孫超超，葛麗萍,，任國(guó)鵬，李潤(rùn)植

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所， 山西太谷 030801；3. 北方功能油料樹(shù)種培育與研發(fā)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太谷 030801)

續(xù)隨子(EuphorbialathyrisL.)又名千金子、菩薩豆、小巴豆等，屬大戟科大戟屬的1a生或2a生草本植物[1-2]，原產(chǎn)于歐洲[3]。續(xù)隨子種子含油量較高，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為45%～60%，主要成分包括棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)、亞麻酸(18∶3)等，其中油酸(18∶1)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高達(dá)總油脂的84%以上。油酸作為不飽和脂肪酸，有利于人體消化吸收、軟化血管、防止血栓形成等作用[4]，還可以降低人體血液中膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低動(dòng)脈硬化發(fā)生的概率[5]。相關(guān)研究表明，續(xù)隨子種子油脂與理想柴油替代品C19H36O2的分子組成類似[6-7]，是一種經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值較高的生物質(zhì)能材料[8]，因此，續(xù)隨子也被譽(yù)為“石油植物”。而目前關(guān)于續(xù)隨子種子油脂代謝的研究甚少，其油脂生物合成及調(diào)控機(jī)制的研究也未見(jiàn)報(bào)道。

植物油脂主要以三酰甘油(Triacylglycerol，TAG)的形式貯藏在種子中，三酰甘油的合成是由細(xì)胞內(nèi)一系列的酶促反應(yīng)完成的，其中二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶1(Diacylglycerol acyltransferase，DGAT1)是催化植物三酰甘油(TAG)合成最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶[9-10]，它催化?；?CoA鏈上的脂酰基轉(zhuǎn)移到sn-1,2-二酰甘油(DAG)分子的sn-3碳原子上生成三羧酸甘油酯[11]。已有研究表明，DGAT1能夠提高種子含油量，而對(duì)該酶的研究被認(rèn)為是提高油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳途徑[12-16]。例如，在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)中超表達(dá)旱金蓮(TropaeolummajusL.)的TmDGAT1可使擬南芥種子油質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高3.5%[12]；在油菜(BrassicanapusL.)種子中超表達(dá)油菜的BnDGAT1可使種子含油量提高14%[13]；Zheng等[14]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)高油玉米(ZeamaysL.)DGAT1基因可使玉米種子含油量、油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高24.9%和84.5%。目前，煙草[15]、油菜[13]、蓖麻[16]等油料植物的DGAT1基因相繼被克隆研究，而針對(duì)續(xù)隨子ElDGAT1基因的克隆及功能分析尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)依托續(xù)隨子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從續(xù)隨子種子中克隆獲得ElDGAT1基因，利用生物信息學(xué)方法分析ElDGAT1蛋白的序列特征，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)研究該基因在不同器官中的表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究ElDGAT1基因的功能及續(xù)隨子種子油脂的生物合成積累機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用續(xù)隨子種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院苗圃，分別取根、莖、葉、花及種子發(fā)育的3個(gè)不同時(shí)期S1(開(kāi)花后15 d)、S2(開(kāi)花后30 d)、S3(開(kāi)花后45 d)，液氮速凍后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.3 ElDGAT1蛋白的基本結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析ElDGAT1基因編碼的氨基酸序列和開(kāi)放閱讀框(ORF)運(yùn)用在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析；ElDGAT1蛋白的基本理化性質(zhì)借助ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析軟件；跨膜區(qū)和信號(hào)肽的分析分別采用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)；利用NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)ElDGAT1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；ElDGAT1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三維結(jié)構(gòu)建模分別利用SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用MEGA 7.0多序列比對(duì)軟件構(gòu)建續(xù)隨子及其他物種DGAT1蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并根據(jù)同源性來(lái)預(yù)測(cè)ElDGAT1蛋白的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 ElDGAT1基因克隆

使用高保真酶對(duì)續(xù)隨子S3時(shí)期種子cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離結(jié)果顯示(圖1)：獲得長(zhǎng)度為1 530 bp的目的條帶，割膠回收目的片段純化并測(cè)序，后續(xù)將測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。

M.DL2000 Marker；1.ElDGAT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物ElDGAT1gene amplification product

圖1ElDGAT1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果
Fig.1 Electrophoresis of amplified PCRproduct ofElDGAT1gene

2.2 ElDGAT1蛋白的基本結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)對(duì)ElDGAT1基因開(kāi)放閱讀框分析可知(圖2)：ElDGAT1基因全長(zhǎng)為2 376 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)1 530 bp，共編碼509個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)ElDGAT1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，其化學(xué)分子式為C2675H4121N691O702S31，分子質(zhì)量為58.19 ku，等電點(diǎn)pI為8.89，不穩(wěn)定系數(shù)為51.25，脂溶系數(shù)為101.67，親水性系數(shù)為0.284，推測(cè)ElDGAT1蛋白為疏水性膜結(jié)合蛋白。跨膜區(qū)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)存在9個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，不存在信號(hào)肽；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

NCBI-CDD在線預(yù)測(cè)ElDGAT1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，圖3表明：ElDGAT1蛋白在第61～506位氨基酸具有特定匹配的結(jié)構(gòu)域PLN02401(diacylglycerol acyltransferase)，屬于MBOAT膜蛋白家族(MBOAT superfamily)，該家族含有多種?；D(zhuǎn)移酶，具有特定的?；D(zhuǎn)移功能，據(jù)此預(yù)測(cè)ElDGAT1蛋白同樣具有酰基轉(zhuǎn)移功能。

PLN02401.二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶特定匹配的結(jié)構(gòu)域 Diacylglycerol acyltransferase specific hits；MBOAT superfamily.膜結(jié)合O-?；D(zhuǎn)移酶超家族 Membrane bound O-acyl transferase

圖3 ElDGAT1蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析
Fig.3 Analysis of the domain of ElDGAT1 protein

運(yùn)用SPOMA對(duì)ElDGAT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)可知：ElDGAT1蛋白由α-螺旋 (47.74%)、β-轉(zhuǎn)角(3.73%)、延伸鏈(11.00%)和無(wú)規(guī)則卷曲(37.52%)4種結(jié)構(gòu)元件組成。使用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)ElDGAT1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4-a)，其三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板6bug.1膜蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(圖4-b)相似度為18.92%，它包含D-丙氨酸載體蛋白(D-alanyl carrier protein)和D-丙氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DltB(D-alanyl transfer protein DltB)，且屬于膜結(jié)合的O-?；D(zhuǎn)移酶超家族(MBOATs)，這與NCBI-CDD對(duì)ElDGAT1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果相符，據(jù)此推測(cè)ElDGAT1蛋白具備二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶功能區(qū)，即有?；D(zhuǎn)移功能。

利用MEGA7.0軟件對(duì)續(xù)隨子及烏桕(Triadicasebifera)、橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、油桐(Verniciafordii)、麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)等DGAT1的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，為更加真實(shí)地反映植物DGAT1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程，本研究以拉曼被孢霉的DGAT蛋白作為外類群。結(jié)果顯示(圖5)：續(xù)隨子與同為大戟科的蓖麻、麻瘋樹(shù)、油桐、烏桕、橡膠樹(shù)及木薯這6種同科植物被聚在同一個(gè)分支中。而在這個(gè)分支中，續(xù)隨子與烏桕親緣關(guān)系最近，構(gòu)成了一個(gè)小分支，同源性高達(dá)86%。此外，續(xù)隨子與橡膠樹(shù)和木薯的同源性 次之。

2.3 ElDGAT1基因在不同器官中的表達(dá)特性

由圖6可知，ElDGAT1基因在續(xù)隨子的根、莖、葉、花及種子中均有表達(dá)，但在不同器官中的表達(dá)量有所差異。ElDGAT1基因在種子中的表達(dá)量相對(duì)較高，其種子的S1、S2、S3 3個(gè)時(shí)期的表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)；根系和葉中的表達(dá)量低于其他器官，且根中表達(dá)量最低；而在莖和花中的表達(dá)量略低于S1時(shí)期。

3 討 論

續(xù)隨子是一種開(kāi)發(fā)前景廣闊的新型能源油料作物[19]，且其脂肪酸組分與理想柴油替代品的分子組成相似，是中國(guó)生物燃油發(fā)展的理想原料[20-21]。研究表明，DGAT是植物油脂合成途徑中催化三酰甘油合成的關(guān)鍵酶，對(duì)于調(diào)控種子油脂合成發(fā)揮著重要作用[22]。

本試驗(yàn)分離鑒定續(xù)隨子ElDGAT1基因，并獲得了續(xù)隨子中編碼ElDGAT1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。ElDGAT1基因cDNA序列全長(zhǎng)2 376 bp，CDS序列長(zhǎng)1 530 bp，共編碼509個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)ElDGAT1蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，為疏水性膜結(jié)合蛋白，不存在信號(hào)肽，含有9個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，具有PLN02401結(jié)構(gòu)域，屬于MBOAT蛋白超家族，這與前人在玉米[14]、煙草[15]、大豆[23]等植物中DGAT1的分析結(jié)果相似。ElDGAT1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，其中 α-螺旋最多，占47.74%；其三維結(jié)構(gòu)與模板6bug.1膜蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相似度為 18.92%，且該模板有2個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，具備二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶功能區(qū)，進(jìn)一步表明該蛋白有酰基轉(zhuǎn)移功能。基于DGAT1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示：續(xù)隨子與同科植物烏桕的親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)86%，與橡膠樹(shù)和木薯的同源性次之，而這4種植物同屬于大戟科，即系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果和傳統(tǒng)分類劃分相吻合，表明不同植物間蛋白同源性分析可為進(jìn)一步分析其親緣關(guān)系提供一定的參考。

圖5 ElDGAT1與不同物種DGAT1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic analysis of ElDGAT1 and other DGAT1 proteins from different species

小寫字母表示在0.05水平方差分析的差異顯著性 Lowercase letters indicates significant difference at 0.05 level

圖6 不同器官中ElDGAT1基因表達(dá)特性分析
Fig.6 Relative expression level ofElDGAT1gene in different organs

續(xù)隨子ElDGAT1基因在種子發(fā)育的3個(gè)時(shí)期上調(diào)表達(dá)，表明ElDGAT1基因在續(xù)隨子積累油脂的種子中，隨著種子的發(fā)育ElDGAT1基因的表達(dá)量也逐漸升高，這與本課題組元博[24]近年來(lái)對(duì)續(xù)隨子生長(zhǎng)發(fā)育旺盛時(shí)期其種子油脂積累特性的研究結(jié)果相符。qPCR檢測(cè)顯示：ElDGAT1基因在續(xù)隨子不同器官中均有表達(dá)，且在種子中表達(dá)量最高，遠(yuǎn)高于葉片。另有研究表明，在油料作物種子發(fā)育階段，油脂積累速率與DGAT表達(dá)情況之間存在明顯的正相關(guān)性[10]。例如，同科植物蓖麻RcDGAT1的研究表明，在蓖麻種子油脂積累的高峰期，隨著RcDGAT1活性增強(qiáng)，種子油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著增加[25]。在大部分高等植物中，DGAT1與種子發(fā)芽、幼苗發(fā)育以及TAG合成等過(guò)程均有密切關(guān)系，并且在植株的各器官中均表達(dá)，其表達(dá)情況有明顯差異。例如，同科植物蓖麻RcDGAT1在各器官中均有表達(dá)，而旱金蓮TmDGAT1只在發(fā)育的種子中表達(dá)[12]。另外，DGAT1基因在許多雙子葉植物，如大豆、油菜等在植株中的表達(dá)情況與模式植物擬南芥相似[26-28]，擬南芥AtDGAT1在種子萌發(fā)、幼嫩的花芽和花瓣中表達(dá)量明顯高于葉和莖[26]，這與續(xù)隨子ElDGAT1基因在莖和花中的表達(dá)量明顯高于根和葉片，在種子不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)有所不同，這表明ElDGAT1基因在續(xù)隨子中有其獨(dú)特的表達(dá)特性。目前，煙草[15]、油菜[16]、大豆[23]、蓖麻[25]等植物的DGAT1均已被克隆研究，并對(duì)其功能做了相關(guān)驗(yàn)證。本研究對(duì)續(xù)隨子的ElDGAT1基因也成功克隆，但對(duì)其功能的驗(yàn)證還需后續(xù)更深入的研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)克隆獲得了續(xù)隨子ElDGAT1基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析了該基因的理化性質(zhì)，利用qPCR技術(shù)研究ElDGAT1基因在續(xù)隨子不同器官中的表達(dá)譜。結(jié)果表明：ElDGAT1基因ORF為 1 530 bp，編碼509個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其編碼的蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，且含有9個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，具有酰基轉(zhuǎn)移酶的功能。另外，續(xù)隨子積累油脂的種子中ElDGAT1基因表達(dá)量高于其他器官，而且隨著種子的發(fā)育表達(dá)量升高。本試驗(yàn)研究了續(xù)隨子中ElDGAT1基因在油脂合成積累過(guò)程中的表達(dá)特性，為ElDGAT1基因的功能鑒定以及后續(xù)續(xù)隨子中調(diào)控油脂合成高表達(dá)基因的轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供依據(jù)。