職愛(ài)民 余曼 喬苗苗 柴興寬

摘 要：本文回顧了近年來(lái)免疫技術(shù)在動(dòng)物源性食品快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究，主要涵蓋酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、膠體金免疫層析法、電化學(xué)免疫分析法、放射免疫法、熒光免疫分析法和免疫磁分離技術(shù)6 種免疫技術(shù)對(duì)動(dòng)物源性食品中抗生素、致病菌、激素、毒素、重金屬、中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織和肉摻假檢測(cè)的研究進(jìn)展，以期為此領(lǐng)域的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：免疫技術(shù);動(dòng)物源性食品;檢測(cè)

Abstract： This paper reviews recent progress in the application of various immunoassays in animal-derived food. Special emphasis is on the application of enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， colloidal gold immunochrmatography， electrochemical immunoassay， radioimmunoassay， fluorescence immunoassay and immunomagnetic separation in the detection of antibiotics， pathogenic bacteria， hormones， toxins， heavy metals， central nervous system tissues and adulterants in meat products. This review is expected to provide valuable information for research in the field.

Keywords： immunoassay; animal-derived food; detection

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190124-020

中圖分類(lèi)號(hào)：TS207.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）05-0060-07

引文格式：

職愛(ài)民， 余曼， 喬苗苗， 等. 免疫技術(shù)在動(dòng)物源性食品快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展[J]. 肉類(lèi)研究， 2019， 33（5）： 60-66. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190124-020.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHI Aimin， YU Man， QIAO Miaomiao， et al. Recent progress of immunoassay in rapid detection of animal-derived food[J]. Meat Research， 2019， 33（5）： 60-66. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190124-020.? ? http：//www.rlyj.net.cn

隨著社會(huì)的發(fā)展和人民生活水平的不斷提升，膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生重大變化，動(dòng)物源性食品的需求大幅上升，并且消費(fèi)者對(duì)動(dòng)物源性食品的安全也體現(xiàn)出前所未有的關(guān)注。黨中央和國(guó)務(wù)院一直對(duì)肉制品的質(zhì)量安全極為重視[1]。特別是近年出現(xiàn)的新型瘦肉精事件、抗生素殘留、致病菌污染及動(dòng)物本身毒素殘留等諸多問(wèn)題，更使得動(dòng)物源性食品安全問(wèn)題成為萬(wàn)眾矚目的焦點(diǎn)。理化檢測(cè)雖然具有假陽(yáng)性率低、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但因其儀器昂貴、技術(shù)復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和批量篩選[2]。免疫分析技術(shù)的出現(xiàn)，以其快速、簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高和低成本的特性，彌補(bǔ)了理化檢測(cè)的固有缺點(diǎn)[3]。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、膠體金免疫層析法（immune colloidal gold technique，GICT）等免疫學(xué)方法已經(jīng)在動(dòng)物源性食品快速檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 ELISA方法

ELISA方法通過(guò)抗原-抗體的特異識(shí)別反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，其具有很高的靈敏度和特異性，有操作簡(jiǎn)單、分析容量大、安全可靠及儀器成本較低等優(yōu)點(diǎn)[4]。

1.1 ELISA在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

ELISA是在致病菌檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的方法之一[5]。王利剛[6]分別利用全自動(dòng)ELISA熒光分析儀法和常規(guī)培養(yǎng)法對(duì)生鮮肉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：全自動(dòng)ELISA熒光分析儀篩選法僅需51 h左右即可得到初步篩選結(jié)果，在二次增菌后直接進(jìn)行檢測(cè)，上機(jī)僅70 min即可報(bào)告結(jié)果;而使用常規(guī)培養(yǎng)法（VITEK2 compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)）對(duì)選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的可疑菌株進(jìn)行鑒定，也只可把傳統(tǒng)的檢測(cè)周期縮短為4～5 d。且ELISA法假陽(yáng)性率低于常規(guī)培養(yǎng)法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單。杜玄等[7]選擇最佳反應(yīng)條件，建立一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEP的雙抗夾心ELISA法，結(jié)果表明，批間變異低于15%，靈敏度為1.8 μg/mL，對(duì)牛肉糜的回收率可達(dá)90%以上，批內(nèi)變異低于6%。Ballamoole等[8]通過(guò)制備單克隆抗體創(chuàng)建sandwich ELISA方法，在海鮮樣本中致病菌的快速篩查中發(fā)揮重要作用。ELISA在致病菌檢測(cè)中的研究已經(jīng)取得諸多成果，但卻很少見(jiàn)到同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的報(bào)道。

1.2 ELISA在中樞神經(jīng)組織檢測(cè)中的應(yīng)用

Schmidt等[9]應(yīng)用熒光ELISA快速、靈敏地檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白，進(jìn)而判斷牛肉及其制品中是否含有中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織（引發(fā)瘋牛病的一種特殊風(fēng)險(xiǎn)性物質(zhì)，主要集中在中樞神經(jīng)組織），結(jié)果表明，該法的靈敏度為0.2 ng膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白，變異系數(shù)為2.0%。李冰玲等[10]運(yùn)用ELISA研制試劑盒，可以用于檢測(cè)生牛肉產(chǎn)品和加熱處理牛肉（瘋牛病病原具有耐熱特性）產(chǎn)品中的中樞神經(jīng)組織，具有很高的靈敏性。

1.3 ELISA在藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

ELISA可以應(yīng)用于磺胺類(lèi)、抗生素類(lèi)和激素類(lèi)等多種獸藥殘留的檢測(cè)。萬(wàn)宇平等[11]經(jīng)免疫鼠和羊制備替米考星的單克隆抗體，基于該抗體建立替米考星間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，結(jié)果表明，此法對(duì)動(dòng)物組織、肝臟、雞蛋和牛乳中替米考星的檢測(cè)限分別為0.5、10.0、5.0、5.0 μg/kg，回收率為70%～110%，變異系數(shù)小于15%。孫俐等[12]將5 種肉及肉制品經(jīng)C18柱分離純化，利用ELISA檢測(cè)己烯雌酚，結(jié)果表明，假陰性率為0，檢測(cè)下限為0.5 μg/kg，精密度為7.6%～7.8%，回收率達(dá)88.36%～90.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～8.6%。柴銘駿等[13]采用ELISA法檢測(cè)肉制品中的萊克多巴胺，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法確證，此方法在進(jìn)出口肉制品藥物殘留檢測(cè)中可以得到很好的應(yīng)用。Dixon-Ho11and等[14-15]報(bào)道了豬組織及牛乳中磺胺二甲基嘧啶的ELISA檢測(cè)。

1.4 ELISA在重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用

重金屬具有高毒性、持久性和難解性等特點(diǎn)，因而重金屬的檢測(cè)問(wèn)題迫切需要解決，金屬檢測(cè)器已是禽肉制品企業(yè)不可缺少的裝置，但它的靈敏度和穩(wěn)定性始終是一個(gè)問(wèn)題，且造價(jià)較高[16]。方淑兵等[17]以皮皮蝦為基質(zhì)，采用濕法硝化處理樣品，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)基質(zhì)中的重金屬汞離子，檢測(cè)靈敏度為4.10 μg/L，檢測(cè)限為0.45 μg/L，添加回收率為79%～120%。劉功良等[18]以鎘特異性單克隆抗體與酶標(biāo)抗原為基礎(chǔ)，構(gòu)建一種直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，能快速、準(zhǔn)確測(cè)定瀨尿蝦中鎘殘留量，檢測(cè)下限為0.2 μg/L，半抑制質(zhì)量濃度（semi-inhibitory concentration，IC50）為3.01 μg/L，其他金屬螯合物的交叉反應(yīng)率均低于1.6%，檢測(cè)的變異系數(shù)為6.67%～9.09%，與石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.988。

1.5 ELISA在摻假肉檢測(cè)中的應(yīng)用

食用摻假肉品存在安全隱患，如摻假物質(zhì)有毒、減少肉品中維持健康所需的營(yíng)養(yǎng)、過(guò)敏問(wèn)題等[19]。早在20世紀(jì)90年代，ELISA技術(shù)就已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于肉類(lèi)的物種鑒別[20-21]，可實(shí)現(xiàn)肉中摻假的定性和定量檢測(cè)。常用于肉中摻假檢測(cè)的ELISA方法有間接法和雙抗體夾心法，目前主要通過(guò)利用抗體對(duì)肌肉和血清蛋白或熱穩(wěn)定性蛋白建立ELISA來(lái)鑒別不同種類(lèi)的動(dòng)物肉類(lèi)[4]。Rencova等[22]應(yīng)用不同熱穩(wěn)定性的蛋白作抗原，免疫兔，基于多克隆抗體建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，鑒別熱加工后的家禽、馬、袋鼠和老鼠的肌肉組織，且敏感性較好。免疫瓊脂擴(kuò)散法雖然也可以鑒別摻假肉，且操作簡(jiǎn)單，形成的沉淀線(xiàn)易于觀(guān)察，但不能對(duì)熟肉中的摻假問(wèn)題進(jìn)行鑒別，因此現(xiàn)階段應(yīng)用免疫學(xué)方法鑒別摻假肉的研究多集中在ELISA上。

2 GICT法

GICT是一種將免疫檢測(cè)技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法相結(jié)合的固相標(biāo)記免疫快速檢測(cè)技術(shù)[23]。該檢測(cè)技術(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，基于該方法組裝GICT試紙條的敏感度高、不需要昂貴的儀器、對(duì)操作人員要求低、便于攜帶和現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)，但不可進(jìn)行定量檢測(cè)。

2.1 GICT在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

趙鑫等[24]制備抗原免疫小鼠，再通過(guò)雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，得到單克隆抗體，并通過(guò)雙抗夾心ELISA體系篩選出一對(duì)高效、穩(wěn)定的最佳配對(duì)抗體，利用GICT技術(shù)初步制備出可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)冷鮮豬肉中單增李斯特菌的試紙條，其靈敏度為104 CFU/mL，且特異性良好。利用GICT研制的膠體金試紙條，一般5～15 min就會(huì)出結(jié)果，結(jié)果肉眼可判定，適合動(dòng)物源性食品安全領(lǐng)域的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。劉志科[25]通過(guò)克隆invA基因及原核表達(dá)，將獲得的invA重組蛋白作為診斷抗原，制備出雞沙門(mén)氏菌病抗體免疫膠體金試紙條。Wu Wende等[26]開(kāi)發(fā)用于快速檢測(cè)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的GICT試紙條，其靈敏度為1.5×105 CFU/mL，與其他常見(jiàn)細(xì)菌沒(méi)有交叉反應(yīng)，且與ELISA法檢測(cè)結(jié)果一致，檢測(cè)時(shí)間小于15 min，在4 ℃條件下，試紙條的有效性可保持6 個(gè)月。夏詩(shī)琪等[27]制備能同時(shí)檢測(cè)5 種典型沙門(mén)氏菌的GICT試紙條，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 GICT在藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

將GICT應(yīng)用在藥物殘留檢測(cè)中，容易實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)。趙福民等[28]研制出用于牛乳中卡那霉素、紅霉素和林可霉素3 種藥物同時(shí)檢測(cè)的膠體金試紙條，檢測(cè)限分別為50.0、20.0、75.0 μg/L，假陽(yáng)性率和假陰性率均為0，樣本無(wú)需前處理，檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，10 min內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)3 種藥物的同時(shí)檢測(cè)，與LC-MS/MS法測(cè)定結(jié)果一致，該法適用于牛乳和乳粉中抗生素的檢測(cè)。劉冰等[29]基于多克隆抗體研制氟甲喹的GICT試紙條，對(duì)魚(yú)肉、蝦肉、雞肉、牛肉、豬肉和豬肝6 種樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為50 μg/L。王森等[30]運(yùn)用GICT技術(shù)，研制一種可以用于同時(shí)檢測(cè)畜肉中萊克多巴胺、沙丁胺醇及克倫特羅殘留的快速檢測(cè)板，適宜進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，GICT技術(shù)在水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)中也發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。陳貴生等[31]運(yùn)用GICT法對(duì)采集的水產(chǎn)樣品中可能殘留的違禁藥物氟苯尼考進(jìn)行快速篩查，其檢測(cè)限能達(dá)到≤50 μg/kg。曹志海等[32]優(yōu)化樣品的前處理方法，建立一種快速檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的方法，使檢測(cè)下限提高至1.0 μg/kg，且縮短了檢測(cè)時(shí)間。此外，可以快速檢測(cè)水產(chǎn)品中甲基睪酮[33]、恩諾沙星殘留[34]的膠體金試紙條也已經(jīng)被制備出來(lái)。

2.3 GICT在毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

河鲀毒素是一種劇毒的天然非蛋白質(zhì)類(lèi)神經(jīng)毒素，其毒力相當(dāng)于氰化鈉的1 250 倍，人畜誤食后均能致死[35-37]。張世偉等[38]建立河鲀毒素的GICT檢測(cè)方法，所建立的方法IC50為48 ng/mL，線(xiàn)性范圍為10～160 ng/mL，最低檢出限為20 ?g/kg，其前處理過(guò)程簡(jiǎn)單快速，在現(xiàn)場(chǎng)僅需10 min就可判斷樣品是否有毒，該方法適用于熱加工樣品的檢測(cè)，為河鲀餐前快檢提供了有力的技術(shù)手段。近年來(lái)，貝類(lèi)中毒事件頻發(fā)，貝類(lèi)毒素是由有毒藻類(lèi)通過(guò)食物鏈將毒素傳遞給食藻貝類(lèi)，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)貝類(lèi)毒素主要是基于競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)來(lái)建立GICT快速檢測(cè)試紙條，已制備出的雙鞭甲藻毒素[39]、軟骨藻酸[40]和軟海綿酸[41]試紙條，其靈敏度分別為20、20、12 ng/mL。但由于抗貝毒有毒成分的單克隆抗體的制備水平有限、高純度毒素制備困難及毒素與載體蛋白偶聯(lián)技術(shù)難度較大等因素，GICT法檢測(cè)貝類(lèi)毒素的研究水平需要進(jìn)一步提升，這些因素也將成為今后要攻克的難題[42]。

2.4 GICT在重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用

趙小旭等[43]開(kāi)發(fā)出快速檢測(cè)乳制品中重金屬離子鉛的GICT試紙條，結(jié)果表明，試紙條特異性和穩(wěn)定性較好，生鮮乳和酸乳中的檢出限為25 μg/kg，乳粉和干酪中為300 μg/kg，成品乳中為30 μg/kg，與原子吸收光譜法檢測(cè)結(jié)果一致。對(duì)于重金屬離子污染，近年來(lái)研制出的免疫層析試紙條比較多，但很少有以動(dòng)物源性食品為樣本展開(kāi)研究的，其成果較少。

3 電化學(xué)免疫分析法

電化學(xué)免疫分析法（electrical chemical immunoassay analysis，ECIA）是將免疫技術(shù)與現(xiàn)代電化學(xué)分析技術(shù)結(jié)合在一起的新型免疫方法。與GICT法相比，其表現(xiàn)更直觀(guān)，可進(jìn)行定量分析[2]。

3.1 ECIA在毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

利用電化學(xué)免疫傳感器同樣可以檢測(cè)河豚毒素。

劉媛等[44]以Nafion（一種聚陰離子全氟磺酸鹽離聚物）固定釕聯(lián)吡啶Au納米顆粒于玻碳電極，借助Au-N共價(jià)鍵固定河豚毒素抗體，通過(guò)抗原、抗體的特異性結(jié)合，構(gòu)建超靈敏檢測(cè)河豚毒素的免標(biāo)記自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，檢出限為0.01 μg/L，此免標(biāo)記自增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器顯示出優(yōu)異的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和靈敏度。

3.2 ECIA在藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

免疫傳感器具有造價(jià)低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，與電化學(xué)技術(shù)分析聯(lián)用對(duì)殘留藥物進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度得到進(jìn)一步提高。湯慶會(huì)[45]以L(fǎng)-半胱氨酸作為穩(wěn)定劑，并運(yùn)用在水相中合成的CdSe量子點(diǎn)構(gòu)建一種超靈敏的量子點(diǎn)基電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，對(duì)新型瘦肉精藥物苯乙醇胺A進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為0.015 ng/mL，與其他檢測(cè)方法相比，表現(xiàn)出更寬的檢測(cè)范圍和較低的檢測(cè)限。鄭舒[46]基于四環(huán)素單克隆抗體與三電極體系的電化學(xué)傳感器，構(gòu)建四環(huán)素單克隆抗體-四氧化三鐵磁納米粒子-殼聚糖/金電極（anti-tetracycline monoclonal antibody-Fe3O4 magnetic nanoparticles-chitosan/gold electrode，Ab-MNPs-CS/GCE）和四環(huán)素單克隆抗體-四氧化三鐵磁納米粒子-殼聚糖/五氧化二鈮（anti-tetracycline monoclonal antibody-Fe3O4 magnetic nanoparticles-chitosan/Nb2O5，Ab-MNPs-CS/Nb2O5）2 種免疫傳感器，應(yīng)用于牛乳中四環(huán)素的快速檢測(cè)，并通過(guò)與ELISA法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)判斷準(zhǔn)確性，其中，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，Ab-MNPs-CS/GCE傳感器在靈敏性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性方面均優(yōu)于Ab-MNPs-CS/Nb2O5傳感器，最低檢測(cè)限僅為0.082 ng/mL，樣品的加標(biāo)回收率為75.8%～83.5%。Wang Hongwu等[47]研發(fā)基于AuNPs/cMWCNTs（碳納米管及納米金溶膠/羧基化多壁碳納米管）的新型分子印記電化學(xué)傳感器，用于喹乙醇的痕量檢測(cè)，在優(yōu)化條件下，該法檢測(cè)喹乙醇的選擇性和靈敏度很高，檢測(cè)限為2.7 nmol/L，檢測(cè)豬肉和魚(yú)肉中喹乙醇?xì)埩魰r(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11.4%，回收率為80.7%～115.8%。國(guó)外在用電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)獸藥殘留方面的研究很多，可根據(jù)獸藥種類(lèi)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求選擇免疫傳感器類(lèi)型和標(biāo)記酶。

4 放射免疫法

放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）是利用同位素標(biāo)記與未標(biāo)記的抗原，與抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)的方法。放射性免疫分析存在常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長(zhǎng)和需要做放射性標(biāo)記等不足，限制了其廣泛應(yīng)用[48]。

目前，國(guó)外用受體替代抗體結(jié)合鹽酸克倫特羅，已生產(chǎn)出測(cè)定鹽酸克倫特羅的試劑盒產(chǎn)品，檢測(cè)限高達(dá)2.4 ng/g[48]。這對(duì)肉制品中瘦肉精的檢測(cè)提供了便利和又一技術(shù)支持。此外，RIA可在保持家畜鮮活狀態(tài)的情況下，對(duì)動(dòng)物血清進(jìn)行檢測(cè)。蘇明明等[49-50]采用Charm Ⅱ放射免疫分析方法檢測(cè)牛血清中四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)藥物殘留，檢測(cè)限均為20 μg/kg，短時(shí)間可出檢測(cè)結(jié)果，且特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便。

5 熒光免疫分析法

熒光免疫分析法（fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA）將抗原抗體反應(yīng)與熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，常用量子點(diǎn)、熒光素、稀土離子螯合物和上轉(zhuǎn)換納米粒子作為熒光標(biāo)記物[51]，該方法具有操作簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)及準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。

5.1 FIA在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

量子點(diǎn)作為一種新型標(biāo)記物具有發(fā)射光譜窄而對(duì)稱(chēng)、激發(fā)光譜寬而連續(xù)、熒光壽命長(zhǎng)、發(fā)光顏色可調(diào)、光化學(xué)穩(wěn)定性高、發(fā)光效率高及不易光漂白等特點(diǎn)，可顯著降低檢測(cè)方法的檢出限，從而提高分析方法的靈敏度和分辨率[52]，在致病菌檢測(cè)中多以其為標(biāo)記物。袁列江等[53]利用自制水溶性量子點(diǎn)靜電偶聯(lián)腸出血性大腸桿菌O157：H7單克隆抗體，開(kāi)發(fā)出檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的CdTe量子點(diǎn)免疫層析試紙，最低檢測(cè)限為104 CPU/mL，檢測(cè)時(shí)間小于5 min，特異性良好，在肉制品和乳制品中的靈敏性與自來(lái)水中相當(dāng)，運(yùn)用膠體金標(biāo)記雖然也能準(zhǔn)確、快速地得到測(cè)定結(jié)果，卻無(wú)法使用肉眼進(jìn)行判斷，且靈敏度比量子點(diǎn)免疫層析試紙低了1 個(gè)數(shù)量級(jí)。

5.2 FIA在藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

余宇燕等[54]運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備諾氟沙星的單克隆抗體，從而建立以抗諾氯沙星單克隆抗體為基礎(chǔ)的熒光免疫分析方法，可應(yīng)用于檢測(cè)動(dòng)物性食品中殘留的微量諾氟沙星，在10～500 ?g/L范圍內(nèi)，抑制率與諾氟沙星質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，最低檢出限達(dá)6.09 ?g/L，在魚(yú)樣品中對(duì)諾氟沙星的回收率為89.8%～106.5%，且與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似喹諾酮類(lèi)藥物氧氟沙星、恩諾沙星、依諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星和蘆氟沙星的交叉反應(yīng)率分別為3.10%、0.83%、0.04%、1.50%、0.12%和2.80%。

時(shí)間分辨FIA是一種非同位素免疫分析技術(shù)，利用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，采用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)對(duì)波長(zhǎng)和時(shí)間2 個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可消除非特異性熒光的干擾。鄧麗華等[55]建立Eu3+標(biāo)記的間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨FIA法，用于魚(yú)肉樣品中呋喃它酮代謝物的檢測(cè)，并通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出最佳反應(yīng)條件。在優(yōu)化的條件下，IC50為0.26 ng/mL，檢出限為0.01 ng/mL，

線(xiàn)性范圍為0.025～2.830 ng/mL，魚(yú)樣中呋喃它酮代謝物的回收率為78.0%～86.0%，各樣品變異系數(shù)均小于15%，與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）

檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性良好，且靈敏度高、特異性好，能夠滿(mǎn)足實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。李貞[56]基于抗萊克多巴胺的單克隆抗體，初步建立檢測(cè)萊克多巴胺的時(shí)間分辨直接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法，其靈敏度超過(guò)傳統(tǒng)免疫分析法EILSA，IC50為1.6 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.39～12.77 ng/mL，

最低檢測(cè)限達(dá)0.136 ng/mL，豬肉、豬肝樣品中萊克多巴胺的平均加標(biāo)回收率分別為98.02%、96.03%。沙丁胺醇是克倫特羅的替代品，侯文慧[57]基于抗沙丁胺醇的單克隆抗體，以稀土離子Eu3+為熒光標(biāo)記物，利用同種方法測(cè)定出沙丁胺醇在豬肉、豬肝樣品中的平均加標(biāo)回收率分別為98.02%、96.03%。結(jié)果表明，優(yōu)化的時(shí)間分辨直接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法IC50為1.6 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.136 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.39～12.77 ng/mL。此研究為萊克多巴胺的時(shí)間分辨熒光免疫試劑盒的開(kāi)發(fā)提供了重要依據(jù)。Secundo等[58]基于特定多克隆抗體研究時(shí)間分辨熒光分析法檢測(cè)牛乳中的己烯雄酚，此方法可直接用于原料乳樣品，回收率可達(dá)96.0%～104.2%。隨著各種檢測(cè)試劑盒不斷被研發(fā)出來(lái)，檢測(cè)設(shè)備的使用越來(lái)越普遍，時(shí)間分辨熒光免疫分析法最終會(huì)在食品安全領(lǐng)域施展更大的作用。

熒光偏振免疫法常用于半抗原的藥物濃度測(cè)定。Wang等[59]優(yōu)化熒光偏振免疫法，檢測(cè)食品中馬杜霉素殘留，檢出限達(dá)0.002 μg/L，雞肉組織、豬肉、雞蛋中馬杜霉素回收率為82%～130%。鑒于熒光偏振分析具有通量高、速度快、成本低和方便自動(dòng)化等特點(diǎn)，在不久的將來(lái)熒光偏振免疫檢測(cè)會(huì)成為食品快速檢測(cè)的主要技術(shù)之一。宋佩等[60]采用薄層色譜法提純，優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間、標(biāo)記物與抗體的工作濃度，將異硫氰酸熒光素作為標(biāo)記物，建立氟喹諾酮類(lèi)藥物沙拉沙星的快速熒光偏振免疫分析法，在緩沖液中的IC50為43.2 ?g/L，檢測(cè)范圍為5.7～327.0 ?g/L，與環(huán)丙沙星有明顯的交叉反應(yīng)，與其他3 種藥物（恩諾沙星、加替沙星及氧氟沙星）的交叉反應(yīng)率均低于2%。在優(yōu)化條件下，牛乳中沙拉沙星的回收率為71%～94%，該方法操作簡(jiǎn)單快捷、特異性強(qiáng)，適用于動(dòng)物源性食品中沙拉沙星殘留的靈敏、快速篩選檢測(cè)。

5.3 FIA在毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

腹瀉性貝類(lèi)毒素是一種脂溶性毒素，人在食用后會(huì)產(chǎn)生以腹瀉為特征的中毒反應(yīng)。李軍濤等[61]制備檢測(cè)貝類(lèi)樣品中腹瀉性毒素的熒光免疫層析試紙條，此方法檢測(cè)限小于0.125 μg/mL，且對(duì)于其他貝類(lèi)毒素具有高度特異性。孫成彪等[62]以量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物，應(yīng)用熒光偏振免疫分析技術(shù)檢測(cè)河豚毒素，IC50為11.76 μg/L，檢測(cè)范圍為1.36～101.27 μg/L，檢測(cè)限可達(dá)0.67 μg/L。在該方法的檢測(cè)范圍內(nèi)，變異系數(shù)為2.60%，平均回收率為（99.91±2.60）%，且河豚毒素測(cè)定值與競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定值呈線(xiàn)性相關(guān)。

6 免疫磁分離技術(shù)

免疫磁分離技術(shù)（immunomagnetic separation，IMS）作為食物樣品的有效預(yù)濃縮工具，能夠快速?gòu)膹?fù)雜的食品基質(zhì)中選擇性分離和濃縮靶細(xì)菌[63-64]，需要與其他檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，目前主要用于動(dòng)物源性食品中致病菌的檢測(cè)。

樣品進(jìn)行免疫磁分離后，可避免由于食品中的大顆粒物質(zhì)對(duì)免疫膠體金試紙條造成干擾，導(dǎo)致出現(xiàn)其在試紙條上的移動(dòng)速度較慢和降低細(xì)菌檢出限的現(xiàn)象，從而顯著提高檢出率[65]。顧培科[66]建立免疫磁分離結(jié)合膠體金免疫層析法，用于檢測(cè)實(shí)際樣品（牛肉糜）中的大腸桿菌O157：H7，檢出限為7.6×103 CFU/mL。近年來(lái)，PCR及其衍生技術(shù)聯(lián)合免疫磁分離技術(shù)，因其特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)時(shí)間短成為目前聯(lián)合IMS快速檢測(cè)食源性致病菌中應(yīng)用最廣泛、最成熟的技術(shù)之一。國(guó)外有研究利用IMS-PCR聯(lián)合測(cè)定蝦中的副溶血弧菌，檢出限可達(dá)10 CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間僅為4～5 h[67]。對(duì)于牡蠣中的副溶血弧菌，利用IMS-環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），使檢測(cè)限達(dá)到1.9×103 CFU/mL，陽(yáng)性率與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法無(wú)顯著差異，并且穩(wěn)定、快速、簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)有效[68]。

Ma Kai等[69]運(yùn)用IMS-實(shí)時(shí)-多重PCR（IMS-real time-multiplex PCR，IMS-RT-mPCR）技術(shù)同時(shí)檢測(cè)出豬肉中的金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和志賀氏菌，檢測(cè)限分別可達(dá)9.6、2.0、6.8 CFU/mL。IMS因具有靶向特異性強(qiáng)、分離效率高、操作方便等特點(diǎn)，同時(shí)能有效減輕過(guò)程交叉污染，是最具潛力的食品樣品前處理技術(shù)[70]。

7 結(jié) 語(yǔ)

在人們?nèi)粘５娘嬍持?，?dòng)物源性食品占了很大比例。近些年，對(duì)于動(dòng)物源性食品中常出現(xiàn)的問(wèn)題已經(jīng)涌現(xiàn)出許多檢測(cè)方法。其中，免疫技術(shù)由于其成本低、靈敏性高、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物源性食品的快速檢測(cè)中越來(lái)越占據(jù)主導(dǎo)地位。但免疫技術(shù)在動(dòng)物源性食品中重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用很少，其對(duì)于重金屬的檢測(cè)選取的樣本多為水，這主要與肉類(lèi)樣本處理復(fù)雜、過(guò)程耗時(shí)及基質(zhì)干擾大有關(guān)[71]。目前重金屬檢測(cè)多需要大型儀器，價(jià)格昂貴，操作起來(lái)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，在接下來(lái)的研究中，免疫快速檢驗(yàn)應(yīng)用于動(dòng)物源性食品檢測(cè)中時(shí)應(yīng)集中于重金屬檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)核心技術(shù)的突破，使其可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

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收稿日期：2019-01-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31272547）

第一作者簡(jiǎn)介：職愛(ài)民（1976—）（ORCID： 0000-0003-1210-0394），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品安全檢測(cè)。E-mail： 50384000@qq.com