納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥產(chǎn)物中抗氧化活性物質(zhì)的分離鑒定

趙謀明，鄒 穎，林戀竹,*，吳 見

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640 ；2.紐斯葆廣賽（廣東）生物科技股份有限公司，廣東 廣州 510931 ）

納豆菌高產(chǎn)蛋白酶和α-淀粉酶，可將蛋白以及糖類物質(zhì)水解成分子質(zhì)量較小的物質(zhì)如氨基酸、多肽和寡糖等，從而顯著提高其生物利用率[1]。利用微生物在生長過程中分泌的蛋白酶降解蛋白制備抗氧化肽已成為研究熱點(diǎn)[2]。此外，在微生物分泌的多種酶的催化下，結(jié)合型多酚可以通過生物轉(zhuǎn)化變成游離性多酚溶出，多酚的含量和種類可能會發(fā)生不同程度的變化[3]。本團(tuán)隊利用納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥，制備了富含谷物多酚且具有強(qiáng)抗氧化活性的發(fā)酵產(chǎn)物[4]。此外，本團(tuán)隊前期研究結(jié)果表明：納豆菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者是谷物多酚類以及肽類物質(zhì)[5]。由于發(fā)酵底物不僅有蕎麥還有大豆分離蛋白水解物，并且微生物在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多種蛋白酶，不同蛋白酶的作用位點(diǎn)和作用方式也不盡相同，這使得發(fā)酵產(chǎn)物中肽類物質(zhì)組成復(fù)雜。因此需要使用多種分離純化技術(shù)對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化以獲得目標(biāo)抗氧化肽，并結(jié)合超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用法（ultra performance liquid chromatographyquadrupole-time of flight-tandem mass spectrum，UPLC-QTOF-MS/MS）鑒定肽段序列。

本實(shí)驗旨在通過UPLC-MS/MS技術(shù)鑒定發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物中多酚組成與結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上，通過超濾、乙醇分級沉淀、大孔樹脂柱層析定向分離抗氧化肽，采用UPLC-MS/MS鑒定多肽組成與結(jié)構(gòu)，為納豆菌發(fā)酵蕎麥產(chǎn)富含多酚、生物活性肽且具有強(qiáng)抗氧化活性的發(fā)酵產(chǎn)物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆菌（Bacillus subtilis natto）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院贈送；蕎麥 南沙舊鎮(zhèn)天匯百貨超市；大豆分離蛋白 廣州合誠實(shí)業(yè)有限公司。

2,2-偶氮二(2-二甲基丙基咪)二鹽酸鹽（2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride，AAPH）、熒光素、Trolox 美國Sigma公司；大豆蛋白胨 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；NS37071水解蛋白酶、α-淀粉酶丹麥諾維信公司；色譜純甲酸、甲醇、乙腈 德國Merck公司；XAD-16大孔樹脂 北京慧德易科技有限責(zé)任公司；實(shí)驗所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash型酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；UV-721型紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器儀表有限公司；LRH-250A-II生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SKY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器 江蘇蘇昆儀器有限公司；BioStat B2.5 L發(fā)酵罐 德國Sartorius公司；AcquityI超高效液相色譜儀、Acquity UPLC T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美國Waters公司；ImpactII高分辨四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)物的制備

蕎麥浸泡6 h后，按料液比1∶10（m/V）加水打漿，加入體積分?jǐn)?shù)0.4% α-淀粉酶，90 ℃加熱40 min，補(bǔ)充NS37071水解蛋白酶酶解12 h時所制得的酶解物（添加量0.4%，體積分?jǐn)?shù)），調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值至7.0，接種量3%（體積分?jǐn)?shù)），通氣量3.5 L/min，轉(zhuǎn)速300 r/min，裝液量1.2 L，2.5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵36 h。1 500×g離心10 min，上清液即為發(fā)酵產(chǎn)物。

1.3.2 超濾膜分離發(fā)酵產(chǎn)物

用超濾膜（截留分子質(zhì)量10 kDa）對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離，超濾膜板出口壓力為2.0×105Pa，收集所得Mw＜10 kDa的組分。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物的制備

取Mw＜10 kDa組分，55 ℃減壓濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，按1∶2（V/V）加入乙酸乙酯，萃取3 次，收集乙酸乙酯相，合并，45 ℃減壓蒸干，溶于1 mL二甲基亞砜，即得到發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)物中抗氧化肽的導(dǎo)向分離

1.3.4.1 乙醇分級沉淀

收集水相，55 ℃減壓濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，向濃縮液中加入無水乙醇，使體系中的最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%，攪拌均勻，4 ℃靜置12 h，室溫離心（1 500×g、20 min），得到沉淀物1和上清液1，將沉淀物1溶于水中，55 ℃減壓濃縮去除乙醇，濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為20%，冷凍干燥得體積分?jǐn)?shù)20%醇沉組分。將上清液1減壓濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，加入無水乙醇，使體系中的最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，攪拌均勻，4 ℃靜置12 h，室溫離心（1 500×g、20 min），制得沉淀物2和上清液2，將沉淀物2溶于水中，55 ℃減壓濃縮去除乙醇，濃縮至固形物含量約為20%，冷凍干燥得40%醇沉組分，依次類推，分別制得體積分?jǐn)?shù)60%醇沉組分、體積分?jǐn)?shù)80%醇沉組分，最后剩余上清液去除乙醇后同樣進(jìn)行冷凍干燥，記為上清液組分。

1.3.4.2 大孔樹脂柱層析分離富集抗氧化肽

取XAD-16大孔樹脂，加入無水乙醇浸泡12 h，溶脹后抽濾去除乙醇，加入蒸餾水反復(fù)洗滌樹脂至無醇味。加入1 mol/L NaOH浸泡4 h，抽濾除去NaOH溶液，并用蒸餾水反復(fù)洗滌大孔樹脂直至洗滌液的pH值為7.0。加入1 mol/L HCl浸泡4 h，抽濾除去HCl溶液，并用蒸餾水反復(fù)洗滌大孔樹脂直至洗滌液的pH值為7.0。預(yù)處理后的XAD-16大孔樹脂經(jīng)過無水乙醇溶脹且蒸餾水洗滌后裝入玻璃層析柱（2.5 cm×100 cm）中，通過蒸餾水壓實(shí)和平衡；準(zhǔn)確稱取5 g樣品，加入5 mL蒸餾水溶解；小心地向?qū)游鲋屑尤霕悠啡芤海瑢⑸蠘雍蟮膶游鲋湃牒銣貙游龉裰羞^夜（4 ℃）；吸附平衡后，將層析柱取出放置于室溫，依次用蒸餾水以及體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%、80%乙醇溶液和無水乙醇各500 mL進(jìn)行動態(tài)解吸。解吸時，設(shè)定各解吸液流速為5 mL/min。收集不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液，55 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，直至濃縮液沒有乙醇味并濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%左右，冷凍干燥，即得到各組分。

1.3.4.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS分離鑒定多酚類化合物

色譜柱為Acquity UPLC T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，流速為0.2 mL/min。以體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液作為流動相A，以甲醇作為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序為：0 min，90% A、10% B；0～2 min，65% A、35% B；2～5 min，35% A、65% B；5～7 min，0% A、100% B；7～10 min，90% A、10% B。采用電噴霧離子源，正離子模式，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為50～800。毛細(xì)管電壓3 000 V、干燥器溫度180 ℃，Auto MS/MS模式，數(shù)據(jù)分析采用Data Analysis 4.1軟件。

1.3.4.4 UPLC-Q-TOF-MS/MS分離鑒定多肽序列

色譜柱為Acquity UPLC T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量1 μL，洗脫流速為0.20 mL/min。以體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液作為流動相A，以乙腈作為流動相B進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序為：0 min，70% A；0～6 min，70%～40% A；6～7 min，40%～20% A；7～8 min，20%～70% A；8～10 min，70% A。采用電噴霧離子源，正離子模式，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為50～2 000。毛細(xì)管電壓3 500 V、溫度200 ℃，噴霧器電壓4.5 kV，Auto MS/MS模式，數(shù)據(jù)分析采用Data Analysis 4.1軟件。對少于6 個氨基酸的肽段采用Data Analysis 4.1軟件進(jìn)行手動Denovo測序；大于6 個氨基酸的肽段通過Mascot數(shù)據(jù)庫搜索匹配。

1.3.4.5 氧自由基吸收能力的測定

在微孔板中分別加入25 μL樣品溶液或Trolox溶液，或緩沖液（75 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，pH 7.4）， 然后加入75 μL 0.159 μmol/L熒光素鈉溶液，37 ℃孵育10 min后，加入100 μL 38.25 mmol/L AAPH，保持反應(yīng)體系溫度恒定為37 ℃，設(shè)定激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為530 nm，開始計時反應(yīng)并讀數(shù)（f0），每分鐘讀一次數(shù)，分別記為f1, f2, ..., f70，共讀71 次數(shù)（共計反應(yīng)70 min），將每次讀數(shù)連成曲線。計算公式如式（1）、（2）所示。

式中：AUC為曲線下的面積；Trolox濃度與NetAUC呈線性關(guān)系，換算得到樣品的氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），即達(dá)到每克樣品的ORAC所需Trolox的物質(zhì)的量。ORAC越高，則樣品抗氧化活性越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0軟件中的方差分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗分析，以P＜0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物多酚提取物分離與結(jié)構(gòu)鑒定

本研究通過一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息，采用Data Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)庫匹配，再與文獻(xiàn)報道進(jìn)行比對，最終鑒定多酚結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表1所示。共鑒定出8 種多酚類化合物：咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、綠原酸、兒茶素、蘆丁、牡荊素和金絲桃苷。多酚類化合物UPLC-BPC譜圖和UPLC-UV譜圖如圖1所示。

化合物1分子離子峰[M+H]+為181.045 6，在二級質(zhì)譜圖中的基準(zhǔn)峰為137.045 3，與文獻(xiàn)[6]報道的一致，鑒定為咖啡酸。

化合物2分子離子峰[M+H]+為155.073 9，在二級質(zhì)譜圖中的基準(zhǔn)峰為111.072 2，丟失CO2[M+H-44]+產(chǎn)生離子碎片111.072 2，與文獻(xiàn)[7]報道的一致，鑒定為原兒茶酸。

化合物3分子離子峰[M+H]+為199.087 1，在二級質(zhì)譜圖中的基準(zhǔn)峰為155.073 0，丟失CO2[M+H-44]+產(chǎn)生離子碎片155.073 0，與文獻(xiàn)[8]報道的一致，鑒定為丁香酸。

化合物4分子離子峰[M+H]+為355.152 5，在二級質(zhì)譜圖中，分子離子峰裂解產(chǎn)生碎片離子193.054 5，是奎寧酸的特征離子碎片，與文獻(xiàn)[9]中報道一致，鑒定為綠原酸。

化合物5分子離子峰[M+H]+為291.147 7，在二級質(zhì)譜圖中的基準(zhǔn)峰為247.239 3，丟失CO2[M+H-44]+產(chǎn)生離子碎片247.239 3，進(jìn)一步裂解產(chǎn)生特征碎片離子123.041 5、165.082 3、139.120 3，根據(jù)文獻(xiàn)[10]報道的二級質(zhì)譜碎片信息，鑒定為兒茶素。

化合物6分子離子峰[M+H]+為611.175 9，在二級質(zhì)譜圖中，分子離子峰裂解產(chǎn)生碎片離子，丟失鼠李糖和葡萄糖[M-（146+162）]+產(chǎn)生槲皮素的特征離子碎片峰303.059 3，基峰離子303.059 3進(jìn)一步裂解產(chǎn)生特征碎片離子165.156 2、153.021 4、137.059 6，與文獻(xiàn)[11]報道的一致，鑒定為蘆丁。

化合物7分子離子峰[M+H]+為433.261，在二級質(zhì)譜圖中，分子離子峰裂解，丟失120中性分子葡萄糖基[M+H-120]+產(chǎn)生的特征離子碎片峰313.187，通過與文獻(xiàn)[12]比對，鑒定為牡荊素。

化合物8分子離子峰[M+H]+為465.324 3，在二級質(zhì)譜圖中，分子離子峰裂解產(chǎn)生碎片離子303.052 1，是槲皮素的特征離子碎片，進(jìn)一步裂解產(chǎn)生特征碎片離子247.013 4、165.156 2、153.021 4，根據(jù)文獻(xiàn)[13]報道的二級質(zhì)譜碎片信息，鑒定為金絲桃苷。

咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、綠原酸、兒茶素、蘆丁、牡荊素、金絲桃苷已經(jīng)在蕎麥中被鑒定出來：Wiczkowski等[14]等采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法從蕎麥中分離鑒定出咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、綠原酸等酚酸；Guo Xudan等[15]采用HPLC法從蕎麥中分離鑒定出蘆丁、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、丁香酸、綠原酸等多酚類化合物，其中蘆丁含量最高，其次對羥基苯甲酸、原兒茶酸為主要的酚酸，且抗氧化活性（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基清除能力和還原力）與蘆丁和對羥基苯甲酸的含量有密切的正相關(guān)關(guān)系；Seo等[16]采用HPLC法從蕎麥中分離鑒定出綠原酸、牡荊素、異牡荊素、葒草素、異葒草素、蘆丁、槲皮素等酚類化合物，蘆丁、兒茶素、槲皮素是蕎麥中主要的多酚類化合物，對抗氧化活性貢獻(xiàn)較高。發(fā)酵產(chǎn)物中多酚類化合物來源于蕎麥，采用納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥，可從蕎麥中高效萃取多酚。

表1 發(fā)酵產(chǎn)物多酚類化合物鑒定結(jié)果Table 1 Identi fi cation of phenolics in the fermentation product by UPLC-MS/MS

圖1 發(fā)酵產(chǎn)物多酚類化合物UPLC-BPC圖（A）和UPLC-UV圖（B）Fig. 1 Base peak chromatogram (A) and UV chromatogram (B) at 262 nm of phenolics in the fermentation product

本團(tuán)隊前期研究結(jié)果表明：咖啡酸和綠原酸屬于多羥基肉桂酸，苯環(huán)上含有兩個鄰位羥基，具有較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，能有效抑制紅細(xì)胞內(nèi)MDA的生成，減少紅細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到對人紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[17]。原兒茶酸清除羥自由基的能力很強(qiáng)，其在小鼠實(shí)驗中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化和抗高血壓的活性[18]。丁香酸也具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能有效抗炎、抗菌、抑制低密度脂蛋白氧化、清除自由基[19]，且據(jù)報道抗氧化活性強(qiáng)的酚類提取物，一般來說均具有較高含量的咖啡酸和丁香酸[20]。蘆丁具有很強(qiáng)的抗氧化活性，具有抗炎、抗癌的功效，對心血管疾病以及高血糖、高血脂等慢性疾病具有較好的防治作用[15]。兒茶素是普通品種蕎麥主要發(fā)揮抗氧化活性的多酚類化合物，DPPH自由基清除能力為2 μmol Trolox/gmd[21]。牡荊素能有效預(yù)防紫外線導(dǎo)致的皮膚細(xì)胞損傷，起到抗氧化的效果[22]。發(fā)酵產(chǎn)物含有種類豐富的多酚化合物，這些化合物具有顯著的抗氧化活性，是發(fā)酵產(chǎn)物中重要的抗氧化物質(zhì)。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化肽導(dǎo)向分離鑒定

2.2.1 發(fā)酵產(chǎn)物（Mw＜10 kDa）乙醇分級沉淀結(jié)果分析

表2 發(fā)酵產(chǎn)物（Mw＜10 kDa）的分級醇沉組分得率、蛋白含量與抗氧化活性Table 2 Yields, protein contents and antioxidant activities of fractions obtained by gradient ethanol precipitation method from the fermentation product（Mw < 10 kDa）

ORAC法是目前最為簡單、準(zhǔn)確、靈敏的評價抗氧化活性的方法[23]。本實(shí)驗以O(shè)RAC為評價指標(biāo)，從發(fā)酵產(chǎn)物中導(dǎo)向分離抗氧化肽。據(jù)報道，生物活性肽的分子質(zhì)量小于10 kDa[24]，故將發(fā)酵液用超濾膜（截留分子質(zhì)量10 kDa）進(jìn)行分離，收集所得Mw＜10 kDa的組分用于下一步的分離。分級醇沉是利用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇可一定程度降低體系的介電常數(shù)，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀，而不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇利用其不同的介電常數(shù)和爭奪水化水的能力可對具有不同親水能力及結(jié)構(gòu)特性的組分進(jìn)行初步分離[25]。本實(shí)驗首先采用乙醇分級沉淀法對發(fā)酵產(chǎn)物（Mw＜10 kDa）進(jìn)行初級分離，得到5 個不同的分級組分，結(jié)果如表2所示。體積分?jǐn)?shù)（下同）20%和40%醇沉組分得率較低，而60%和80%醇沉組分和上清液組分得率較高，是發(fā)酵產(chǎn)物（Mw＜10 kDa）中主要的組成成分。此外，60%和80%醇沉組分蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高，分別為27.67%和25.89%，顯著高于其余組分。各組分的抗氧化活性從強(qiáng)到弱依次是：上清液組分＞80%醇沉組分＞60%醇沉組分＞40%醇沉組分＞20%醇沉組分。80%醇沉組分得率最高，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，抗氧化活性強(qiáng)，對其進(jìn)行下一步分離純化，以期獲得蛋白含量高、抗氧化活性更強(qiáng)的肽。

2.2.2 大孔樹脂柱層析分離富集發(fā)酵產(chǎn)物中抗氧化肽

大孔樹脂具有吸附特性以及分子篩作用，大孔吸附樹脂法就是利用極性和孔徑不同的大孔樹脂對生物活性肽進(jìn)行分離純化。大孔樹脂以其高效安全、富集能力強(qiáng)、低耗環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)受到研究者的青睞[26]。任堯[27]采用大孔樹脂柱層析法對鴨蛋清蛋白中抗氧化肽進(jìn)行高效分離，說明該方法是一種高效分離純化多肽的方法。

表3 大孔樹脂柱層析組分得率、蛋白含量及抗氧化活性Table 3 Yields, protein contents and antioxidant activities of fractions obtained by macroporous resin column chromatography

如表3所示，80%乙醇和無水乙醇洗脫組分幾乎沒有得到產(chǎn)物。其中，水洗脫組分的得率最高，但其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。各洗脫組分的蛋白質(zhì)含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，其中40%與60%乙醇洗脫組分的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到67%左右，說明XAD-16大孔樹脂可有效富集肽。各組分抗氧化活性從強(qiáng)到弱依次為：40%乙醇洗脫組分＞60%乙醇洗脫組分＞80%乙醇洗脫組分＞20%乙醇洗脫組分＞水洗脫組分。40%乙醇洗脫組分的抗氧化能力顯著高于其他組分。與大孔樹脂吸附分離之前的樣品（80%醇沉組分）相比，40%乙醇洗脫組分ORAC提升了4.25 倍，達(dá)到1 731.52 μmol/g。

2.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物中抗氧化肽段鑒定

采用UPLC-MS/MS法從40%乙醇洗脫組分中共分離鑒定得到27 條肽段，圖2為40%乙醇洗脫組分的UPLC-BPC以及UPLC-UV結(jié)果。觀測到以m/z100～200、400～900居多，手動De novo測序得到的寡肽（LF、FF、VQL、EVF）較少，主要是通過Mascot數(shù)據(jù)庫匹配得到的多肽（七肽以上）?？赡苁怯捎诎l(fā)酵過程中，納豆菌優(yōu)先利用了分子質(zhì)量較小的寡肽以及游離氨基酸用于產(chǎn)酶所致。

圖2 40%乙醇洗脫組分的UPLC-BPC圖（A）以及UPLC-UV圖（B）Fig. 2 Base peak chromatogram (A) and UV chromatogram (B) at 280 nm of 40% ethanol-eluted fraction

表4 40%乙醇洗脫組分中通過Mascot數(shù)據(jù)庫（大豆蛋白）搜索得到的肽段Table 4 Peptides identi fi ed by database (soy protein) search using Mascot in 40%ethanol-eluted fraction

表5 40%乙醇洗脫組分中通過Mascot數(shù)據(jù)庫（蕎麥蛋白）搜索得到的肽段Table 5 Peptides identi fi ed by database (buckwheat protein) search using Mascot in 40%ethanol-eluted fraction

根據(jù)40%乙醇洗脫組分的二級質(zhì)譜圖，搜索Mascot數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)23 條匹配的肽段，結(jié)果如表4、5所示。根據(jù)文獻(xiàn)報道，基于氨基酸的抗氧化性強(qiáng)弱，將17 種氨基酸分為4 類，第I類包括Tyr、Trp、Cys、Met和His，具有強(qiáng)抗氧化活性；第II類包括Leu、Pro、Phe和Val，具有中等抗氧化活性；第III類包括Asp和Glu，具有弱抗氧化活性；第IV類包括其余7 種氨基酸，抗氧化性微弱或沒有抗氧化活性[28]。氨基酸組成不同會極大地影響多肽的抗氧化活性，含有抗氧化氨基酸（Tyr、Trp、Cys、His、Met）、疏水性氨基酸（Leu、Ile、Pro、Phe等）的多肽通常具有較強(qiáng)的抗氧化活性[29]。Tyr上的酚羥基以及Trp上的吲哚基能夠直接作為供氫體從而捕獲自由基，同時自身又能通過共振結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定的化合物，因而通常被認(rèn)為具有很強(qiáng)的自由基清除能力[30]。Cys含有一個巰基，該基團(tuán)不僅具有非常強(qiáng)的供電子及供氫能力，也具有非常強(qiáng)的還原能力，對于Met，其側(cè)鏈基團(tuán)的S原子也能提供電子[31]，因而也具有一定的自由基清除能力；據(jù)報道，含His殘基的肽抑制脂質(zhì)過氧化的能力，可能與其His殘基上咪唑基的自由基清除能力及螯合金屬能力有關(guān)。His側(cè)鏈上的咪唑基團(tuán)可以螯合金屬離子、猝滅自由基并抑制脂質(zhì)過氧化[32]。疏水性的氨基酸殘基能夠提高肽在脂相中的溶解度，有利于肽與脂質(zhì)中自由基的相互作用，從而能夠提高抗氧化肽抑制脂質(zhì)過氧化的能力[33]。酸性氨基酸（Glu及Asp）和堿性氨基酸能夠通過它們帶電荷的側(cè)鏈基團(tuán)與金屬離子形成復(fù)合物，從而具有螯合促氧化的金屬離子的作用[34]。

其中，搜索大豆蛋白庫得到的肽段分子質(zhì)量差值在±0.01以下，得到8 條多肽，均為七肽以上，最短為七肽，最長為十五肽，在BIOPEP數(shù)據(jù)庫（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）中搜索均未經(jīng)報道。所鑒定的肽段都包含疏水性氨基酸（Leu、Ile、Pro、Phe等），其中有2 條肽段（GDKIYNVF、PEGKGSFWIH）含有至少一個強(qiáng)抗氧化氨基酸（Tyr、Trp、Cys、His、Met）。搜蕎麥蛋白庫得到的肽段，分子質(zhì)量差值在±0.01以下，得到15 條多肽，均為七肽以上，最短為七肽，最長為十五肽，在BIOPEP數(shù)據(jù)庫當(dāng)中搜索均未經(jīng)報道，且所有肽段都包含疏水性氨基酸（Leu、Ile、Pro、Phe等），其中有9 條肽段（DPVSGTIVIDGIDISMI、HTINLAL、CRNLLLYPAGA、PWFFTST、VHGVPLIT、LVLSSAMG、KEGKCVACEM、LVPQDCL、KEKLERLCK）含有至少一個強(qiáng)抗氧化氨基酸（Tyr、Trp、Cys、His、Met）。

搜索Mascot數(shù)據(jù)庫得到的七肽以上的多肽在BIOPEP數(shù)據(jù)庫中搜索均未經(jīng)報道，但蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)入人體后，會被胃腸道中的多種酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和上皮細(xì)胞表面的肽酶）水解，所釋放的短肽被吸收并通過血液循環(huán)到達(dá)靶器官[35]。GDKIYNVF中的IY二肽片段、CRNLLLYPAGA中的LY二肽片段、PWFFTST中的PW二肽片段以及QGSGGPPIV中的GPP三肽片段等在BIOPEP數(shù)據(jù)庫中均被報道具有抗氧化活性。

3 結(jié) 論

采用乙酸乙酯萃取法，分離富集發(fā)酵液中多酚，并對多酚結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，共鑒定出8 種蕎麥多酚：咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、綠原酸、兒茶素、蘆丁、牡荊素、金絲桃苷，是發(fā)酵產(chǎn)物中重要的抗氧化物質(zhì)。采用納豆菌液態(tài)發(fā)酵蕎麥，可從蕎麥中高效萃取多酚。

采用超濾、乙醇分級沉淀及XAD-16大孔樹脂對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得富含抗氧化肽的洗脫組分（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.51%、ORAC為1 731.52 μmol /g）。從發(fā)酵產(chǎn)物中共分離鑒定出27 條多肽，在BIOPEP數(shù)據(jù)庫中搜索均未經(jīng)報道，且所有肽段都包含疏水性氨基酸，其中有11 條肽段含有至少一個強(qiáng)抗氧化氨基酸。GDKIYNVF中的IY片段、CRNLLLYPAGA中的LY片段、PWFFTST中的PW片段以及QGSGGPPIV中的GPP片段等在BIOPEP數(shù)據(jù)庫中均被報道具有抗氧化活性。所鑒定的多肽是發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化活性重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗的研究結(jié)果可為利用納豆菌液態(tài)發(fā)酵谷物制備富含谷物多酚、多肽且具有強(qiáng)抗氧化活性的發(fā)酵產(chǎn)物提供理論支持。