高 倞

(河南省新蔡縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 新蔡 463500)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)可以引起豬、山羊、水貂、貉、牛、梅花鹿等多種動(dòng)物及人發(fā)病,可以引起多種動(dòng)物及人的敗血癥、腦膜炎、肺炎、支氣管炎、泌尿系統(tǒng)及創(chuàng)傷感染等[1-2]。肺炎克雷伯氏菌是一種廣泛分布于自然界中的人獸共共患的條件性致病菌,主要存在多種動(dòng)物及人的呼吸道、消化道等,當(dāng)外界條件改變時(shí),機(jī)體抵抗力下降,可以引起該病的發(fā)生,發(fā)病率和死亡率均較高,成為威脅養(yǎng)殖業(yè)主要的細(xì)菌性傳染病之一[3]。相關(guān)研究表明了肺炎克雷伯氏菌病出現(xiàn)嚴(yán)重耐藥性,且多為多重耐藥,并且對(duì)β-內(nèi)酰胺類及碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生了廣泛的耐藥,給該病防治帶來(lái)了很大的困難[4]。本試驗(yàn)從駐馬店地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中采集患呼吸道疾病豬肺臟、鼻拭子等病料組織74份中分離得到了43株肺炎克雷伯氏菌,因此,對(duì)分離的43株肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行了致病性、血清型、耐藥性等部分生物學(xué)特性鑒定。為該地區(qū)豬肺炎克雷伯氏菌病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株來(lái)源 從駐馬店地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中采集患呼吸道疾病豬肺臟、鼻拭子等病料組織74份,進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定。

1.2 主要試劑 7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基、MIAC培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯,均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;ID32E腸桿科細(xì)菌鑒定試紙條,購(gòu)自法國(guó)梅里埃生物科技公司;抗菌藥物藥敏紙片,購(gòu)自上海宸功生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA DM-2 000marker、2×TaqMaster Mix,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;常規(guī)的試劑及儀器均由本所微生物與傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重22±2g左右昆明系小鼠220只,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 從駐馬店地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中采集患呼吸道疾病豬肺臟、鼻拭子等病料組織,無(wú)菌條件下劃線接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h,挑取優(yōu)勢(shì)菌接種于MIAC鑒別培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h。挑取單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng),染色鏡檢。

2.2 生化特性鑒定 按照ID32E腸道菌鑒定試條說(shuō)明書(shū),將純化培養(yǎng)的分離菌株加入ID32E腸道菌鑒定試條中,在37℃培養(yǎng)12 h～24 h,用全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)儀進(jìn)行生化特性鑒定。

2.3 細(xì)菌的16S rRNA PCR鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA,以提取的分離菌株的基因組DNA為模板,用細(xì)菌的16S rRNA基因序列通用引物 5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′ 對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR檢測(cè),用1%瓊脂糖檢測(cè)其目的條帶后,將分離菌株的目的基因回收后進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的基因序列進(jìn)行同源性比較與分析。

2.4 細(xì)菌致病性試驗(yàn)檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[5],對(duì)分離菌株人工感染小鼠進(jìn)行致病性試驗(yàn)。采用平板計(jì)數(shù)法將菌液濃度調(diào)整為(108CFU/mL),每株分離菌腹腔注射5只小鼠,劑量為0.3 mL(108CFU/mL),對(duì)照組腹腔注射等量的營(yíng)養(yǎng)肉湯。在攻毒12 h后,觀察其每組的小鼠發(fā)病及死亡情況,對(duì)于死亡的小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定。

2.5 細(xì)菌耐藥基因PCR檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[6],設(shè)計(jì)6對(duì)肺炎克雷伯氏菌莢膜血清型的引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。PCR體系為20 mL： 2 ×TaqMaster Mix 7 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA 2 μL,ddH2O 10 μL。 用梯度 PCR 進(jìn)行血清型檢測(cè),PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的基因序列進(jìn)行同源性比較與分析。

表1 引物序列

2.6 藥敏試驗(yàn) 用美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法對(duì)分離的致病性病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),參照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進(jìn)行結(jié)果判斷,分析其耐藥性。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 疑似肺炎克雷伯氏菌分離菌株在7%脫纖綿羊血培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形、扁平、明灰白色的半透明菌落,個(gè)別出現(xiàn)溶血現(xiàn)象;在MIAC培養(yǎng)基上為圓形、光滑、桃紅色菌落;染色鏡檢分離菌株為兩端鈍圓粗短桿菌狀的陰性菌。

3.2 生化鑒定結(jié)果 分離菌株均鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、接觸酶、尿素酶為陰性;甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)均呈陽(yáng)性;不發(fā)酵 D-麥芽糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇、L-鼠李糖;分離菌株用全自動(dòng)化微生物生化儀鑒定為肺炎克雷伯氏菌,評(píng)定結(jié)果合格率為98.9%～99.9%之間。經(jīng)統(tǒng)計(jì)采集的74份病料中分離得到43株分離菌為肺炎克雷伯氏菌。

3.3 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果 43株分離菌株均擴(kuò)增出大約為1 500 bp左右的目的基因條帶,與預(yù)期的一致(圖1)。分離菌株的測(cè)序結(jié)果后與GenBank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的基因序列同源性在97.9%～100.0%之間。證實(shí)了43株分離菌株為肺炎克雷伯氏菌。

3.4 細(xì)菌致病性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 攻毒組的小鼠在攻毒后的2～6 d,出現(xiàn)不同程度的發(fā)病與死亡,從死亡的小鼠體內(nèi)分離到了肺炎克雷伯氏菌,對(duì)照組小鼠無(wú)明顯的癥狀及死亡。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明,30株肺炎克雷伯氏菌分離株對(duì)小鼠具有致病性,為致病性肺炎克雷伯氏菌,占分離菌株的69.8%(30/43)。

圖1 分離菌株16S rRNA PCR結(jié)果

3.5 細(xì)菌血清型鑒定結(jié)果 由表2可知,分離的43株肺炎克雷伯氏菌屬于6種血清型,定型的40株,占分離菌株的93.0%,3株檢測(cè)出血清型。其中K20和K5為該地區(qū)肺炎克雷伯氏菌流行的主要血清型,分別占分離菌株的37.2%、27.9%。40株肺炎克雷伯氏菌血清型PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與與Gen-Bank中登錄的肺炎克雷伯氏菌參考株的血清型的基因序列同源性在98.9%～99.9%之間。

表2 分離菌株血清型鑒定結(jié)果

3.6 細(xì)菌耐藥性分析結(jié)果 藥敏試驗(yàn)由見(jiàn)表3可知,分離菌株對(duì)43株肺炎克雷伯氏菌分離菌株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素、多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶、阿米卡星、氟苯尼考7種藥物耐藥率較高,耐藥率在51.2% ～100%之間;對(duì)頭孢曲松、頭孢噻呋、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、多黏菌素4種藥物的耐藥率在18.6%～234.9%之間。

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由見(jiàn)表4可知,43株肺炎克雷伯氏菌分離菌株呈現(xiàn)多種耐藥性,耐12種藥物的有3株、耐11種藥物有5株、耐10種藥物有11株、耐12種藥物有12株、耐8種藥物有6株,耐7種藥物有4株,耐6種藥物有2株,其中耐10、9種藥物分離菌株最多,分別占分離菌株的25.6%、27.9%。

表4 多重耐藥性結(jié)果

4 討論

肺炎克雷伯氏菌屬中主要包括3個(gè)亞種,分別為肺炎克雷伯氏肺炎亞種、臭鼻亞種及鼻硬結(jié)亞種,3個(gè)亞種中肺炎克雷伯氏肺炎亞種分布最為廣泛,是引發(fā)多種動(dòng)物發(fā)病的主要的病原菌之一[2-5]。相關(guān)研究表明了在臨床中的感染僅次于大腸桿菌和綠膿桿菌,呈世界性分布,該菌當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí),該菌可以導(dǎo)致動(dòng)物體抵抗力下降,引起動(dòng)物感染發(fā)病,嚴(yán)重者可以造成敗血癥,個(gè)別的呈現(xiàn)急性死亡。本試驗(yàn)從駐馬店地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中采集患呼吸道疾病豬肺臟、鼻拭子等病料組織74份中分離得到了43株肺炎克雷伯氏菌,對(duì)分離的43株肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行了致病性、血清型、耐藥性等部分生物學(xué)特性鑒定。通過(guò)人工感染小鼠致病性結(jié)果顯示,分離的43株肺炎克雷伯氏菌中30株為致病性肺炎克雷伯氏菌,占分離菌株69.8%(30/43)。說(shuō)明了該地區(qū)豬肺炎克雷伯氏菌感染嚴(yán)重且有一定致病性,且在該地區(qū)廣泛流行,在豬的養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)引起重視。

本試驗(yàn)研究表明了分離的43株肺炎克雷伯氏菌屬于6種血清型,定型的40株,占分離菌株的93.0%,3株檢測(cè)出血清型。其中K20和K5為該地區(qū)肺炎克雷伯氏菌流行的主要血清型。與王建莉[6]報(bào)道存在一定差異性,可能與感染宿主不同或者與該菌流行的地域有關(guān),國(guó)內(nèi)關(guān)于豬源肺炎克雷伯氏菌血清型調(diào)查未見(jiàn)報(bào)道。

相關(guān)研究表明,肺炎克雷伯氏菌對(duì)藥物耐藥性的產(chǎn)生與擴(kuò)散,多重耐藥菌株出現(xiàn)的越來(lái)越多,降低了治療效果[7]。本試驗(yàn)研究表明,43株分離菌株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素等7種藥物耐藥性較高,耐藥率在51.2%以上,對(duì)其他藥物的耐藥率在18.6% ～234.9%之間,且呈現(xiàn)多重耐藥性,耐10、9種藥物分離菌株最多,分別占分離菌株的25.6%、27.9%。從而證實(shí)了該菌豬源肺炎克雷伯氏菌對(duì)常用抗菌藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性,呈現(xiàn)了多重耐藥性。因此,在養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)該引起重視。馮娜等[5]、王羽等[5]、韓坤等[8]、劉海林[9]等報(bào)道的與本試驗(yàn)研究存在一定的差異性,可能與感染的宿主或者地域有關(guān)。本試驗(yàn)為該地區(qū)豬源肺炎克雷伯氏桿菌的防治提供理論基礎(chǔ)。