藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)人脂肪干細(xì)胞增殖、分化和脂質(zhì)積累的影響

陳曉彤，馬思思，鄭婷婷，陳 潔，李亞麗，鄧遠(yuǎn)樂，何 方，陰文婭,*

（1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 610041 ；2.德陽市人民醫(yī)院，四川 德陽 618000 ；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川 成都 610041 ）

在過去的幾十年里，世界各國(guó)居民體力活動(dòng)明顯減少，飲食中脂肪和精制糖大幅增加，導(dǎo)致肥胖人數(shù)急劇增多[1]。由此誘發(fā)的腫瘤、心血管疾病、代謝綜合征、2型糖尿病等一系列慢性疾病嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[2-5]。2015年全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查顯示肥胖在全世界范圍內(nèi)影響了6億370萬成人和1億770萬兒童，包括中國(guó)在內(nèi)的70 個(gè)國(guó)家中，肥胖患病率較1980年翻了一倍，高身體質(zhì)量指數(shù)人群死亡人數(shù)達(dá)400萬[6]。肥胖已成為全球非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

脂肪組織的擴(kuò)張有兩個(gè)途徑：增生和肥大[7-8]。研究表明前體脂肪細(xì)胞的增殖分化會(huì)影響脂肪細(xì)胞的數(shù)量和體積變化[9]，脂肪細(xì)胞不僅是儲(chǔ)存過剩能量的場(chǎng)所，還會(huì)通過分泌如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂聯(lián)素、瘦素等脂肪細(xì)胞因子調(diào)節(jié)體內(nèi)的葡萄糖平衡、胰島素敏感性和胰島素抵抗等[10-12]，其可以直接參與肥胖相關(guān)的致病過程。因此，通過抑制脂肪細(xì)胞增生和肥大來控制脂肪組織的過度生長(zhǎng)可能是治療肥胖的一個(gè)可行策略。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adiposed-derived stem cells，ADSCs）是一種來源于脂肪組織、具有自我更新能力、通常處于靜止?fàn)顟B(tài)且未分化的干細(xì)胞，在離體條件下，能被外界誘導(dǎo)分化成為特定的脂肪細(xì)胞并形成脂肪組織[13]。以人ADSCs（human ADSCs，hADSCs）建立體外分化模型，其生物外推性比多數(shù)研究采用的鼠源3T3-L1前脂肪細(xì)胞更強(qiáng)，更能反映機(jī)體內(nèi)部真實(shí)生理環(huán)境及人體生理特點(diǎn)，這種模型可以更加清晰地反映脂肪組織生成過程中發(fā)生的一系列動(dòng)態(tài)改變。

藍(lán)莓含有豐富的生物活性化合物，花色苷是其主要功效物質(zhì)，具有抗氧化[14]、抗腫瘤[15]、抗炎[16]、預(yù)防心血管疾病[17]等健康益處。近年來發(fā)現(xiàn)花色苷具有抗肥胖作用[18]，其作用于鼠源3T3-L1前脂肪細(xì)胞，可以減少細(xì)胞數(shù)量，抑制其分化為成熟的脂肪細(xì)胞[19-21]。也有少數(shù)研究使用成熟的人脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)花色苷可以激活PPARγ，誘導(dǎo)脂聯(lián)素的表達(dá)[22]。有關(guān)花色苷對(duì)于不同分化周期人脂肪細(xì)胞的作用及機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究采用藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)hADSCs，觀察其對(duì)不同分化時(shí)期脂肪細(xì)胞增殖、分化和脂質(zhì)積累的影響，為其是否在hADSCs中具有潛在的抗脂肪形成能力提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓花色苷提取物（按參考文獻(xiàn)[23]方法提取，矢車菊素3-O-葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.75%、芍藥色素3-O-葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.80%）由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所提供。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、高糖DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基、抗生素（青霉素及鏈霉素混合）和胰蛋白酶 美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；人胰島素 丹麥諾和諾德公司；醫(yī)用地塞米松注射液 天津藥業(yè)焦作有限公司；I型膠原酶、油紅O染色劑、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide） 美國(guó)Sigma公司；AdipoRedTM檢測(cè)試劑 美國(guó)Lonza公司；乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒、葡萄糖測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；TRIzol試劑 美國(guó)Invitrogen公司；第一鏈cDNA合成試劑盒 瑞士Roche公司；SsoFast?Eva Green超混合液美國(guó)Bio-Rad公司。所有的寡核苷酸引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為進(jìn)口分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SANYAOM10-11AL CO2型恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本ANTYO公司；BX50倒置顯微鏡 日本Olympus公司；酶標(biāo)儀、CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀美國(guó)Bio-Rad公司；高壓滅菌鍋 美國(guó)Zealway公司；超低溫冰箱、恒溫氣浴搖床 美國(guó)熱電公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美公司；Bcm-1000型無菌超凈工作臺(tái) 蘇州蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BP301S電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司；EnVision多標(biāo)記微孔檢測(cè)儀 美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 hADSCs的制備和成脂分化的準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)脂肪組織取自四川大學(xué)華西醫(yī)院乳腺外科手術(shù)中預(yù)防性切除的健康脂肪組織，該研究協(xié)議書經(jīng)四川大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照《赫爾辛基宣言》的指導(dǎo)原則進(jìn)行。所有受試者都知情同意。hADSCs及其分化后脂肪細(xì)胞的分離依照Zuk等[24]的實(shí)驗(yàn)方案并略作修改。具體如下：將組織切碎后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的I型膠原酶消化，于37 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床消化45 min，之后加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在200 r/min離心10 min獲得高密度的基質(zhì)血管組分顆粒（stromal vascular fraction，SVF）。SVF懸浮在完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），過200 nm的不銹鋼細(xì)胞篩。過濾后的SVF懸浮培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%的CO2以及潮濕的環(huán)境中孵育48 h后，培養(yǎng)瓶用無菌PBS沖洗，去除殘余非黏附紅細(xì)胞。細(xì)胞在P3～P7代用于實(shí)驗(yàn)。每一組由3 個(gè)或4 個(gè)不同個(gè)體的hADSCs組成。

成脂分化：細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種在24 孔板，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，之后在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行成脂誘導(dǎo)14 d（培養(yǎng)基中添加0.5 mmol/L IBMX、0.2 mmol/L吲哚美辛、1 μmol/L醫(yī)用地塞米松注射液和5 μg/mL人胰島素）。此條件下，超過80%的細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。

1.3.2 乳酸脫氫酶測(cè)定及細(xì)胞活性檢測(cè)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hADSCs制成細(xì)胞懸液，取96 孔培養(yǎng)板，每孔加入200 μL hADSCs懸液，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL含75 μg/mL藍(lán)莓花色苷提取物的完全培養(yǎng)基，并以不含有樣品的完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照，干預(yù)24、48、72 h后分別收集上清液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，做3 個(gè)平行。按乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒的操作說明測(cè)定乳酸脫氫酶釋放率。

采用Kim等[21]的MTT法并加以改進(jìn)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hADSCs以每孔200 μL、5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h，棄上清液。1）對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hADSCs的影響：每孔加入200 μL含有質(zhì)量濃度分別為25、50、75、100、125、175 μg/mL的藍(lán)莓花色苷提取物的完全培養(yǎng)液，干預(yù)24、48 h。2）對(duì)融合期hADSCs的影響：在相同條件下培養(yǎng)至細(xì)胞進(jìn)入融合期，每孔加入200 μL含有與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相同質(zhì)量濃度梯度的藍(lán)莓花色苷提取物的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液，干預(yù)24、48 h。3）對(duì)分化期hADSCs的影響：在相同條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合以后，每孔分別加入200 μL含8.75、17.5、25 μg/mL藍(lán)莓花色苷提取物的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d至細(xì)胞完全成熟分化。4）對(duì)成熟期hADSCs的影響：將hADSCs培養(yǎng)完全分化后，加入200 μL含有與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相同質(zhì)量濃度梯度含藍(lán)莓花色苷提取物的完全培養(yǎng)液，分別干預(yù)24、48 h。以上4 組實(shí)驗(yàn)均以不含有樣品的相同培養(yǎng)液為空白對(duì)照，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。之后，每孔中加入MTT儲(chǔ)存液20 μL繼續(xù)無菌培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入200 μL DMSO，氣浴搖床中150 r/min搖晃4 min，酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。按下式計(jì)算其對(duì)各階段脂肪干細(xì)胞增殖情況的相對(duì)抑制率。

1.3.3 油紅O染色和Adipored法檢測(cè)

hADSCs油紅O染色：將hADSCs以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于24 孔板，每孔加入1 mL培養(yǎng)液，并置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合后，分別加入含有質(zhì)量濃度梯度為8.75、17.5、25 μg/mL的藍(lán)莓花色苷提取物成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液，以不含樣品的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。連續(xù)誘導(dǎo)分化14 d后，在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，在第14天，將細(xì)胞固定在10%福爾馬林（pH 7.4）溶液中用油紅O染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

Adipored法檢測(cè)：在與上述相同條件下連續(xù)誘導(dǎo)分化14 d后，根據(jù)AdipoRed試劑盒的說明書，用PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞后，每孔加入1 mL PBS及30 μL AdipoRed試劑，10 min后，將24 孔培養(yǎng)板放入多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀中，于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)572 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。將24 孔培養(yǎng)板置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.3.4 葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)

完全分化的脂肪細(xì)胞接種于24 孔板中，在高糖DMEM完全培養(yǎng)液中加入質(zhì)量濃度梯度分別為8.75、17.5、25 μg/mL的藍(lán)莓花色苷提取物，以高糖DMEM完全培養(yǎng)液為陰性對(duì)照組，以加入含10 μmol/L的羅格列酮（胰島素敏感性增強(qiáng)劑）的高糖DMEM為陽性對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。之后分別在基礎(chǔ)狀態(tài)和1 μmol/L胰島素存在的情況下干預(yù)72 h，收集上清液并于4 ℃保存。根據(jù)葡萄糖試劑盒（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法[25]）說明書，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中上清液以及原高糖DMEM培養(yǎng)基葡萄糖的含量，各實(shí)驗(yàn)組的葡萄糖消耗量為原高糖DMEM培養(yǎng)基葡萄糖量與相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基葡萄糖量之差。

1.3.5 RNA提取與qPCR分析

使用TRIzol法[26]進(jìn)行總RNA的分離。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，并采用20 μL反應(yīng)體系從1 μg總RNA中得到cDNA。qPCR使用SsoFast?Eva Green超混合液，并在CFX96 Touch qPCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件為：95 ℃保持2 min（預(yù)變性）；98 ℃保持5 s（變性），59 ℃保持30 s（退火），98 ℃保持5 s（延伸），40 個(gè)循環(huán)。在每個(gè)樣本中，基因表達(dá)水平均與內(nèi)參蛋白（β-actin）的表達(dá)相一致。樣本中基因的相對(duì)表達(dá)水平均由儀器軟件CFX Manager 3.0使用Pfaffl方法自動(dòng)計(jì)算。表1引物用于擴(kuò)增人脂聯(lián)素[27]、PPARγ和內(nèi)參蛋白（β-actin）[28]基因。

表1 qPCR所用引物Table 1 Sequences of primers used for quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用 ±s表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行描述性分析，單因素方差分析比較顯著性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)hADSCs的細(xì)胞毒性

圖1 hADSCs的乳酸脫氫酶釋放率Fig. 1 Lactate dehydrogenase release rate from hADSCs

由圖1可知，hADSCs經(jīng)藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)24、48、72 h后，分別測(cè)量3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)乳酸脫氫酶釋放率，其釋放率分別為88.7%、82.2%和53.5%，乳酸脫氫酶釋放率均低于100%，說明處理組和空白對(duì)照組相比沒有更多的乳酸脫氫酶釋放。且處理72 h后的乳酸脫氫酶釋放率相比于24 h和48 h均顯著降低（P＜0.05）。

2.2 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)不同時(shí)期hADSCs增殖的影響

圖2 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)hADSCs對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（A）、融合期（B）、成熟期（C）、分化期（D）的生長(zhǎng)抑制關(guān)系Fig. 2 Inhibitory effect of blueberry anthocyanins extract on hADSCs in logarithmic (A), conf l uent growth (B), maturation (C) and differentiation (D) phases

圖2 是采用MTT法測(cè)定細(xì)胞分化不同時(shí)期不同時(shí)間點(diǎn)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)情況。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高質(zhì)量濃度組（100～175 μg/mL）干預(yù)24 h和48 h后，與未處理的對(duì)照細(xì)胞相比（0 μg/mL）均高度顯著抑制hADSCs增殖（P＜0.0 0 1）；而較低質(zhì)量濃度組（2 5、5 0、75 μg/mL）只在處理48 h后對(duì)hADSCs出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制效果（P＜0.01）；融合期高質(zhì)量濃度組對(duì)hADSCs的增殖抑制作用明顯高于低質(zhì)量濃度組；成熟期完全分化成熟的脂肪細(xì)胞不會(huì)再增殖，經(jīng)藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)24 h和48 h后，與空白對(duì)照相比均減少了細(xì)胞（非增殖）的數(shù)量。藍(lán)莓花色苷提取物在hADSCs整個(gè)分化期的干預(yù)中，顯著降低了最終細(xì)胞數(shù)（P＜0.05），但藍(lán)莓花色苷的3 種質(zhì)量濃度（8.75、17.5、25 μg/mL）組之間無顯著差異。

2.3 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)分化的hADSCs脂質(zhì)積累的影響

圖3 油紅O染色（A）（×200）和AdipoRed實(shí)驗(yàn)（B）（×200）觀察藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)hADSCs 分化抑制劑量-效應(yīng)關(guān)系及定量評(píng)價(jià)（C）Fig. 3 Dose-dependent inhibition and quantitative evaluation (C) of blueberry anthocyanins on intercellular lipid accumulation of hADSCs by Oil Red O staining (A) (× 200) and AdipoRed assay (B) (× 200)

由圖3可知，成脂誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞已經(jīng)融合且形態(tài)變細(xì)變小，鏡下呈黑色斑塊狀，與空白對(duì)照組相比，隨著藍(lán)莓花色苷質(zhì)量濃度逐漸增大被染紅的脂滴逐漸減少；而在AdipoRed實(shí)驗(yàn)拍下的照片中將紅色熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照對(duì)比發(fā)現(xiàn)，隨藍(lán)莓花色苷質(zhì)量濃度增大，紅色熒光的亮度也逐漸減弱。兩組實(shí)驗(yàn)拍下的照片均表明藍(lán)莓花色苷能抑制分化hADSCs中的脂質(zhì)積累。

圖3C中AdipoRed相對(duì)熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)也顯示，藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)脂肪生成量均低于空白對(duì)照組，干預(yù)組的分化均受到了抑制，其分化抑制率具有顯著性差異，這與照片的結(jié)果保持一致。當(dāng)藍(lán)莓花色苷提取物質(zhì)量濃度分別為8.75、17.5、25 μg/mL時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度抑制率分別為25.3%、36.6%、70.4%（P＜0.01）。

2.4 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)人成熟脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收的影響

圖4 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)hADSCs葡萄糖吸收的影響Fig. 4 Effects of blueberry anthocyanins on glucose uptake in hADSCs

由圖4可知，陽性對(duì)照羅格列酮組高度顯著增加了葡萄糖的消耗量（P＜0.001）；當(dāng)培養(yǎng)液中不加入胰島素時(shí)，在17.5、25 μg/mL藍(lán)莓花色苷作用下，葡萄糖攝取量顯著增加（P＜0.05）；而培養(yǎng)液中加入胰島素時(shí)，藍(lán)莓花色苷提取物質(zhì)量濃度分別為8.75、17.5、25 μg/mL時(shí)，葡萄糖攝取量也顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。因此，不論是否加入1 μmol/L胰島素，葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)均表明藍(lán)莓花色苷可以顯著增加人成熟脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗。

2.5 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)hADSCs分化過程中PPARγ、脂聯(lián)素表達(dá)的影響

圖5 分化期藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)后PPARγ（A）與脂聯(lián)素（B）的基因表達(dá)情況Fig. 5 Gene expression of PPARγ (A) and adiponectin (B) in differentiating adipocytes treated with bluberry anthocyanins

圖6 成熟期藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)后PPARγ（A）和脂聯(lián)素（B）的基因表達(dá)情況Fig. 6 Gene expression of PPARγ (A) and adiponectin (B) in mature adipocytes treated with blueberry anthocyanins

由圖6可知，干預(yù)完全分化后的hADSCs：與空白對(duì)照組相比，隨藍(lán)莓花色苷提取物質(zhì)量濃度增加，脂聯(lián)素基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05），而PPARγ表達(dá)情況則與分化期的表達(dá)情況相反，在25、50 μg/mL提取物干預(yù)下，PPARγ的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。

3 討 論

由圖5可知，干預(yù)分化期的hADSCs：與空白對(duì)照組相比，低質(zhì)量濃度的藍(lán)莓花色苷提取物組（8.75 μg/mL和17.5 μg/mL）使PPARγ表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；脂聯(lián)素基因表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（前脂肪細(xì)胞）3T3-L1細(xì)胞系廣泛地用于研究功能性食品成分對(duì)肥胖和脂肪細(xì)胞的影響[29]。前期通過此細(xì)胞系研究紫甘薯花色苷提取物，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制前脂肪細(xì)胞的增殖和分化，減少脂質(zhì)積累[19]。但是，3T3本身為小鼠雜交瘤細(xì)胞株，很難在研究過程中區(qū)分是抑制脂肪生成還是抗腫瘤效果。且它已經(jīng)失去部分干細(xì)胞特性，不能完全代表健康正常的前脂肪細(xì)胞特性。因此開發(fā)更近似于人體的并且穩(wěn)定易獲取的細(xì)胞研究體系是目前研究的熱點(diǎn)。有研究以前體hADSCs作為體外模型來評(píng)估各種植物化學(xué)物對(duì)肥胖的影響[30-31]。

本研究建立了hADSCs體外模型，并根據(jù)文獻(xiàn)[22]選擇了藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)質(zhì)量濃度。觀察到其可以顯著抑制對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、融合期的hADSCs增殖并在選擇的劑量范圍內(nèi)呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，這些時(shí)期都是脂肪組織增殖的關(guān)鍵期。在這些時(shí)期對(duì)細(xì)胞增殖的抑制呈劑量效應(yīng)關(guān)系可以減少功能成熟的脂肪細(xì)胞的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)還觀察到藍(lán)莓花色苷提取物逐步促進(jìn)hADSCs中乳酸脫氫酶的釋放，表示其可以增加細(xì)胞膜通透性并且促進(jìn)細(xì)胞壞死，這與之前的研究結(jié)果[32-33]一致。但即使提取物濃度增高，乳酸脫氫酶的釋放仍低于100%。在同類研究中發(fā)現(xiàn)，花色苷提取物通過改變細(xì)胞周期，誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞sub-G1調(diào)亡[32]。因此，對(duì)于hADSCs增殖的抑制作用可能通過增加細(xì)胞膜的通透性及影響細(xì)胞周期造成。脂肪組織的擴(kuò)張不僅有脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加，還有脂質(zhì)積累引起的脂肪細(xì)胞肥大。在本研究中油紅O染色和AdipoRed實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藍(lán)莓花色苷提取物可以減少脂肪細(xì)胞分化過程中脂質(zhì)的積累，隨著藍(lán)莓花色苷提取物質(zhì)量濃度增加抑制效果逐漸加大，相對(duì)熒光量數(shù)據(jù)也表明同樣結(jié)果。盡管藍(lán)莓花色苷提取物在整個(gè)分化期都可以使細(xì)胞增殖明顯減少，但是不同藍(lán)莓花色苷質(zhì)量濃度間的細(xì)胞增殖沒有差異。因此，藍(lán)莓花色苷提取物減少脂質(zhì)積累的效果，是由細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量降低和細(xì)胞增殖被抑制兩方面原因?qū)е耓34]。

持續(xù)的高血糖會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)生胰島素抵抗并且損傷胰島β細(xì)胞，從而降低胰島素的分泌和合成，進(jìn)一步加劇胰島素抵抗的影響[35]。胰島素抵抗出現(xiàn)在代謝綜合征的早期階段，因此，改善胰島素敏感性和胰島素的維持狀態(tài)可以預(yù)防或延緩2型糖尿病的發(fā)展[36]。脂肪細(xì)胞作為主要的胰島素靶細(xì)胞，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[37]。之前的研究顯示，花色苷可在體內(nèi)外干擾脂肪細(xì)胞的功能，預(yù)防代謝綜合征[38-39]。因此在本研究中，使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測(cè)[40]，結(jié)果證明不論在基礎(chǔ)狀態(tài)或胰島素刺激狀態(tài)，藍(lán)莓花色苷提取物均顯著增加脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗。這與之前的研究具有一致性，即矢車菊素-3-O-β-葡萄糖苷及其代謝產(chǎn)物原兒茶酸可以增強(qiáng)脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞中的胰島素樣活性，此研究也證明多酚作用的關(guān)鍵機(jī)制之一可能是其提高了PPARγ的活性[22]。

脂聯(lián)素在脂肪細(xì)胞中特異高表達(dá)，被認(rèn)為是一種與肥胖和2型糖尿病[41]相關(guān)的最重要因子。喂食含大量花色苷的食物后，小鼠附睪的白色脂肪組織中，脂聯(lián)素基因表達(dá)顯著上調(diào)[42]，類似的效果在花色苷作用后的人類脂肪細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)[43]。在本研究中，藍(lán)莓花色苷提取物可以增加成熟脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá)且有劑量效應(yīng)關(guān)系。在低質(zhì)量濃度藍(lán)莓花色苷提取物組，脂肪細(xì)胞分化的末期由于脂質(zhì)的積累和脂肪細(xì)胞大小的顯著增加，導(dǎo)致脂聯(lián)素基因表達(dá)增加，從而改善和維持脂肪細(xì)胞的健康。配體激活轉(zhuǎn)錄因子PPARγ不僅是脂肪細(xì)胞分化的主調(diào)節(jié)因子，其在脂肪細(xì)胞成熟期也控制著一些特異性基因的表達(dá)[42]。在本研究中，采用藍(lán)莓花色苷提取物進(jìn)行干預(yù)，分化期與成熟期hADSCs中PPARγ的表達(dá)不相同。分化期的hADSC與空白對(duì)照組相比，顯著下調(diào)PPARγ的表達(dá)，說明藍(lán)莓花色苷能抑制脂肪細(xì)胞的分化。結(jié)果與之前的花色苷類研究一致，該研究認(rèn)為花色苷可能與PPARγ的受體相互作用[44]。但也有研究表明花色苷對(duì)脂肪細(xì)胞特異基因的上調(diào)機(jī)制可能并不是通過影響PPARγ[45]，而是激活了腺苷酸激活蛋白激酶通路[38,46]。與之相反，藍(lán)莓花色苷提取物在干預(yù)完全分化的人脂肪細(xì)胞后，上調(diào)PPARγ的表達(dá)。這種現(xiàn)象正如之前研究提到，噻唑烷二酮類藥物活化PPARγ基因可以改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[47]，這種對(duì)PPARγ基因的激活可能由于一部分胰島素抵抗作用的減少所造成。但藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響分析，還需要進(jìn)一步闡明其潛在機(jī)制。

綜上所述，藍(lán)莓花色苷提取物顯著降低了人脂肪細(xì)胞的增殖能力，抑制了其分化，減少了成熟脂肪細(xì)胞及脂質(zhì)積累。這些影響可能由于在提取物干預(yù)下hADSCs分化的早期階段，PPARγ表達(dá)下調(diào)；分化完成后成熟的人脂肪細(xì)胞中，葡萄糖攝取、代謝以及脂聯(lián)素和PPARγ表達(dá)水平增加。因此，藍(lán)莓提取物能顯著抑制人體脂肪細(xì)胞的增殖和分化過程中的脂質(zhì)積累，并且增加完全分化成熟后脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和脂肪細(xì)胞因子的基因表達(dá)。這些效應(yīng)有助于藍(lán)莓花色苷提取物的抗肥胖和抗糖尿病作用。