徐 冰，劉 存，周東美，王玉軍

（1.中國(guó)科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南京土壤研究所），南京 210008；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

2014年原環(huán)境環(huán)保部和原國(guó)土資源部發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，受快速的工業(yè)化和城市化進(jìn)程影響，我國(guó)土壤污染點(diǎn)位超標(biāo)嚴(yán)重，其中主要污染物為重金屬和類金屬[1]。農(nóng)作物吸收污染土壤中的重金屬不僅會(huì)對(duì)農(nóng)作物本身造成減產(chǎn)等危害，還會(huì)通過(guò)食物鏈傳遞對(duì)人體健康造成不良影響。植物根表質(zhì)膜是保持農(nóng)作物內(nèi)部環(huán)境相對(duì)平衡穩(wěn)定的屏障，也是土壤溶液中自由態(tài)重金屬離子首先接觸、結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞被農(nóng)作物吸收乃至產(chǎn)生毒性作用的主要通道[2]。因此，了解重金屬離子與植物根表質(zhì)膜之間的相互作用規(guī)律，是從根本上理解重金屬在土壤-植物體系中遷移機(jī)制的關(guān)鍵之一。目前，大多數(shù)研究是從宏觀上的生物配體模型[3-5]和分子生物學(xué)上單純的金屬通道蛋白[6-8]等角度探討植物根表質(zhì)膜表面重金屬離子吸附、吸收等過(guò)程以及其對(duì)植物毒性作用的影響。但重金屬離子與細(xì)胞質(zhì)膜相互作用的微觀過(guò)程，很難用實(shí)驗(yàn)手段觀測(cè)到，因而缺乏分子水平上對(duì)其變化過(guò)程的描述。

細(xì)胞質(zhì)膜因其磷脂分子頭部的磷酸基團(tuán)、膜蛋白上所帶的氨基酸殘基等基團(tuán)[9-11]的存在，使得質(zhì)膜表面帶負(fù)電荷，引起植物根表質(zhì)膜-土壤溶液界面上電勢(shì)的變化，影響著重金屬離子在質(zhì)膜表面的吸附及土壤溶液中的分布。Kinraide等[12-13]將溶液化學(xué)中經(jīng)典的雙電層Gouy-Chapman-Stern模型（GCS模型）引入植物根表-土壤溶液體系，建立了表征植物根細(xì)胞膜表面離子活度的根表面絡(luò)合模型。Kinraide等[13-14]、Wang等[15-16]和Wang等[17]的實(shí)驗(yàn)和模擬數(shù)據(jù)表明GCS模型可以用于量化 Cu2+、Cd2+、Ca2+、Mg2+等陽(yáng)離子和砷酸根等陰離子對(duì)質(zhì)膜膜表面電勢(shì)（Ψ0）的影響和實(shí)際膜表面電荷分布情況。經(jīng)典GCS模型能夠成功地揭示膜表面電勢(shì)影響下不同離子競(jìng)爭(zhēng)吸附的本質(zhì)規(guī)律，即細(xì)胞膜表面分布著負(fù)電和電中性等不同結(jié)合位點(diǎn)，不同離子在這些位點(diǎn)上有著不同的結(jié)合常數(shù)，離子在這些結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)吸附改變了膜表面電勢(shì)，并控制離子在擴(kuò)散層中的分布。但這一概念化數(shù)學(xué)模型為了簡(jiǎn)化運(yùn)算將細(xì)胞質(zhì)膜視為剛性平板電容，而實(shí)際的細(xì)胞質(zhì)膜是結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜的兩性雙分子層，表面官能團(tuán)較多，具有流動(dòng)性等動(dòng)態(tài)特性，因此很難通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段和這一經(jīng)典模型獲取分子水平上重金屬離子與質(zhì)膜相互作用的微觀動(dòng)態(tài)和機(jī)制。分子動(dòng)力學(xué)（Mo?lecular dynamics，MD）已被證明可以有效模擬細(xì)胞質(zhì)膜與不同分子、離子間的相互作用，可以有效地彌補(bǔ)常規(guī)實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)分析方法對(duì)分子水平上界面動(dòng)態(tài)變化認(rèn)識(shí)的不足[18-22]。分子動(dòng)力模擬可以在分子水平上描述重金屬離子在細(xì)胞質(zhì)膜表面的分布，以及不同官能團(tuán)如羰基（C=O）、羥基（-OH）、磷酸基團(tuán)等對(duì)結(jié)合構(gòu)型的影響；模擬得到的運(yùn)動(dòng)軌跡可以定量分析質(zhì)膜表面電勢(shì)的動(dòng)態(tài)變化，以及其對(duì)溶液中離子濃度分布的影響，有助于深入了解分子尺度下重金屬離子在實(shí)際生物質(zhì)膜中吸附、穿透和吸收等過(guò)程。因此，本文采用分子動(dòng)力模擬方法：（1）從分子層面解釋質(zhì)膜表面電勢(shì)對(duì)溶液中重金屬離子吸附和分布的影響；（2）與經(jīng)典雙電層GCS模型結(jié)合，探究不同陽(yáng)離子或陰、陽(yáng)離子共存情況下，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和表面電勢(shì)的變化規(guī)律，從而更好地描述質(zhì)膜表面電勢(shì)對(duì)溶液中重金屬離子吸附和分布影響的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 模擬體系

模擬體系由磷脂雙分子層（圖1）和溶液相構(gòu)成。溶液分別由約 0.05 mol·L-1的 Na+、K+等一價(jià)陽(yáng)離子，或0.025 mol·L-1的 Ca2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+等二價(jià)陽(yáng)離子和53 790個(gè)水分子組成：磷脂雙分子層由114個(gè)POPC（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho?choline）和 14個(gè) POPG（1-palmitoyl-2-oleoyl-snglycero-3-phosphoglycerol）組成[23-25]（圖2）。模擬體系設(shè)定的周期邊界條件PBC（Periodic boundary condi?tions）：盒子大小為64 ?×64 ?×170 ?，溶液相中另外補(bǔ)充適當(dāng)?shù)腃l-，以保持盒子整體的電中性。所有模擬計(jì)算由美國(guó)Sandia國(guó)家實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的開(kāi)源性大規(guī)模原子分子并行模擬器LAMMPS（Large-scale atomic/molecular massively parallel simulator）軟件完成，計(jì)算體系中原子間相互作用力的力場(chǎng)選用CHARMM 36[26-27]，平衡后體系中磷脂雙分子層表面可變電荷密度（σ0）約為25.4 mC·m-2，與實(shí)驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果相符。

1.2 平衡方法

建立好的模型體系先用正則系綜NVT（N表示原子數(shù)，V表示盒子體積，T表示溫度，三者不變）平衡，初始溫度為300 K，平衡時(shí)間1.5 ns，再進(jìn)行模擬退火0.8 ns，溫度由300 K逐步升至450 K再逐步降至300 K，最后采用等溫等壓系綜NPT（P表示壓力恒定），壓力為0.1 MPa，弛豫時(shí)間為1.5 ns。

1.3 模擬過(guò)程

平衡后的模型體系繼續(xù)選用非均向性的NPT系綜進(jìn)行計(jì)算并收集數(shù)據(jù)分析，體系溫度設(shè)定為300 K，體系壓強(qiáng)為0.1 MPa，積分步長(zhǎng)設(shè)置為2 fs，為保證體系總模擬時(shí)長(zhǎng)可代表實(shí)際情況，模擬過(guò)程采用LAMMPS中的SHAKE算法約束53 790個(gè)水分子的振動(dòng)（鍵長(zhǎng)或鍵角）以達(dá)到延長(zhǎng)時(shí)間步長(zhǎng)的目的，體系總模擬時(shí)長(zhǎng)為60 ns。

圖1 磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)組分POPC和POPG分子式Figure 1 Phospholipid bilayer structure components POPC and POPG formula

1.4 GCS模型計(jì)算磷脂表面離子濃度分布

設(shè)定質(zhì)膜雙分子層中心為Z=0，GCS理論計(jì)算溶液中陽(yáng)離子Mn+和Cl-在體系中的密度分布公式為[18]：

式中：nb表示溶液中金屬離子的濃度；κZ=（8πnbe2/εkBT）1/2為Debye-Hückel參數(shù)，其中ε表示水的介電常數(shù)，kB為玻爾茲曼常數(shù)，T為溫度；Φs表示Z=0處的膜表面靜電勢(shì)，由式（2）計(jì)算得出：

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)膜表面的離子吸附構(gòu)型

圖2 植物根表質(zhì)膜與土壤溶液界面的GCS宏觀數(shù)學(xué)模型（a,示意圖修改自文獻(xiàn)[28]）和分子動(dòng)力學(xué)模型（b）Figure 2 GCS model（a,Adapted from[28]）and molecular dynamics（b）for metal ion-lipid bilayer interactions

圖 3分別為不同溶液體系中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+等陽(yáng)離子及陰離子Cl-在質(zhì)膜雙分子層表面的吸附模型。模擬結(jié)果表明，K+在質(zhì)膜表面吸附較弱（圖3b），而其余陽(yáng)離子都傾向于與質(zhì)膜表面位點(diǎn)強(qiáng)烈結(jié)合[如羰基（C=O）與磷酸基（-OP）]。這是因?yàn)榕cNa+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Cd2+相比，K+的離子半徑更大，離子表面的電荷密度更小，與周圍水分子的結(jié)合能力更弱，水合半徑更小，進(jìn)而KCl體系的離子強(qiáng)度也比其他體系低，而離子強(qiáng)度的大小又是影響細(xì)胞質(zhì)膜表面電勢(shì)絕對(duì)值的關(guān)鍵。因此K+吸附并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)膜的自由能壘低于Na+以及二價(jià)金屬陽(yáng)離子[29]。

除K+外，其他陽(yáng)離子在結(jié)合到質(zhì)膜表面時(shí)，傾向于與質(zhì)膜頭部的極性基團(tuán)羥基、磷酸氧和羰基結(jié)合（圖3內(nèi)插圖中內(nèi)容所示），主要是這些官能團(tuán)的負(fù)電荷與陽(yáng)離子發(fā)生靜電絡(luò)合作用。金屬陽(yáng)離子與質(zhì)膜頭部基團(tuán)的結(jié)合導(dǎo)致了一個(gè)與磷脂雙分子層自身方向相反偶極矩的生成。質(zhì)膜頭部帶有正電荷的膽堿基團(tuán)，也因?yàn)榕c陽(yáng)離子之間的排斥作用以及與陰離子的吸引作用發(fā)生一定的構(gòu)型改變，傾向于轉(zhuǎn)向水相或者與磷酸基團(tuán)呈相反的方向。金屬陽(yáng)離子吸附導(dǎo)致了分子構(gòu)型變化進(jìn)而促使磷脂面積減小和質(zhì)膜厚度增加，促使質(zhì)膜更加緊密的包裹[19，30-31]。盡管自然狀態(tài)下根細(xì)胞質(zhì)膜呈負(fù)電性，通過(guò)靜電排斥作用導(dǎo)致陰離子Cl-通常分布在溶液中，隨著距離質(zhì)膜表面越遠(yuǎn)，陽(yáng)離子的濃度越低，陰離子Cl-的濃度越高。但圖3c的Ca2+體系吸附構(gòu)型還顯示出在Ca2+與質(zhì)膜表面的官能團(tuán)結(jié)合時(shí)有Cl-伴隨，證明了溶液相的陰離子可以通過(guò)陽(yáng)離子橋鍵結(jié)合的形式吸附到質(zhì)膜表面。

圖3 金屬離子在質(zhì)膜表面的吸附分布（內(nèi)插圖放大顯示了不同離子與質(zhì)膜官能團(tuán)的典型結(jié)合方式）Figure 3 The adsorption configuration of Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Cu2+and Cd2+on the surface of the plasma membrane，respectively，and the insets enlarged the coordination environment of cations

2.2 磷脂表面密度分布

不同體系中陽(yáng)離子、陰離子、水分子和質(zhì)膜雙分子頭部的羰基氧、羥基氧、磷酸氧和氮原子在質(zhì)膜表面密度分布情況如圖4表示。原子的位置對(duì)脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。分布峰之間的距離可以直接反映質(zhì)膜極性基團(tuán)構(gòu)型的變化。以質(zhì)膜中心作為Z軸的原點(diǎn)（Z=0），圖中顯示的為質(zhì)膜雙分子層的一半，密度數(shù)值顯示的是質(zhì)膜兩側(cè)的分布均值。在膜-水界面的周圍，K+的密度分布沒(méi)有呈現(xiàn)出明顯的峰值（圖4b），這是因?yàn)镵+半徑較大，電荷密度低，與負(fù)電基團(tuán)親和性較弱[19，32]。Na+及二價(jià)金屬離子體系中（圖4a和圖4c至圖4f深藍(lán)線），陽(yáng)離子在靠近質(zhì)膜表面的位置出現(xiàn)一個(gè)分布峰，其峰值出現(xiàn)的位置和位于脂質(zhì)的羰基（Mn+-Ocarb）和磷酸氧（Mn+-P）最大峰處的分布具有高度的相關(guān)性，羥基基團(tuán)（Mn+-OH）密度分布的最大值與金屬離子概率密度的峰值重疊部分較少，說(shuō)明羥基基團(tuán)對(duì)吸附 Ca2+、Mg2+、Cd2+、Cu2+陽(yáng)離子的貢獻(xiàn)比羰基和磷酸基團(tuán)少，這一結(jié)論也驗(yàn)證了不同金屬離子在質(zhì)膜表面吸附構(gòu)型的不同。同時(shí)我們觀察到氮原子（Mn+-N）與磷原子（Mn+-P）的密度分布相似，并且受陽(yáng)離子結(jié)合的影響方式相似。這種構(gòu)型和電荷分布的相關(guān)變化是由于膽堿氮和陽(yáng)離子之間的相互排斥作用以及陰離子和膽堿基團(tuán)之間的吸引力引起的[19]。

圖4 不同體系中的金屬離子K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Cd2+和Cl-（-Cl）、水分子（-H2O）、羰基氧（-Ocarb）、磷酸氧（-P）、質(zhì)膜頭部氮原子（-N）、羥基氧（-OH）等在質(zhì)膜表面的離子濃度分布Figure4 TheionconcentrationdistributiononthesurfaceoftheplasmamembraneofK+，Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Cd2+andCl-（-Cl），water molecule（-H2O），carbonyloxygen（-Ocarb），phosphoricacidoxygen（-P），plasmamembraneheadnitrogenatom（-N）andhydroxyoxygen（-OH）

除 K+以外，Na+和二價(jià)金屬離子 Ca2+、Mg2+、Cu2+、Cd2+都在水分子（Mn+-H2O）達(dá)到最大分布密度峰附近出現(xiàn)一個(gè)倒峰，水分子分布出現(xiàn)最大值的位置為質(zhì)膜吸附金屬陽(yáng)離子緊密層（雙電層中的Stern層）的外側(cè)，二價(jià)金屬離子在從質(zhì)膜中心到體相溶液的分布過(guò)程中（距質(zhì)膜雙分子層中心距離由0到100 ?），先出現(xiàn)一個(gè)最高峰，隨后出現(xiàn)一個(gè)倒峰，然后趨于和伴隨陰離子相似的分布情況，但Na+沒(méi)有倒峰出現(xiàn)。Ca2+、Mg2+、Cu2+、Cd2+的倒峰值大小并不相同，這與離子半徑和表面電荷密度等特性有關(guān)。與陽(yáng)離子分布不同，陰離子主要分布在質(zhì)膜的Stern層以外，由于靜電斥力的相互作用其分布密度與質(zhì)膜表面官能團(tuán)沒(méi)有相關(guān)性，不同陽(yáng)離子體系中的Cl-滲透到質(zhì)膜的能力也不同，表現(xiàn)為Mg2+＞Ca2+＞Na+＞K+[19]，圖4中顯示，在Ca2+和Mg2+等二價(jià)陽(yáng)離子體系中，Cl-以與陽(yáng)離子橋鍵結(jié)合的形式進(jìn)入質(zhì)膜區(qū)域，而K+和Na+體系則沒(méi)有出現(xiàn)陰離子伴隨進(jìn)入質(zhì)膜的情況。

2.3 磷脂表面離子濃度分布與GCS計(jì)算比較

圖5 不同體系中金屬陽(yáng)離子和陰離子在質(zhì)膜表面的離子濃度分布和GCS計(jì)算比較Figure 5 The surface ion concentration distribution of metal cations and anion plasma membranes in different systems and compared with GCS model calculation

MD模擬可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)不同體系表面電勢(shì)下的金屬離子濃度隨距質(zhì)膜雙分子層中心距離變化的分布情況，其結(jié)果和經(jīng)典的GCS理論模型計(jì)算結(jié)果具有一致性（圖5）。如圖5所示，通過(guò)GCS模型中的公式（1）計(jì)算得到的膜表面離子濃度分布規(guī)律為：與質(zhì)膜表面帶電性相反的金屬離子（帶正電），在質(zhì)膜表面的濃度整體呈隨距離減小而增大的變化趨勢(shì)（圖5黑線部分），這是由質(zhì)膜（負(fù)電）與金屬離子之間的靜電作用引起的；而體系中的陰離子Cl-在質(zhì)膜表面的濃度整體呈隨著距離的減小而減小的變化趨勢(shì)（圖5紅線部分）。這一變化趨勢(shì)與MD的模擬結(jié)果一致（圖5淺藍(lán)線與黑線重合，深藍(lán)線與紅線重合）。MD模擬結(jié)果表明，除KCl體系外（圖5a），Stern層內(nèi)金屬離子由于靜電吸引力的作用濃度明顯比Stern層外大，體系中Cl-在Stern層內(nèi)的濃度則相反。此外，CaCl2、Mg?Cl2、CuCl2和CdCl2等二價(jià)金屬離子體系中（圖5c至圖5e中淺藍(lán)線），MD計(jì)算結(jié)果還表明由Stern層外向Stern層內(nèi)靠近時(shí)，出現(xiàn)陽(yáng)離子濃度先降低后顯著增加的過(guò)程，這是由于二價(jià)金屬離子與質(zhì)膜表面負(fù)電荷的官能團(tuán)吸附強(qiáng)烈，吸附的正電荷超過(guò)了膜表面帶的負(fù)電荷量，使膜表面電勢(shì)由負(fù)變正，所以Stern層外優(yōu)先靜電吸引Cl-，排斥二價(jià)陽(yáng)離子。通過(guò)比較MD模擬和GCS模型計(jì)算結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，MD模擬不但很好地吻合了GCS理論計(jì)算得到的Stern層外隨著Stern距離增加陰、陽(yáng)離子濃度分布衰減趨勢(shì)明顯的變化特點(diǎn)，同時(shí)能夠預(yù)測(cè)離子在Stern層中的結(jié)合和分布情況。

但GCS理論計(jì)算離子在膜表面的電荷濃度公式是基于以下假設(shè)得到的：（1）體系中的離子為點(diǎn)電荷，沒(méi)有考慮實(shí)際的原子體積和半徑[33]；（2）GCS理論假設(shè)背景溶液為稀溶液，界面上水密度均為1 g·cm-3，不考慮界面相互作用的影響[34]。MD的模擬結(jié)果顯示實(shí)際平衡后的體系盒子中（圖2b）表面吸附離子濃度較高時(shí)，離子會(huì)占據(jù)相當(dāng)?shù)捏w積，且不同離子在體系中占據(jù)的體積大小并不相同，不能簡(jiǎn)單視為點(diǎn)電荷；從圖5中可以看出，體系中的水分子由于與磷脂相互間的作用，在界面表面呈現(xiàn)出隨著距雙分子層中心距離的增加濃度呈由低到高的變化趨勢(shì)，而并不是均勻分布的，水分子在界面上的分布情況會(huì)影響到膜表面電勢(shì)的變化和離子的吸附濃度。MD模擬結(jié)果直觀而有力地彌補(bǔ)了GCS理論因簡(jiǎn)化假設(shè)而造成的微觀描述缺陷，為拓展GCS模型的使用范圍和驗(yàn)證MD模擬提供了良好的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

（1）MD模擬從分子水平上揭示了不同金屬陽(yáng)離子與質(zhì)膜結(jié)合的構(gòu)型，發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜表面電勢(shì)強(qiáng)烈影響著離子的分布，二價(jià)陽(yáng)離子主要結(jié)合在質(zhì)膜頭部羰基基團(tuán)和磷酸基團(tuán)。

（2）MD模擬可以與GCS模型很好地吻合，并且能進(jìn)一步準(zhǔn)確描述雙電層中的Stern層中陰、陽(yáng)金屬離子的分布和結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而更好地為研究重金屬的農(nóng)作物吸收和毒性提供分子層面的機(jī)理解釋和直觀微觀圖像。