高雨靈，尹啟令，李天雪，周 甜，楊 蓉，褚洪龍

(1. 曲靖師范學(xué)院 云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心， 云南 曲靖 655011；2. 瑞麗農(nóng)場管理委員會(huì)， 云南 德宏 678600)

木棉(BombaxceibaL.)隸屬錦葵科(Malvaceae)木棉屬(Bombax)，是熱帶、南亞熱帶典型的指示性落葉植物，廣泛分布于亞洲、非洲和澳大利亞[1]，在我國的云南、貴州、廣西、廣東等省區(qū)亞熱帶地區(qū)均有分布[2]。木棉具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其纖維、木材、花、皮、葉、根、種籽等均可利用，有廣泛的工業(yè)、藥用、食用和觀賞價(jià)值[1,3]。最新研究表明，木棉籽油是良好的生物柴油原料，擁有潛在巨大的能源開發(fā)利用價(jià)值[4]。木棉除了具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值外，還具有巨大的生態(tài)學(xué)價(jià)值。據(jù)報(bào)道，木棉是優(yōu)良的市政綠化樹種，能夠降低城市空氣污染[5]。在以干熱為顯著特點(diǎn)的干熱河谷地區(qū)，木棉是當(dāng)?shù)厝郝涞膬?yōu)勢種或常見種[6]，反映其對當(dāng)?shù)貧夂蚓哂辛己玫倪m應(yīng)性，具有優(yōu)良的逆境生存能力[7]。我國木棉分布的干熱河谷主要位于西南橫斷山區(qū)及其東部毗鄰區(qū)，包括云南、四川、廣西、貴州等地，大部分分布在云南境內(nèi)，尤其是四大江河(元江、怒江、金沙江、瀾滄江)的下部河谷[8]。該地區(qū)光熱資源豐富，氣候炎熱少雨，水土流失嚴(yán)重，生態(tài)十分脆弱，寒、旱、風(fēng)、蟲、草、火等自然災(zāi)害特別突出，土地石漠化嚴(yán)重[9,10]。在該區(qū)域通過推廣木棉種植可以取得生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益的有效統(tǒng)一[1,11]。目前，木棉基因組測序已經(jīng)完成[12]，關(guān)于木棉的相關(guān)研究正在蓬勃發(fā)展[12～15]。

自然條件下，木棉種子霉變率極高，達(dá)到了54.0%[7]。在實(shí)驗(yàn)室中，我們發(fā)現(xiàn)在木棉種子催芽的過程中極易被污染，種子萌發(fā)率和幼苗成活率極低。本研究以木棉種子為材料，在排除外來污染源的條件下探討6種消毒劑對木棉種子消毒效果、萌發(fā)和幼苗生長的影響，旨在找出適合木棉種子消毒的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

木棉(B.ceibaL.)種子，采自云南保山怒江壩(N 24°55′31.97″，E 98°52′36.57″)。

用無菌水按照下面濃度配制6種消毒劑(配制器皿高壓高溫滅菌處理)：NaClO(有效氯含量為10%)；H2O2(30%，w/v)；CuSO4(1%，w/v)；HgCl2(0.1%, w/v)；KMnO4(0.3%, w/v)；多菌靈(50%可濕性粉劑500倍液)。

培養(yǎng)基質(zhì)：將瓊脂粉和蒸餾水按照15g∶1L配比加熱融化后配制成水瓊脂，每個(gè)組培瓶加入30 mL水瓊脂，于高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min。

1.2 消毒處理

超凈工作臺中，將木棉種子(300粒)用上述消毒液消毒30 min；無菌水清洗3次，每次清洗3 min，清洗后用無菌吸水紙吸干種子表面殘留的無菌水。將消毒后的木棉種子接種到含有30 mL水瓊脂(15 g·L-1)的組培瓶中，每瓶10粒，種子均勻分散于組培瓶中，每個(gè)處理30瓶；以無菌水按上述流程處理的種子作為對照。置于組培間(22～27℃，光/暗周期為14 h/10h)培養(yǎng)。

1.3 指標(biāo)測定

培養(yǎng)過程中每24 h觀察、記錄并統(tǒng)計(jì)種子的污染率、萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)。種子萌發(fā)以胚根長出1 mm為標(biāo)準(zhǔn)。污染率和發(fā)芽率的計(jì)算公式如下：污染率(%)=污染種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；萌發(fā)指數(shù)GI=∑(Gt/Dt)(Gt為第t日的萌發(fā)數(shù)，Dt為相應(yīng)的萌發(fā)日數(shù))。持續(xù)觀察12 d，并在第14天統(tǒng)計(jì)幼苗死亡率，幼苗死亡率(%)=死亡幼苗數(shù)/發(fā)芽種子數(shù)×100%。每個(gè)處理隨機(jī)選取10株幼苗，用直尺測定株高和主根長，用電子天平稱量幼苗的鮮重，并計(jì)數(shù)根的分叉數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0(IBM，Chicago，USA)分析，用單因子方差分析(One．Way ANOVA)不同處理間污染率、萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)和幼苗生長指標(biāo)的差異性，用Prism 7.0(GraphPad Software，CA，USA)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑的消毒效果

由圖1可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，木棉種子的污染率也隨之增加，但不同消毒處理間有顯著性差異(P<0.05)(表1)。盡管培養(yǎng)后期，木棉種子污染率都達(dá)到了80%以上，但是1.0% CuSO4、0.1% HgCl2和多菌靈消毒處理的木棉種子污染率低于對照組，尤其是培養(yǎng)到第2、3、4天時(shí)，NaClO、KMnO4和對照組處理木棉種子污染率急劇增加，而1.0% CuSO4、0.1% HgCl2和多菌靈消毒處理的木棉種子污染率顯著低于對照組(表1，圖1)。說明1.0% CuSO4、0.1% HgCl2和多菌靈消毒效果優(yōu)于其他處理。

表1 不同消毒處理木棉種子污染情況方差分析

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)表示為：Mean±SD，同一行不同小寫字母表示存在顯著性差異。*： 0.01≤p<0.05；**：0.01≤p<0.001；p<0.001

圖1 不同消毒劑的消毒效果比較

2.2 不同消毒劑對種子萌發(fā)的影響

不同消毒處理對種子萌發(fā)率分析表明，HgCl2消毒劑處理的木棉種子萌發(fā)率最高，且在培養(yǎng)第9天后顯著高于對照和其他處理(圖2)。培養(yǎng)12 d，不同種子消毒處理木棉種子發(fā)芽率由高到低排序分別為：HgCl2>CuSO4>多菌靈>CK=KMnO4>H2O2>NaClO；各處理種子發(fā)芽率分別為：41%，33.3%，32.7%，31%，31%，30%和26.3%。種子發(fā)芽指數(shù)分析表明，HgCl2、CuSO4和多菌靈消毒處理的種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于對照組和其他處理(圖3)。

圖2 不同消毒劑處理木棉種子萌發(fā)率

圖3 不同消毒處理木棉種子發(fā)芽指數(shù)

2.3 不同消毒劑對幼苗生長的影響

單因素方差分析表明不同消毒劑處理木棉種子對木棉苗的苗高、株重、根長和根分叉數(shù)都有顯著性影響(圖4)。與對照組相比，除HgCl2和KMnO4種子消毒處理的木棉幼苗外，其他消毒劑種子處理木棉苗均顯著低于對照組木棉苗的株高(圖4)。H2O2種子消毒處理的木棉幼苗根長、苗重都顯著小于對照組，其他種子消毒處理的木棉幼苗根長、苗重與對照組處理沒有顯著性差異(圖4)。HgCl2和NaClO種子消毒處理的木棉幼苗根的分叉數(shù)顯著高于KMnO4、H2O2和CuSO4幼苗根分叉數(shù)，但各消毒處理木棉幼苗根分叉數(shù)與對照組沒有顯著性差異(圖4)。

圖4 不同消毒處理木棉苗高、根長、苗重和根分叉數(shù)單因素方差分析

不同種子消毒處理間木棉苗的死亡率單因素方差分析表明，不同種子消毒處理間木棉苗的死亡率存在顯著性差異。其中HgCl2,、多菌靈處理和對照組幼苗死亡率顯著低于CuSO4、H2O2、NaClO和KMnO4處理(圖5)。

圖5 不同消毒處理木棉苗的死亡率單因素方差分析

3 討論

大量研究表明，不同物種的種子適用的表面消毒劑不同。李忠光和龔明(2011)用CuSO4、H2O2、NaClO和HgCl2四種化學(xué)消毒劑對小桐子種子進(jìn)行表面消毒，發(fā)現(xiàn)CuSO4消毒不僅效果好，而且還可以提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和脂肪酶活性[16]。劉曉紅等(2014)分別用1.0% CuSO4、10% NaClO、0.1% KMnO4和1%福爾馬林溶液對野韭種子進(jìn)行消毒處理，結(jié)果表明，用10% NaClO消毒的種子的發(fā)芽指數(shù)和累積發(fā)芽率最高，而用0.1% KMnO4消毒處理的種子帶菌率最小[17]。周峰等(2009)分別用H2O2、NaClO和HgCl2對畢氏海蓬子種子進(jìn)行表面消毒，發(fā)現(xiàn)HgCl2消毒效果最好，這與我們的研究結(jié)果一致[18]。但張玉等(2010)用NaClO、HgCl2和H2O2三種不同消毒劑對飼草菊苣種子萌發(fā)和生長的影響，結(jié)果表明0.1% HgCl2對普那菊苣生長抑制作用最明顯，10% H2O2消毒效果最好[19]。梁明勤和臧新(2010)用NaClO和HgCl2對香椿種子進(jìn)行表面消毒，發(fā)現(xiàn)用HgCl2消毒的種子，其發(fā)芽率僅為9.54%，而用NaClO消毒的種子，其發(fā)芽率高達(dá)81.55%[20]。這可能是不同植物種子對HgCl2的耐受性不同所致。

我們探討了不同消毒劑對木棉種子表面消毒效果以及其對木棉種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，結(jié)果顯示不同消毒劑對木棉種子消毒后其種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)、幼苗生長指標(biāo)都有顯著性影響。在充分排除外來污染源的條件下，我們發(fā)現(xiàn)木棉種子在培養(yǎng)過程中仍極易遭受雜菌污染(表1，圖1)，這可能是木棉種子自身攜帶的污染源。且有研究表明自然條件下，木棉種子霉變率達(dá)到了54.0%[7]，而我們的試驗(yàn)結(jié)果也表明在培養(yǎng)后期各處理木棉種子污染率都達(dá)到90%以上，這可能是因?yàn)樵跓o菌狀態(tài)下，沒有土壤微生物的競爭拮抗作用，木棉種子自身攜帶的微生物更容易增殖生長[21]。并且我們發(fā)現(xiàn)，木棉種子在萌發(fā)過程中會(huì)分泌大量多糖類物質(zhì)，這為微生物的增殖提供了養(yǎng)料，更加促進(jìn)了雜菌的孳生。盡管在污染狀態(tài)下有些種子仍能夠萌發(fā)，但是木棉幼苗極易死亡(圖5)。不同消毒劑處理木棉種子，能夠顯著影響木棉種子的萌發(fā)率和后期木棉苗的生長狀況(圖4)。根據(jù)消毒效果看，盡管CuSO4、HgCl2和多菌靈三種處理在培養(yǎng)前期都能夠有效降低木棉種子的污染率(圖1)，提高了木棉種子的發(fā)芽指數(shù)(圖3)，但是CuSO4種子消毒處理的木棉苗死亡率顯著高于對照組。只有HgCl2種子消毒處理提高了木棉種子的萌發(fā)率，并且幼苗死亡率低于對照處理。從不同消毒劑對幼苗生長指標(biāo)上看，H2O2種子消毒處理的木棉幼苗根長、苗重都顯著小于對照組，HgCl2其他種子消毒處理的木棉幼苗根長、苗重與對照組處理沒有顯著性差異(圖4)。與對照組相比，除HgCl2和KMnO4種子消毒處理的木棉幼苗外，其他消毒劑種子處理木棉苗均顯著低于對照組木棉苗的株高(圖4)。HgCl2和NaClO種子消毒處理的木棉幼苗根的分叉數(shù)顯著高于KMnO4、H2O2和CuSO4幼苗根分叉數(shù)，但各消毒處理木棉幼苗根分叉數(shù)與對照組沒有顯著性差異。因此筆者試驗(yàn)認(rèn)為0.1% HgCl2是木棉種子的優(yōu)良消毒劑。