農(nóng) 倩，張?chǎng)垼x 玲，廖仕同，覃麗萍

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】裂殼菌(Schizotheciumsp.)作為深色有隔內(nèi)生真菌(Dark Septate Endophyte, DSE)的一個(gè)分類單元[1]，廣泛分布于林地[2]、重金屬礦區(qū)[3]、甘蔗種植區(qū)[4]、荒漠[5]和沙地[6]等生態(tài)環(huán)境的植被中，能定殖于多種植物根系中，形成真菌與根系的共生復(fù)合體。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)極端或特殊生境中的DSE對(duì)促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)，提高耐受環(huán)境脅迫能力等方面有都發(fā)揮著重要作用[7-9]。裂殼菌L-14為本研究組分離自甘蔗根際土壤的一株深色有隔內(nèi)生真菌，將其接種至甘蔗或香蕉組培苗，能顯著提高植株的株高、鮮重或干重，表現(xiàn)出良好的促生效果[10-11]，且接種后的香蕉植株對(duì)香蕉枯萎病的防治效果顯著[11]，顯示出良好的發(fā)展應(yīng)用潛力。對(duì)L-14菌株原生質(zhì)體制備與再生進(jìn)行研究，對(duì)進(jìn)一步揭示其在植株中的定殖分布規(guī)律、闡明其促生和生防作用機(jī)理具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】不同真菌的由于生物學(xué)特性差異，原生質(zhì)體的制備與再生條件也有所不同，常用的細(xì)胞壁降解酶有崩潰酶、裂解酶、纖維素酶、蝸牛酶和葡聚糖酶等，酶解溫度多數(shù)為26～30 ℃，酶解時(shí)間根據(jù)菌株特點(diǎn)差異較大[12-13]，另外穩(wěn)滲劑的選擇也影響原生質(zhì)體是否易于呈現(xiàn)分散狀態(tài)[14]的關(guān)鍵因素，一般都需要探索及優(yōu)化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】合適的制備條件有利于提高原生質(zhì)體的形成率，從而提高轉(zhuǎn)化效率，目前有關(guān)裂殼菌原生質(zhì)體制備與再生的最適條件尚未明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過探討不同降解酶液濃度組合、酶解時(shí)間、酶解溫度及滲透壓穩(wěn)定劑種類對(duì)裂殼菌原生質(zhì)體制備的影響，同時(shí)篩選適合的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基，建立高效的裂殼菌原生質(zhì)體制備和再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

裂殼菌菌株L-14由本研究組分離保存；PDA培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g、加水至1 L；YEPG培養(yǎng)基[15]：酵母提取物3.0 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂粉15.0 g、加水至1 L；PDS培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、蔗糖182.0 g、瓊脂8.0 g，加水至1 L；YEPS培養(yǎng)基：酵母提取物3.5 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖200.0 g，瓊脂粉15.0 g，加水至1 L；崩潰酶、裂解酶、蝸牛酶、纖維素酶購自北京索萊寶科技有限公司；STC溶液含1.2 mol/L山梨醇、50 mmol/L CaCl2、10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，使用0.22 μm微孔過濾器過濾除去雜質(zhì)。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌絲體的制備

取純化培養(yǎng)的L-14菌株，用接種刀剁成細(xì)小菌塊接入YEPG培養(yǎng)液中，28 ℃、110 r/min培養(yǎng)7 d后，過濾掉大顆粒菌絲團(tuán)，收集孢子懸浮液，離心后再次用無菌水懸浮。吸取1 mL懸液至60 mL YEPG培養(yǎng)液中，28 ℃、10 r/min培養(yǎng)，待看到明顯菌絲后，過濾收集菌絲體，并用滅菌的0.7 mol/L NaCl溶液沖洗3次，滅菌濾紙吸干水分。

1.3 原生質(zhì)體的制備

取上述收集的菌絲體200 mg加入2 mL裂解液中，30 ℃、80 r/min裂解4.0 h，用3層滅菌擦鏡紙過濾，濾液4 ℃、4000 r/min離心10 min，取沉淀加入10 mL STC溶液，4 ℃、4000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用STC溶液調(diào)整濃度為1×106個(gè)/mL，分裝保存在-80 ℃冰箱待用。

1.4 酶解液種類對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

以預(yù)冷的滅菌0.7 mol/L NaCl溶液配制不同酶解液組合，常溫70 r/min溶解30 min，經(jīng)0.22 μm微孔過濾器過濾滅菌(表1)。采用1.3方法進(jìn)行菌絲裂解，并于裂解開始后，每隔30 min用血球計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)原生質(zhì)體，計(jì)算產(chǎn)量，每處理重復(fù)3次。

1.5 酶解溫度和滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

采用0.7 mol/L的NaCl為滲透壓穩(wěn)滲劑，以1.4中獲得的最優(yōu)酶解液組合分別在25、30、35和40 ℃下，80 r/min酶解5.0 h，計(jì)數(shù)不同處理原生質(zhì)體的產(chǎn)量；在最優(yōu)酶解液組合和酶解溫度下，分別以0.7 mol/L的NaCl、KCl、山梨醇和蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑，80 r/min酶解5.0 h后計(jì)數(shù)不同處理原生質(zhì)體的產(chǎn)量，每處理3次重復(fù)。

1.6 原生質(zhì)體的再生

取1×104個(gè)/mL的原生質(zhì)體200 μl，分涂布在PDA、YEPG、1和2號(hào)再生培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，記錄單菌落生長(zhǎng)數(shù)量。原生質(zhì)體再生率=(固體培養(yǎng)基上小菌落數(shù)量-對(duì)照小菌落數(shù)量)/原生質(zhì)體數(shù)量×100 %。采用DPS軟件以Duncan’s新復(fù)極差法(P≤0.05)進(jìn)行各處理平均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)。

表1 不同酶解液的組分Table 1 The enzyme combinations

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶液組合對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

由圖1可知，不同種類的細(xì)胞壁降解酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量釋放效果不同，混合酶液(組合3、4)的酶解效率高于單一類酶(組合1、2)。酶解5.0 h后，不同組合降解所得原生質(zhì)體數(shù)量之間均存在顯著差異，其中組合1降解所得的原生質(zhì)體數(shù)量為11.90×105個(gè)/mL，顯著高于組合2；組合4原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著高于上述2種單一酶類，組合3原生質(zhì)體產(chǎn)量最多，達(dá)19.73×105個(gè)/mL，顯著高于其他組合。

2.2 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

隨著酶解時(shí)間增加，各組合酶液的原生質(zhì)體產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)(圖2)，其中組合1、組合2和組合3的最優(yōu)酶解時(shí)間為5.5 h，此時(shí)各組合原生質(zhì)體產(chǎn)量分別為13.07×105、10.73×105和20.87×105個(gè)/mL，組合酶液組合4在酶解4.5 h時(shí)已達(dá)到原生質(zhì)體最大產(chǎn)量15.77×105個(gè)/mL。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level, the same as below圖1 不同降解酶組合對(duì)裂殼菌原生質(zhì)體數(shù)量的影響Fig.1 Influences of different enzyme combinations on the protoplast release of Schizothecium sp.

圖2 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different enzymatic time on the yield of protoplast

2.3 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

以組合3進(jìn)行酶解時(shí)發(fā)現(xiàn)，在30 ℃、80 r/min條件下酶解5.0 h獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最高，達(dá)20.10×105個(gè)/mL，與其他溫度處理間差異顯著(圖3)。

2.4 不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

4種滲透壓穩(wěn)定劑配制的酶液獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量各不相同(圖4)。通過顯微鏡計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，利用無機(jī)溶劑(NaCl、KCl)作為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)原生質(zhì)體較為分散，而有機(jī)溶劑(山梨醇、蔗糖)制備的原生質(zhì)體易聚集成團(tuán)，其中采用0.7 mol/L的NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑獲得原生質(zhì)體數(shù)量最多，達(dá)到18.43×105個(gè)/mL，比其他處理顯著增加。

2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響

菌株L-14的原生質(zhì)體在顯微鏡下呈透明圓球狀，直徑約2～5 μm(圖5A)。將原生質(zhì)體涂布在PDA、PDS、YEPG和YEPS培養(yǎng)基上，均能生長(zhǎng)出菌落(圖5B)，其中YEPG和YEPS培養(yǎng)基上的菌絲顏色稍淺。通過計(jì)數(shù)菌落數(shù)發(fā)現(xiàn)，利用PDS培養(yǎng)基的原生質(zhì)體再生率可達(dá)10.65 %，顯著高于其它類型培養(yǎng)基(圖6)。

圖3 不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different enzymatic temperature on the yield of protoplast

圖4 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different osmotic stabilizer on the yield of protoplast

圖5 裂殼菌L-14原生質(zhì)體形態(tài)及其再生菌落Fig.5 The protoplast and regeneration colony of Schizothecium sp. L-14

3 討 論

真菌原生質(zhì)體制備過程包含細(xì)胞壁的酶解與原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓平衡兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而不同真菌細(xì)胞壁構(gòu)成存在差異，在酶液選擇上也各有不同。沈慧敏等[14, 16]研究發(fā)現(xiàn)采用崩潰酶+裂解酶+蝸牛酶組合酶解小麥光腥黑粉菌及小麥矮腥黑粉菌時(shí)，獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，陳亮等[17]采用崩潰酶+裂解酶進(jìn)行蘋果爛腐病菌原生質(zhì)體制備也取得良好的效果。本研究通過比較不同的酶液組合對(duì)裂殼菌L-14原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)崩潰酶比裂解酶獲得的原生質(zhì)體數(shù)量多，表明崩潰酶對(duì)裂殼菌的細(xì)胞壁降解作用更顯著；崩潰酶+裂解酶混合進(jìn)行細(xì)胞壁酶解比使用單一酶類效果要好，這可能是不同酶在作用時(shí)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高了細(xì)胞壁的降解效率；崩潰酶+裂解酶+蝸牛酶組合降解細(xì)胞壁時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量低于崩潰酶+裂解酶組合，猜測(cè)酶成分過高時(shí)會(huì)對(duì)原生質(zhì)膜產(chǎn)生一定損傷，導(dǎo)致原生質(zhì)體的破碎解離，表明并非酶成分越豐富酶解效果越顯著。

研究發(fā)現(xiàn)，制備真菌原生質(zhì)體時(shí)，隨著酶解時(shí)間增加，原生質(zhì)體數(shù)量會(huì)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)[16-17]，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究基本一致。原生質(zhì)體達(dá)到最大產(chǎn)量后下降的原因可能是酶液隨著作用時(shí)間變長(zhǎng)而活力降低，新釋放的原生質(zhì)體數(shù)量少于自身破碎解離的量所導(dǎo)致。另外，本研究中崩潰酶+裂解酶+蝸牛酶組合在酶解4.5 h后達(dá)到原生質(zhì)體最大產(chǎn)量，時(shí)間比最佳酶組合(崩潰酶+裂解酶)快1.0 h，但隨后原生質(zhì)體數(shù)量急劇減少，酶解7.0 h后，原生質(zhì)體僅有7.43×105個(gè)/mL，數(shù)量顯著低于最佳酶組合，表明該酶組合可能對(duì)原生質(zhì)膜存在一定破壞作用，不利于原生質(zhì)體的保存。

滲透壓穩(wěn)定劑是原生質(zhì)體維持膜內(nèi)外壓力平衡、保持活力的重要介質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)利用無機(jī)溶劑作為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)原生質(zhì)體較為分散，而有機(jī)溶劑制備的原生質(zhì)體易聚集成團(tuán)，與沈慧敏等[14, 16]的研究結(jié)果一致。另外也有報(bào)道采用無機(jī)溶劑與有機(jī)溶劑相混合作為穩(wěn)滲劑，并獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體[18]，上述方法是否適用于裂殼菌原生質(zhì)體的制備保存有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。已報(bào)道的用于真菌原生質(zhì)體再生的培養(yǎng)基配方種類較多，本研究發(fā)現(xiàn)PDS配方較利于裂殼菌原生質(zhì)體的再生，獲得的再生率顯著高于其它類型培養(yǎng)基，前人的研究發(fā)現(xiàn)該配方亦適用于蘋果爛腐病菌[17]及木霉[19]等真菌的原生質(zhì)體再生。

圖6 不同培養(yǎng)基上的原生質(zhì)體再生率Fig.6 The regeneration rate of protoplast in different medium

4 結(jié) 論

初步構(gòu)建了裂殼菌L-14原生質(zhì)體制備和再生體系：菌株經(jīng)YEPG液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，使用0.7 mol/L的NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑配置濃度各為20 mg/mL的崩潰酶+裂解酶復(fù)合酶液，在30 ℃、80 r/min酶解5.5 h后可獲得較好的原生質(zhì)體數(shù)量，使用PDS培養(yǎng)基較利于裂殼菌原生質(zhì)體的再生。