,533～535,646～648,665～667,871～873,918～920,947～949157～159,203～205,303～305,313～315,330～332,498～500,523～525,636～638,655～657,705～707,740～742,747～749,848～850,863～865,864～866,897～899, 901～903, 926～928N-肉豆蔻?；稽cN-Nutmeg acylation site130～135,296～301,388～393,480～485,538～543,614～619,697～702,725～730,729～734,775～780,839～844,865～870,909～914,960～965120～125,286～291,470～475,528～533,604～609,687～692,715～720,719～724, 816～821N-糖基化位點N-glycosylation site118～121,447～450,656～659,717～72014～17,108～111,646～649

2.5 蛋白多序列比對和進(jìn)化樹構(gòu)建

運用DNAStar 7.0的MegAlign對DoPMA1、DoPMA2與多種植物H+-ATPase蛋白序列比對分析。圖3結(jié)果表明，DoPMA1與小蘭嶼蝴蝶蘭PePMA1(XP_020577941)、水稻OSA8(AJ440219)、煙草NpPMA4(Q03194)、玉米ZmPMA2(NP_001292777)、水稻OSA7(AJ440218)和擬南芥AHA2(P19456)等蛋白的相似性分別為92.8%、73.0%、72.8%、72.7%、72.7%。DoPMA2與NpPMA4、ZmPMA2、OSA7、AHA2、OSA8、PePMA1的相似性分別為86.3%、86.1%、85.2%、84.1%、74.1%、72.6%。DoPMA1與DoPMA2相似性為73.4%，都具有2個高度保守的P型ATP酶結(jié)構(gòu)域，符合其家族結(jié)構(gòu)特點。

采用MEGA 7.0鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建DoPAM1、DoPAM2編碼蛋白與擬南芥(11個)、水稻(10個)、煙草(6個)、玉米(16個)、苔蘚(6個)、酵母(2個)和穴兔Oryctolaguscuniculus(1個)等物種共54個H+-ATPases蛋白的分子進(jìn)化樹。圖4結(jié)果表明，以穴兔P2型(非P3型)ATPase SERCA2a為外類群，釀酒酵母SaccharomycescerevisiaePma1、裂殖酵母SchizosaccharomycespombeSchop1蛋白單獨聚為一支，其他植物H+-ATPases聚為一大支。植物H+-ATPases又可聚為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5大分支，DoPMA1與AHA1、NpPMA4、OSA7等H+-ATPases聚在Ⅴ支，DoPMA2與OSA8、AHA7、MHA7等聚在Ⅱ支，這與植物質(zhì)膜H+-ATPases家族分子進(jìn)化一致[3]。

實線和虛線分別為DoPMA1和DoPMA2的ATPase結(jié)構(gòu)域；方框為磷酸化位點 Full lines and dot line indicates the P-type ATPase domains of DoPMA1 and DoPMA2, respectively; the box shows the phosphorylation site;A.擬南芥Arabidopsisthaliana；Do.鐵皮石斛Dendrobiumofficinale；Np.煙草Nicotianaplumbaginifolia；Os.水稻Oryzasativa；Pe.小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsisequestris；Zm.玉米Zeamays

圖3 DoPMA1和DoPMA2蛋白與不同植物PMAs蛋白序列比對
Fig.3 Sequence alignments of DoPMA1 and DoPMA2 with PMAs proteins from other plants

A .擬南芥Arabidopsisthaliana；Do.鐵皮石斛Dendrobiumofficinale；M.玉米Zeamays；Mp.地錢Marchantiapolymorpha；Np.煙草Nicotianaplumbaginifolia；Os.水稻Oryzasativa；Pma1、Schpo1.釀酒酵母、裂殖酵母 H+-ATPase Pma1, Schpo1 - fromSaccharomycescerevisiaeandS.pombeH+-ATPase；SERCA2a.穴兔P2型(非P3型)ATPaseOryctolaguscuniculusP2 type (non-P3 type) ATPase

圖4 DoPMA1和DoPMA2與植物H+-ATPase蛋白家族進(jìn)化樹
Fig.4 Phylogenetic tree of DoPMA1 and DoPMA2 with H+-ATPases from various plants

3 討 論

質(zhì)膜H+-ATPase作為植物細(xì)胞主宰酶，自1972年首次在胡蘿卜懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)[1]后，其基因鑒定、基因表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)與活性及生物學(xué)功能等方面有大量報道。目前，質(zhì)膜H+-ATPase基因家族在擬南芥[4-5]、煙草[6]、棉花[15]等植物中分離與鑒定，研究揭示它們參與調(diào)控植物體生長發(fā)育、次生代謝及逆境適應(yīng)等眾多生理過程。本試驗利用RACE從鐵皮石斛中分離出DoPMA1和DoPMA2cDNA全長，BLASTX分析其與GenBank中已注冊植物PMA基因同源性較高，均高于76%；編碼蛋白具有H+-ATPase家族保守的P型ATPase結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點，分別有8和10個跨膜域，介于植物P型H+-ATPase跨膜域8～12之間[1]；2個蛋白不含信號肽且預(yù)測定位在質(zhì)膜，佐證了其為質(zhì)膜蛋白，并具有轉(zhuǎn)運特殊的分子、離子及信號傳遞等作用；進(jìn)化樹分析2個基因分別隸屬于Ⅴ、Ⅱ分支，與已報道的植物H+-ATPase分子進(jìn)化關(guān)系一致[16]。這些結(jié)果說明成功分離到了鐵皮石斛DoPMA1和DoPMA2，且均屬于P型H+-ATPase編碼基因。

多家族成員以及高度同源性決定了H+-ATPases家族基因表達(dá)的多樣性以及功能特異性，這與其植物生理代謝各過程密切相關(guān)。大量研究報道了植物H+-ATPases基因的表達(dá)特征。棉花中GhAH1,2,4-8在雄蕊中表達(dá)，而GhAH14，15在莖中表達(dá)，且不同發(fā)育階段P型H+-ATPase酶的表達(dá)模式也有不同[15]。煙草PMA6在參與分泌的葉短毛頭部以及發(fā)育中的葉和腋花莖與莖相連的皮質(zhì)薄壁組織中表達(dá)，PMA9基因主要在不定根和腋芽的頂端分生組織以及莖的韌皮組織表達(dá)[17]。番茄LhA1-7在各器官中特異性表達(dá)，LhA8在正常培養(yǎng)、礦物質(zhì)缺乏或高鹽脅迫下幾乎都不表達(dá)，而在被真菌浸染的菌根中高量表達(dá)[18]。本試驗利用qPCR對石斛PMA基因進(jìn)行組織表達(dá)模式檢測，結(jié)果表明，DoPMA1基因在莖中表達(dá)量最高，而DoPMA2在葉中表達(dá)量最高，二者在石斛不同部位差異表達(dá)，說明DoPMA1、DoPMA2通過不同的表達(dá)調(diào)控方式參與了鐵皮石斛的生長發(fā)育和形態(tài)建成。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示擬南芥、煙草、水稻等植物54個質(zhì)膜H+-ATPase基因聚為5個亞類。Ⅰ和Ⅱ分支基因在植物中高度表達(dá)，而其他3個分支基因在植物正常生長條件下表達(dá)量低或在特定細(xì)胞類型中表達(dá)[16]。煙草NpPMA4屬于Ⅱ分支，在許多細(xì)胞類型中均有表達(dá)，尤其在根毛、表皮和保衛(wèi)細(xì)胞，參與礦質(zhì)營養(yǎng)，韌皮部負(fù)荷和氣孔調(diào)控等生理過程[19]。在低pH條件下，水稻OSA1、OSA3、OSA7、OSA8和OSA9表達(dá)增強，導(dǎo)致H+-ATPase濃度增加以調(diào)控是水稻根系適應(yīng)低pH[20]。在低磷脅迫下，擬南芥P型H+-ATPase基因AHA7介導(dǎo)根毛區(qū)細(xì)胞H+外流在根毛形成過程中發(fā)揮重要作用，AHA2主要調(diào)控根初生伸長生長[5]。本研究分子系統(tǒng)進(jìn)化揭示DoPMA1與AHA1、NpPMA4、OSA7等H+-ATPases聚在Ⅴ支，DoPMA2與OSA8、AHA7、MHA7等H+-ATPases聚在Ⅱ支，據(jù)此推測DoPMA1和DoPMA2可能參與鐵皮石斛的生長發(fā)育及抗逆生理。研究還證實H+-ATPase基因的表達(dá)調(diào)控與菌根共生關(guān)系密切[8,21]。蒺藜苜蓿MedicagotruncatulaP型H+-ATPase基因MHA1受菌根真菌侵染誘導(dǎo)且在叢枝中特異表達(dá)，MHA2、MHA3則組成型表達(dá)[21]。DoPMA1和DoPMA2基因片段分離自鐵皮石斛種子共生萌發(fā)cDNA文庫[11]，說明這2個基因可能參與調(diào)控石斛種子共生萌發(fā)?？傊?，其具體的功能與作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。