薛 輝，涂勇剛，熊春紅，李建科，羅文翔，趙 燕,*

（1.南昌大學(xué) 生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

抗菌肽，又稱抗微生物肽，是一類具有抑菌功能的特殊生物活性肽?？咕囊话阌?5～50 個(gè)氨基酸構(gòu)成，帶正電荷，呈兩親性，它們的分子質(zhì)量相對(duì)較小，容易到達(dá)被感染的位置[1-2]，且有廣譜抗菌活性；抗菌肽具有不同于傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)制，不易產(chǎn)生耐藥性，因此被認(rèn)為是最有希望代替抗生素的物質(zhì)[3-6]。抗菌肽除了在醫(yī)藥領(lǐng)域最有希望替代抗生素外，在食品、飼料行業(yè)也有廣泛的應(yīng)用，目前被批準(zhǔn)用作食品添加劑的抗菌肽有Nisin（乳酸鏈球菌素）[7]和ε-聚賴氨酸[8]。在動(dòng)物飼料中添加少量的抗菌肽就可以達(dá)到增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力、提高飼料利用率的效果；還可以降低抗生素的使用量，減少人們因食用了被抗生素污染的畜禽制品而產(chǎn)生的一系列問(wèn)題[9-11]?？咕牡闹T多優(yōu)點(diǎn)使其成為食品、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，自從上世紀(jì)八十年代瑞典科學(xué)家Boman從惜古比天蠶中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)抗菌肽——天蠶素，之后有很多抗菌肽被發(fā)現(xiàn)[12-13]。從來(lái)源廣泛、成分復(fù)雜的原料中篩選出抗菌肽是其研究和廣泛應(yīng)用的前提和關(guān)鍵，傳統(tǒng)的篩選方法多以體外抑菌活性為導(dǎo)向，采用提取、分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定等步驟進(jìn)行跟蹤式篩選抗菌活性組分，其往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力且效果不佳；而近年來(lái)出現(xiàn)的細(xì)胞膜色譜法等快速篩選方法具有新型、高效、靶向性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，其大大提高了抗菌肽的篩選效率，成為目前人們研究的熱點(diǎn)。無(wú)論是傳統(tǒng)篩選方法還是新發(fā)明的快速篩選方法，從天然資源的寶庫(kù)中獲得抗菌肽一般包括抗菌粗肽的制備和抗菌肽的篩選兩大步驟。

1 抗菌粗肽的制備

抗菌肽廣泛存在于多種生物體內(nèi)，是生物機(jī)體抵抗病原體侵害的第一道防線，且在不同的生物體內(nèi)存在的部位也是不一致的，如兩棲動(dòng)物的皮膚黏液，哺乳動(dòng)物的血液和腸道、微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物等。對(duì)于來(lái)源如此復(fù)雜的抗菌肽，一次性直接提取抗菌肽難度較大，因此，需要首先制備抗菌粗肽，然后再?gòu)目咕蛛闹泻Y選抗菌肽，而抗菌粗肽的制備首先考慮的是預(yù)處理方法，根據(jù)原材料的不同選擇不同的預(yù)處理方法?？咕膹V泛存在于自然界生物中，對(duì)于自然存在于生物體內(nèi)的或誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生的天然抗菌肽，多采用溶劑提取法將其從原料中提取，其中乙酸是使用頻率最高的提取劑。Chaparro等[14]用乙酸浸提除去頭部和鉗子的巴西蜈蚣，經(jīng)冰浴攪拌、離心等步驟制得抗菌粗肽。溶劑提取法是提取抗菌粗肽最常用的方法，其操作簡(jiǎn)單；但是該法提取效果相對(duì)較差，且容易破壞對(duì)酸或者高濃度鹽敏感的抗菌肽，使其失活，減少抗菌肽的種類，并且產(chǎn)生較多有毒有害的廢料，對(duì)操作人員和環(huán)境的傷害較大。對(duì)于蛋白質(zhì)含量較高的原料和微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物常使用硫酸銨沉淀法，該法利用高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)的原理，其技術(shù)含量相對(duì)較低，易操作。Regmi等[15]取泡菜中分離的植物乳酸桿菌用硫酸銨粗提得到抗菌粗肽。硫酸銨沉淀是鹽析的原理，跟蛋白（肽）的疏水性質(zhì)有關(guān)，經(jīng)硫酸銨沉淀后，部分抗菌肽可能在上清液中，部分會(huì)在硫酸銨的作用下沉淀，如果只在其中一部分篩選可能會(huì)導(dǎo)致抗菌肽“丟失”。蛋白酶限制性酶解富含蛋白質(zhì)的原料也是抗菌肽的制備途徑之。Bougherra等[16]用細(xì)胞外絲氨酸金屬蛋白酶酶解牛酪蛋白得到粗肽。該方法反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)過(guò)程容易控制，并且本身無(wú)抗菌作用的蛋白質(zhì)也可能通過(guò)酶解的方法獲得抗菌活性，而抗菌蛋白也可以作為酶解作用的前體物質(zhì)釋放一些新的抗菌肽類；因此蛋白酶酶解法可能開辟一條新型的大規(guī)模制備有效、安全性高抗菌肽的具有成本效益的戰(zhàn)略之路[17]，但是該方法水解產(chǎn)物復(fù)雜，易導(dǎo)致后續(xù)分離難度加大，分離成本增加。

其他制備方法如超濾等也曾用于抗菌肽的研究中，但溶劑提取法、硫酸銨沉淀法、蛋白酶酶解法這幾種方法比較常用，存在各自的特點(diǎn)（表1），具體可根據(jù)原料和目的的不同選擇以獲得預(yù)期的效果。

表1 抗菌粗肽制備方法的比較Table 1 Comparison of preparation methods for crude antibacterial peptides

2 抗菌肽的快速篩選

抗菌粗肽的純度和抗菌效果均難達(dá)到研究和應(yīng)用的要求，為此還需對(duì)抗菌粗肽進(jìn)行再次篩選。研究初期常使用傳統(tǒng)的篩選方法，它是把制備好的抗菌粗肽經(jīng)RP-HPLC、凝膠層析等反復(fù)純化，結(jié)合抗菌實(shí)驗(yàn)以得到純的單一抗菌肽，此類篩選方法又稱作“活性制導(dǎo)純化”[33]，Maria等[21]取巴西的Lecythy pisonis樹的種子，經(jīng)石油醚脫脂后，于含體積分?jǐn)?shù)1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1 mol/L HCl、體積分?jǐn)?shù)5%甲酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaCl的溶液中浸提1 h，離心后經(jīng)C8和C18RP-HPLC分離，將分離得到的組分進(jìn)行抑菌檢測(cè)，取其中最強(qiáng)抑菌的組分F4再次經(jīng)C18RP-HPLC分離，再次做抑菌實(shí)驗(yàn)，得到最強(qiáng)抗菌活性組分F4.7'命名為L(zhǎng).pisonisdefensin1，其氨基酸序列為DVCESQSHRFHGA CVSNTNCANVCRTEGFPGGHCRG，該抗菌肽對(duì)白色念珠菌具有極強(qiáng)的抑菌活性，研究表明其是通過(guò)損害細(xì)菌的線粒體使細(xì)菌死亡從而達(dá)到抑菌效果。傳統(tǒng)方法靶向性不強(qiáng)、耗時(shí)耗力、成本較高，多用于科學(xué)研究。

隨著抗菌肽研究的不斷深入，越來(lái)越多的快速篩選方法逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，初期快速篩選的方法是根據(jù)抗菌肽的抗菌機(jī)制而發(fā)展起來(lái)的?？咕膩?lái)源廣泛、種類繁多，目前還沒(méi)有統(tǒng)一的適用于所有抗菌肽的抗菌機(jī)制；但無(wú)論抗菌肽采用何種作用方式，大多數(shù)抗菌肽都會(huì)與細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生作用，這也是目前大部分抗菌肽快速篩選的理論依據(jù)，但是這些方法一般一次性只能提取幾種抗菌肽；后來(lái)有學(xué)者從分子和基因角度進(jìn)行研究，發(fā)明了能一次篩選多種抗菌肽的方法。與傳統(tǒng)篩選方法相比，快速篩選方法具有靶向性、高效性。目前有報(bào)道的快速篩選方法包括抗菌肽-細(xì)菌吸附結(jié)合法、細(xì)胞膜色譜法、模擬細(xì)胞膜色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜自顯影法和高通量測(cè)序法等。

2.1 抗菌肽-細(xì)菌吸附結(jié)合法

抗菌肽-細(xì)菌吸附結(jié)合法是利用抗菌肽與微生物作用前期與細(xì)菌膜吸附結(jié)合的原理，通過(guò)對(duì)比與微生物孵育前后液相色譜或凝膠過(guò)濾層析圖譜，找出孵育后減少或消失的峰，收集減少或消失的峰即可能是潛在抗菌肽（抗菌粗肽中的抗菌肽與細(xì)菌吸附結(jié)合使得其含量減少）。高飛[34]取蠅蛆和大豆蛋白經(jīng)粗制備后，與培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌充分混合孵育，經(jīng)離心后過(guò)濾、冷凍干燥得到孵育后樣品，然后將孵育前后的樣品經(jīng)超高效液相色譜分析，篩選出減少或消失的峰，分別命名為HLP7和HLP8（蠅蛆），F(xiàn)SP6、FSP8和FSP9（大豆），經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列分別為：KPPLNGPAL、QPVYHWYWH、VVTSSSLP、RMRLLLRRKGGQ和RVLLLPAFAEK，這5 個(gè)組分對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、枯草桿菌與金黃色葡萄球菌等致病菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性，其中FSP8和FSP9對(duì)工程菌也有抗菌活性。郝剛等[35]以牦牛血的胰蛋白酶水解液為原料，用此法得到抗菌肽YakB-1和YakB-2，兩者對(duì)細(xì)菌和真菌都具有抗菌活性，總體上說(shuō)抗菌肽YakB-2對(duì)細(xì)菌的抗菌活性比YakB-1強(qiáng)，但是YakB-1對(duì)真菌的抑菌活性更強(qiáng)。

該方法通過(guò)對(duì)比粗肽經(jīng)細(xì)菌混合孵育前后所得液相的差異峰即可鎖定抗菌肽所在峰位置，與傳統(tǒng)方法相比，大幅縮短了篩選時(shí)間，但是使用的活體細(xì)菌除了會(huì)吸附抗菌肽外，還可能會(huì)吸收粗肽中的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致峰減少或者消失，使得收集的峰不全是抗菌肽，其準(zhǔn)確性相對(duì)低，加大了后面分離的難度，僅適用于科研層面對(duì)抗菌肽的研究。

2.2 細(xì)胞膜色譜法

細(xì)胞膜色譜法是將活性組織細(xì)胞膜結(jié)合到特定載體表面制成細(xì)胞膜固定相，再利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中藥物與與固定相上細(xì)胞膜及膜受體的相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法。被分析成分如果與特定的細(xì)胞膜受體存在特異性結(jié)合，就可在細(xì)胞膜色譜模型中反映出來(lái)。該法由賀浪沖等[36]首創(chuàng)，起初是用于中草藥中藥效成分的篩選，后來(lái)根據(jù)該法的原理結(jié)合抗菌肽的作用機(jī)制將其用于抗菌肽的研究。Xiao Jianhui等[37-39]先將脫毒后的麻風(fēng)樹籽粕用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等蛋白酶酶解，經(jīng)離心、過(guò)濾后得到粗肽。然后用活化好的大孔硅膠與大腸桿菌的細(xì)胞膜（大腸桿菌已用細(xì)胞破碎儀破碎，只剩下細(xì)胞膜）融合，形成大腸桿菌細(xì)胞膜固定相，最后用酶解后的粗肽與大腸桿菌細(xì)胞膜固定相反應(yīng)，得到反應(yīng)后的樣品，將反應(yīng)前后的樣品進(jìn)行超高效液相色譜分析，比較兩者指紋圖譜差異，收集的差異峰分別命名為抗菌肽JCpep7和JCpep8，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜鑒定其氨基酸序列分別為L(zhǎng)ys-Val-Phe-leu-Gly-leu-Lys和Cys-Ala-Ile-Leu-Thr-His-Lys-Arg，這兩種抗菌肽對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌與肺炎鏈球菌均有抗菌活性，JCpep7和JCpep8對(duì)熱穩(wěn)定性相對(duì)較強(qiáng)，并且對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶具有一定的抵抗力，JCpep8在低濃度下還不會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象和血凝集反應(yīng)，可以作為一種注射劑在醫(yī)學(xué)中使用。苑華寧[40]用類似的方法從牛酪蛋白中分離出一種抗菌肽Cpep11，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Arg-Leu-Lys-Lys-Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu，它對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌效果最強(qiáng)。

該方法原理與抗菌肽-細(xì)菌吸附法相似，且同樣具有快速篩選抗菌肽的優(yōu)點(diǎn)，與抗菌肽-細(xì)菌吸附法相比，不存在因活體細(xì)菌吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致準(zhǔn)確性相對(duì)較低的現(xiàn)象，但是該方法操作復(fù)雜，需將收集的菌膜包裹在大孔硅膠中，并保持其活性，活體細(xì)菌細(xì)胞膜的制備較為繁瑣，且在篩選條件下易失去活性，使用壽命短，獲得的抗菌肽較少，成本相對(duì)較高。

2.3 模擬細(xì)胞膜色譜法

模擬細(xì)胞膜色譜法是基于抗菌肽優(yōu)先作用于細(xì)胞膜中特定磷脂特性的原理而發(fā)明的一種方法[41]，根據(jù)磷脂分子能在水相中自發(fā)形成穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層膜的特點(diǎn)構(gòu)建模擬細(xì)胞膜并運(yùn)用抗菌肽與膜磷脂結(jié)合的原理來(lái)連續(xù)性分離抗菌肽。Tang Wenting等[42-46]在模擬細(xì)胞膜構(gòu)建并將其用于抗菌肽靶向性篩選方面做了系列研究工作，利用3 種不同脂質(zhì)來(lái)源的模擬細(xì)胞膜，從3 種原料中成功篩選出3 種新型抗菌肽。首先向活化好的大孔硅膠中添加磷脂酰膽堿/磷脂酰甘油復(fù)合物來(lái)構(gòu)建模擬細(xì)胞膜固定相，采用磷脂模擬細(xì)胞膜固相萃取聯(lián)用HPLC篩選出卵白蛋白胃蛋白酶酶解產(chǎn)物中的抗菌肽Opep12，其氨基酸序列為RVASMASEKMKI；鑒于真實(shí)細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂構(gòu)成的復(fù)雜性，從大腸桿菌細(xì)胞中提取脂質(zhì)，將其涂敷于硅膠載體表面并水化，構(gòu)建大腸桿菌模擬細(xì)胞膜固定相。然后將該固定相裝填于不銹鋼柱中，建立大腸桿菌模擬細(xì)胞膜色譜法，并采用該方法篩選到鳀魚粗肽提取物中的抗菌肽Apep10，其氨基酸序列為GLARCLAGTL；最后取鳀魚蒸煮液蛋白的Protamex水解產(chǎn)物，向活化好的大孔硅膠中添加金黃色葡萄球菌脂質(zhì)來(lái)構(gòu)建模擬細(xì)胞膜固定相，通過(guò)HPLC技術(shù)得到了抗菌肽ACWpep10，其氨基酸序列為GLSRLFTALK。其中Opep12、Apep10和ACWpep10帶1～2 個(gè)凈正電荷，它們對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和痢疾志賀氏菌等均有很好的抑菌效果，Opep12和ACWpep10在較低濃度下還不會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

該方法在細(xì)胞膜色譜法的基礎(chǔ)上再次拓展，用模擬細(xì)胞膜代替菌膜包裹大孔硅膠，減少了菌膜收集和菌膜活性的問(wèn)題，與細(xì)胞膜色譜法相比具有可選擇性多、使用壽命長(zhǎng)、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，如在保證模擬細(xì)胞膜仿真性的基礎(chǔ)上提高其穩(wěn)定性，有望實(shí)現(xiàn)模擬細(xì)胞膜在抗菌肽規(guī)?；a(chǎn)中的應(yīng)用；但是該方法不能完全模擬活性細(xì)胞膜，與抗菌肽作用于活性細(xì)胞膜還有一定區(qū)別。

2.4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是利用抗菌肽與菌膜結(jié)合的原理，建立抗菌肽與活菌結(jié)合的毛細(xì)管電泳模型，利用該模型中的抗菌肽與菌體存在的特殊親和力的作用，快速篩選出抗菌肽的方法，這是近年來(lái)發(fā)明的一種快速篩選抗菌肽的方法，目前技術(shù)還不是很成熟，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道也較少，而且多為對(duì)其條件的研究。T?mová等[47]取GIMSSLMKKLAAHIAK、GMWSKILGHLIR等12 種已知氨基酸序列的抗菌肽，運(yùn)用毛細(xì)管電泳法測(cè)定抗菌肽的有效電荷、離子遷移率和其他物理化學(xué)參數(shù)，并證明了抗菌肽的有效電荷和相對(duì)分子質(zhì)量的比例與抗菌肽的離子遷移率有很好的相關(guān)性。T?mová等[48]取Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu、Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg等8 種已知氨基酸序列的抗菌肽，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管電泳柱在pH 2.00～12.25之間有較好的穩(wěn)定性。Xia Zhijun等[49]取酵母發(fā)酵液的粗制備樣品，加入到自由流動(dòng)電泳中分離，將分離得到的抗菌肽進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE和ImageJ軟件定量分析，發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量分別為5.5 kDa和7.0 kDa，并且有87%純度和89%的回收率，并且對(duì)大腸桿菌具有很好的抑菌效果。

該方法理論上來(lái)說(shuō)具有產(chǎn)量高、重現(xiàn)性好、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)可能加速抗菌肽在制藥和臨床領(lǐng)域的發(fā)展，是一種快速篩選天然抗菌肽的方法，而且能夠?qū)崿F(xiàn)活菌條件下抗菌肽與菌膜結(jié)合機(jī)制的探索，但是該方法技術(shù)上還不夠成熟，還有很多理論問(wèn)題待解決。

2.5 薄層色譜自顯影法

薄層色譜自顯影法是利用抗菌物質(zhì)具有抑菌效果而發(fā)明的一種方法，通常用于篩選植物或細(xì)菌代謝物中的抗菌化合物[50-52]，后來(lái)有人將這種方法用于抗菌肽的研究。Jaskiewicz等[53]首先取Silica gel 60RP-18 F254S、Nano-SIL 20 UV 254等多種薄層色譜板進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有Nano-SIL 20 UV-254和Nano-ADAMANT UV 254薄層色譜板是足夠穩(wěn)定且分離效果較好的，然后取Nano-SIL 20 UV-254和Nano-ADAMANT UV 254薄層色譜板施加GLFDVIKKVASVIGGL、KWKLFKKIGAVLKVL等多種已知氨基酸序列的抗菌肽和未分離的抗菌粗肽及ICHHCI-OH、Pal-K(TFA)K(TFA)-NH 2等無(wú)抗菌效果的多肽并經(jīng)展開劑分離，接著接種細(xì)菌后恒溫培養(yǎng)，最后噴灑細(xì)胞活力試劑刃天青溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，結(jié)果顯示添加抗菌肽的薄層色譜板出現(xiàn)了白色抑菌圈，而添加無(wú)抗菌效果的多肽則未出現(xiàn)，證明了抗菌肽可以被這種方法分離。

該方法利用抗菌肽對(duì)細(xì)菌的抑菌能力能間接用染色劑顯示，從而從薄層色譜板中篩選出目標(biāo)肽，其理論上具有目標(biāo)性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，而且可以一次性篩選出多種抗菌肽，可能在未來(lái)實(shí)現(xiàn)規(guī)模化篩選抗菌肽，但是該方法需在無(wú)菌條件下操作，且對(duì)培養(yǎng)時(shí)間要求苛刻，對(duì)技術(shù)要求較高，而且較難分離成分復(fù)雜的粗肽，目前技術(shù)上還不夠成熟，還有很多基礎(chǔ)問(wèn)題需要研究，如展開劑的選擇、展開時(shí)間、接種細(xì)菌濃度等。

2.6 高通量測(cè)序法

高通量測(cè)序法是一種能一次性對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定的方法，并可能對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析。目前，高通量測(cè)序主要應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上[54]，但是近年來(lái)也有學(xué)者運(yùn)用這種方法篩選抗菌肽。有研究表明，抗菌肽的基因具有同源序列相似性的特點(diǎn)[55-56]，Yi Yunhai等[57]根據(jù)這一特點(diǎn)，收集大彈涂魚和大鰭彈涂魚這兩種有代表性的兩棲涂魚的轉(zhuǎn)錄組和基因組，在BLAST上對(duì)照之前組裝的標(biāo)準(zhǔn)同源性基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，結(jié)果鑒定出507 條抗菌肽轉(zhuǎn)錄本，共30 組，其中含有兩組高活性抗菌肽——血紅素和淀粉體，它們?cè)趯?duì)外源病原體中能發(fā)揮重要作用。在這些鑒定的抗菌肽中，449 條抗菌肽序列是未曾被報(bào)道的，48 條是在大彈涂魚和大鰭彈涂魚中共有的序列，用化學(xué)合成其中的血紅蛋白β1和胰淀素，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)藤黃微球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。這是首次報(bào)道應(yīng)用高通量技術(shù)將基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合來(lái)鑒定抗菌肽。該方法具有高效、快速、全面等的特點(diǎn)，而且可以一次性獲得大量的抗菌肽，為抗菌肽建立數(shù)據(jù)庫(kù)，是一種技術(shù)含量很高且新穎的方法，但是該方法也有很大局限性，它必須依靠已知的抗菌肽基因?yàn)槟０孱A(yù)測(cè)抗菌肽基因序列，并且只對(duì)同源性物種有效。

綜合抗菌肽快速篩選的全過(guò)程，前4 種均是基于肽-膜相互作用的原理，但研究方法和技術(shù)手段卻在不斷更新，從與活體細(xì)菌直接作用的抗菌肽-細(xì)菌吸附結(jié)合法，到基于抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜間存在特異親和力而建立的活菌細(xì)胞膜色譜法，再到基于抗菌肽優(yōu)先作用于細(xì)胞膜中的特定磷脂特性而構(gòu)建的模擬細(xì)胞膜色譜法，隨著研究的逐漸深入，篩選的靶向性、準(zhǔn)確性和效率都在逐步提高，但前4 種方法均不能大量地篩選抗菌肽，且只能篩選出能與細(xì)胞膜特異性反應(yīng)的抗菌肽。而近些年發(fā)明的薄層色譜自顯影法雖然可以篩選出較多抗菌肽且對(duì)所有的抗菌肽均有效果，但目前其技術(shù)上不成熟，還需深入研究；而高通量測(cè)序法可以篩選出大量的抗菌肽，但其需要有同源基因模板和基因庫(kù)作為基礎(chǔ)，成本較高且對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求較高。綜合各快速篩選方法的特點(diǎn)如表2所示。

表2 抗菌肽快速篩選方法的比較Table 2 Comparison of rapid screening methods for antibacterial peptides

3 結(jié) 語(yǔ)

抗菌肽因?yàn)槠涮赜械目咕鷥?yōu)勢(shì)成為學(xué)者們的研究焦點(diǎn)，從步驟繁瑣、分離效率低下的傳統(tǒng)篩選方法到操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高的快速篩選方法，抗菌肽的篩選速度得到了大幅提高，但是目前應(yīng)用的模擬細(xì)胞膜色譜法等方法還不能模擬成完整的細(xì)胞，不能篩選出原料中全部的抗菌肽，也不能大批量的篩選抗菌肽，而那些可以大批量篩選抗菌肽的方法也有較大的局限性。因此，探尋快速、高效、靈敏、高通量的篩選策略是抗菌肽的主要研究方向之一。除了快速篩選外，規(guī)?；苽湟彩强咕哪軓V泛應(yīng)用面臨的巨大瓶頸。關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)理，目前被學(xué)者普遍接受的是膜作用機(jī)理，但其具體抗菌作用的多樣性與機(jī)制仍需深入研究。在此基礎(chǔ)上，利用抗菌肽的抑菌機(jī)理來(lái)研發(fā)新的抗菌肽的快速篩選技術(shù)，使其在發(fā)現(xiàn)更多新抗菌肽、豐富抗菌肽庫(kù)和規(guī)模化開發(fā)利用抗菌肽資源方面發(fā)揮越來(lái)越大的作用。