周一鳴，趙 燊，馮 飛，劉 倩，周小理*，肖 瀛

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418 ）

酸奶是一種健康營養(yǎng)的食品，主要是以新鮮牛乳為原料，添加適量砂糖，經(jīng)巴氏滅菌和冷卻后加入乳酸菌發(fā)酵劑，在適宜條件下進(jìn)行發(fā)酵而成的乳制品[1]。已有研究表明：酸奶具有改善腸道菌群[2]、減輕乳糖不耐癥、降低血清膽固醇[3]、抗氧化延緩衰老[4]、降血壓[5]和增強(qiáng)機(jī)體免疫力[6-7]等功能。酸奶制備時(shí)普遍以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵劑[8]；而植物乳桿菌ST-III因其具有抑制腸道中致病菌、增殖有益菌群以及降膽固醇的作用，越來越多地被應(yīng)用到發(fā)酵食品當(dāng)中[9-10]。

目前，許多研究表明，植物蛋白更為健康，其不僅有助于預(yù)防糖尿病、高血壓、心臟病和某些癌癥，而且對于環(huán)境、可持續(xù)發(fā)展和動物保護(hù)問題方面也優(yōu)于動物蛋白[11-13]?？嗍w作為一種天然“藥食兩用”的綠色食品[14]，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。苦蕎蛋白是苦蕎中主要的生物活性成分，其約占苦蕎籽粒的15%～17%，主要由谷蛋白、水溶性清蛋白和鹽溶性球蛋白組成，富含18 種氨基酸[15]。功能研究表明，苦蕎蛋白具有調(diào)節(jié)血脂、提高抗氧化能力、改善氧化應(yīng)激[16]、促進(jìn)膽酸排泄、促進(jìn)腸道中乳酸桿菌的生長[17]以及調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[18]等多種功效。

在正常生理狀況下，腸道菌群以雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌占優(yōu)勢，從而使非致病菌與致病菌之間相互制約、相互作用，保持腸道正常的微生態(tài)平衡[19-20]。然而腸道菌群組成會隨生理和病理情況的改變而發(fā)生變化，在某些病理?xiàng)l件下現(xiàn)代的高脂飲食容易引發(fā)人體腸內(nèi)菌群紊亂，有益菌數(shù)量減少和有害菌數(shù)量大量增加，引起菌群失調(diào)，最終導(dǎo)致人體失去抵抗致病菌的天然保護(hù)屏障，正常的生理狀況受損，出現(xiàn)急、慢性腹瀉和消化不良等一系列臨床癥狀[21-25]。研究表明腸道菌群在腸道健康及體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡等方面起重要作用，通過膳食補(bǔ)充益生菌和益生元，可選擇性地調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，保持腸道菌群平衡，是促進(jìn)人體健康的有效措施[26-27]。因此，腸道菌群已成為近幾年來世界各地學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

本研究通過進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）方法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）、Illumina高通量測序技術(shù)，對小鼠腸道菌群數(shù)量和種類，以及主要代謝產(chǎn)物——短鏈脂肪酸的含量進(jìn)行分析，初步探究了凝固型苦蕎酸奶對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，以期獲得新型功能性苦蕎酸奶新產(chǎn)品，為苦蕎發(fā)酵食品的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級4 周齡雄性實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠36 只，體質(zhì)量在15～18 g之間，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0018。

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus GIM1.155）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles GIM1.83） 廣東省微生物菌種保藏中心；植物乳桿菌（L. plantarum ST-III） 光明乳業(yè)研究院；苦蕎粉雁門清高食品有限公司；UltaSYBR Mixture、DM 1000 DNA Marker、糞便基因組DNA提取試劑盒、6×DNA Loading Buffer、RNase A 康為世紀(jì)生物科技有限公司；50×TAE、DNA Ladder、TE buffer、Glod View核酸染色劑 碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

qTOWER2.2 qPCR儀、Chem Studio化學(xué)發(fā)光成像儀德國耶拿分析儀器股份公司；GCMS-TQ8040 GC-MS儀日本島津公司；DYCP-31DN型水平電泳儀 北京六一儀器廠；YQX-II型厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-IFD垂直潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸奶的制備

凝固型苦蕎酸奶的制備參考劉蘭杰[28]的方法并稍作修改，將苦蕎粉與水1∶5（m/V）混合，90 ℃糊化1 h得苦蕎漿。脫脂乳粉與水1∶6（m/V）混合得脫脂乳。將30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）苦蕎漿、6%蔗糖加入脫脂乳中，使其混合均勻。于20～22 MPa、50～60 ℃條件下均質(zhì)，95 ℃水浴10 min進(jìn)行巴氏殺菌，冷卻至40 ℃。在無菌條件下，接種5%的混合發(fā)酵劑（植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌菌液體積比2∶1∶1），42 ℃恒溫發(fā)酵6 h，4 ℃冰箱中冷藏后熟10 h，4 ℃貯存?zhèn)溆?。制備普通酸奶時(shí)不添加苦蕎漿。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)小鼠在清潔級環(huán)境（溫度22～24 ℃、相對濕度55%～65%）下，低脂低糖標(biāo)準(zhǔn)飼料預(yù)飼2 周，隨機(jī)分成3 組，每組12 只，分別為對照組（CON）、苦蕎酸奶組（BYG）和普通酸奶組（YG）。3 組均喂食高脂飼料，飼養(yǎng)期間小鼠自由取食。CON組灌胃生理鹽水，BYG和YG組分別灌胃凝固型苦蕎酸奶和普通酸奶，灌胃劑量為0.4 mL/d，連續(xù)灌胃4 周（灌胃前4 h禁食、禁水）。飼料配方見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠飼料配方Table 1 Formulation and composition of experimental diets

1.3.3 小鼠糞便中主要腸道菌群數(shù)量的測定

最后一次灌胃24 h后，以實(shí)驗(yàn)分組為單位收集各組小鼠糞便于干燥的滅菌試管中。糞便于-80 ℃冰箱中保存。用糞便基因組提取試劑盒對小鼠糞便中細(xì)菌基因組進(jìn)行提取，用SYBR Green I染料法[29]對6 種主要常見腸道菌（柔嫩梭菌、擬桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，6 種常見腸道菌的特異qPCR引物名稱及引物序列見表2，擴(kuò)增條件參考Rinttil?等[30]的方法。

采用25 μL qPCR體系：UltaSYBR Mixture 12.5 μL、10 μmol/L引物1.0 μL、（20.0±0.5）ng/μL模板1 μL、ddH2O 10.5 μL。設(shè)置NTC并做3 個(gè)重復(fù)反應(yīng)。各樣品的分子拷貝數(shù)根據(jù)各樣品的熔解溫度Ct值與其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程精確計(jì)算出樣品菌群數(shù)量，最后換算成樣品中基因的拷貝數(shù)（copies/g）。

表2 菌群特異類群qPCR引物Table 2 qPCR primers for specific groups

1.3.4 小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的測定

稱取糞便樣品0.30～0.40 g于10 mL離心管中，加甲醇溶液2.6 mL、蒸餾水2 mL溶解，6 000 r/min離心10 min，取上清液，加入體積分?jǐn)?shù)60%硫酸溶液調(diào)節(jié)至pH（1.50±0.10），70 ℃水浴1 h。冷卻至室溫，加二氯甲烷1 mL振蕩混勻，6 000 r/min離心10 min，吸取下層有機(jī)溶劑，作為GC-MS的進(jìn)樣樣品[31]。

GC-MS條件[32]：采用程序控制升溫，起始溫度為35 ℃，持續(xù)1 min，以10 ℃/min升溫到100 ℃，持續(xù)1 min，以20 ℃/min升溫到250 ℃，持續(xù)3 min；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL；接口溫度260 ℃。

1.3.5 小鼠腸道菌群多樣性分析

將收集到的各組小鼠的糞便樣品均分為4 份，采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取小鼠糞便樣品中微生物總DNA。所提取的DNA于-40 ℃冰箱中保存，后將DNA樣品送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，對樣品進(jìn)行qPCR擴(kuò)增及測序，qPCR產(chǎn)物采用Illumina MiSeq高通量測序平臺進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析（最小顯著性差異法檢驗(yàn)），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05進(jìn)行顯著性分析；每組數(shù)據(jù)均3 個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并運(yùn)用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠糞便中主要腸道菌群數(shù)量的測定結(jié)果

由表3可知，YG組及BYG組小鼠糞便中的腸道有害菌（腸球菌、腸桿菌、擬桿菌）數(shù)量較CON組顯著減少，其中，BYG組小鼠糞便中的腸道有益菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌、柔嫩梭菌）較CON組分別增加了523.81、911.01、12.18 倍，較YG組分別增加了4.89、13.79、1.95 倍；且腸道有益菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌、柔嫩梭菌）較對照組顯著增多，其中BYG組小鼠糞便中的腸道有害菌（腸桿菌、腸球菌、擬桿菌）較CON組分別減少了99.89%、97.31%、99.02%，較YG組減少了88.52%、84.15%、88.52%。該結(jié)果表明普通酸奶和凝固型苦蕎酸奶均對小鼠糞便中主要的幾種腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用，可抑制有害菌的生長并促進(jìn)有益菌的增殖，且凝固型苦蕎酸奶的調(diào)節(jié)作用比普通酸奶更為顯著。

表3 小鼠糞便中主要腸道菌群數(shù)量的測定結(jié)果（n=3）Table 3 Contents of main intestinal microorganisms in the feces of mice (n= 3)

2.2 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量的測定結(jié)果

圖1 小鼠糞便短鏈脂肪酸的含量Fig. 1 Contents of short chain fatty acids in the feces of mice

由圖1可知，凝固型苦蕎酸奶和普通酸奶均可促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、乳酸）的生成。YG組小鼠糞便中的短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、乳酸）含量較CON組顯著增加，這可能是由于酸奶中的益生菌成分具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增加短鏈脂肪酸含量的功效。BYG組小鼠糞便中的乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的含量比CON組分別增加了36.87%、75.59%、56.26%、92.36%，比YG組分別增加了30.09%、19.60%、14.45%、70.91%。因此，凝固型苦蕎酸奶促進(jìn)小鼠體內(nèi)短鏈脂肪酸生成的效果優(yōu)于普通酸奶，這可能是由于凝固型苦蕎酸奶綜合了益生菌成分和苦蕎營養(yǎng)成分的作用。

2.3 小鼠腸道菌群多樣性分析

采用Illumina高通量測序技術(shù)，對本研究中的樣品進(jìn)行測序，利用各樣本的測序量在不同測序深度時(shí)觀測到的物種數(shù)量（Sobs指數(shù)）構(gòu)建稀釋性曲線（圖2），以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。結(jié)果表明當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映出樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。

圖2 稀釋性曲線Fig. 2 Rarefaction curve

高通量測序結(jié)果顯示，經(jīng)97%相似性歸并后，CON組、BYG組、YG組小鼠糞便樣品分別共計(jì)有248、295、232 個(gè)操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。3 組小鼠糞便菌群在97%相似性水平的Alpha多樣性指數(shù)見表4，多樣性指數(shù)組間差異見圖3。Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)是評價(jià)腸道菌群豐富度的指數(shù)，與菌群豐富度成正比[33]。Coverage指數(shù)是指各樣品文庫的覆蓋率，可反映樣品的測序深度[34]。Alpha分析表明，3 組之間的Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)差異顯著，BYG組的菌群Alpha多樣性指數(shù)最高，CON組次之，YG組最低。3 組樣品的Coverage指數(shù)均在0.89以上，表明樣品測序深度合理，測序覆蓋率較高。以上多樣性分析結(jié)果表明，灌胃凝固型苦蕎酸奶可以增加小鼠腸道菌群的物種豐富度。

表4 各組小鼠糞便樣品菌群的Alpha多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity index of fecal samples of mice in each group

圖3 各組小鼠糞便樣品菌群的Alpha多樣性指數(shù)組間差異Fig. 3 Difference in Alpha diversity index of fecal samples between three groups

2.4 小鼠腸道菌群組成分析

圖4 各組小鼠糞便樣品菌群的Venn圖Fig. 4 Venn diagram of fecal samples in each group

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多組或多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種（如OTU）數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)環(huán)境樣本的物種（如OTU）數(shù)目組成相似性及重疊情況。由圖4可知，相比于YG組和CON組，BYG組的樣品物種數(shù)量有明顯的增加。3 組樣品的共有物種有192 種，其中YG組和CON組樣品的特有物種均有15 種，而BYG組樣品的特有物種多達(dá)61 種。由此可見，在凝固型苦蕎酸奶的作用下小鼠腸道菌群會增加新的物種，腸道菌群的多樣性會得到提升。

圖5 各組小鼠糞便樣品群落在門水平上的分布Fig. 5 Distribution of intestinal microf l ora at the level of phylum in each group

圖6 各組小鼠糞便樣品群落在屬水平上的分布Fig. 6 Distribution of intestinal microf l ora at the level of genus in each group

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同分組樣品在各分類水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。3 組樣品群落在門水平、屬水平的分布見圖5、6。從門水平上看，BYG組較YG組和CON組，厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對豐度顯著降低，擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度顯著升高。Zhang Chenhong等[35]研究發(fā)現(xiàn)飼喂高脂飼糧的大鼠，其腸道菌群中擬桿菌門所占比例減少，而厚壁菌門和變形菌門（Proteobacteria）所占比例增加。這說明凝固型苦蕎酸奶可以緩解由高脂飲食引起的小鼠腸道菌群內(nèi)擬桿菌門和厚壁菌門的變化，使之更趨向于正常水平。從屬水平上看，與CON組相比，BYG組能顯著提高norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Faecalibaculum菌屬的相對豐度，降低Ruminococcaceae_UCG-014、unclassified_f__Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_UCG-006菌屬的相對豐度。與普通酸奶相比，凝固型苦蕎酸奶能夠提高norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Blautia菌屬的菌群豐度，降低unclassified_f__Lachnospiraceae、Ruminococcaceae_UCG-014菌屬的菌群豐度，提高小鼠腸道中優(yōu)勢菌屬的地位。Park等[36]研究發(fā)現(xiàn)Blautia屬可將腸道中氣體轉(zhuǎn)化成乙酸，使氣體得以清除并增加腸道短鏈脂肪酸的含量，該菌種的首次發(fā)現(xiàn)是在小鼠的糞便中，且具有產(chǎn)乳酸的作用。Faecalibaculum的首次發(fā)現(xiàn)是在小鼠的糞便中，且具有產(chǎn)乳酸的作用，可以增加腸道菌群的短鏈脂肪酸含量[37]。這幾種菌屬相對豐度的增加可以促進(jìn)小鼠體內(nèi)短鏈脂肪酸的生成，從而使小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量提高，這與本研究中短鏈脂肪酸含量測定結(jié)果一致。Lachnospiraceae菌屬的部分菌種已被發(fā)現(xiàn)會在無菌小鼠中引起糖尿病[38]。Rooks等[39]研究發(fā)現(xiàn)Norank_f__Bacteroidales_S24-7_group豐度的增加可緩解高脂飲食小鼠的結(jié)腸炎。Shang Qingsen等[40]研究發(fā)現(xiàn)Ruminococcaceae部分種屬可能與抗抑郁相關(guān)，在重度抑郁人群中，其相對含量顯著減少。綜上，苦蕎酸奶可以增加腸道優(yōu)勢菌屬的相對豐度，從而起到優(yōu)化腸道菌群組成的作用。

3 結(jié) 論

本研究通過進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，利用qPCR方法、GC-MS、Illumina高通量測序技術(shù)，對小鼠腸道菌群數(shù)量和種類，以及主要代謝產(chǎn)物——短鏈脂肪酸的含量進(jìn)行分析，初步探究了凝固型苦蕎酸奶對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，凝固型苦蕎酸奶對小鼠腸道中3 種有害菌（腸桿菌、腸球菌、擬桿菌）的生長具有抑制作用且高于普通酸奶，在其抑制作用下，3 種菌的數(shù)量較對照組分別減少了99.89%、97.31%、99.02%；對3 種有益菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌、柔嫩梭菌）的生長具有促進(jìn)作用，較對照組分別增加了523.81、911.01、12.18 倍，且促進(jìn)作用顯著高于普通酸奶。同時(shí)，凝固型苦蕎酸奶可以顯著提高小鼠腸道內(nèi)短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、乳酸）的含量，凝固型苦蕎酸奶組小鼠糞便中的乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的含量比對照組分別增加了36.87%、75.59%、56.26%、92.36%。高通量測序結(jié)果表明，灌胃凝固型苦蕎酸奶可以提高小鼠腸道菌群多樣性，并且在門水平上顯著降低厚壁菌門和疣微菌門的相對豐度，顯著提高擬桿菌門的相對豐度，在屬水平上顯著提高norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Faecalibaculum菌屬的豐度，降低Ruminococcaceae_UCG-014、unclassified_f__Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_UCG-006菌屬的豐度，提高腸道優(yōu)勢菌屬的地位。

綜上所述，凝固型苦蕎酸奶顯著增加了小鼠腸道內(nèi)幾種產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌屬的豐度，從而對乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等短鏈脂肪酸的生成起到了促進(jìn)作用，降低腸道的pH值進(jìn)而抑制腸道有害菌（腸桿菌、腸球菌、擬桿菌）的生長，并增加了腸道優(yōu)勢菌屬的相對豐度。凝固型苦蕎酸奶相比普通酸奶，可以更好地促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)有益菌（雙歧桿菌、乳酸桿菌等）的增殖并抑制有害菌（腸桿菌、腸球菌和擬桿菌等）的增殖，增加腸道短鏈脂肪酸的含量，改善腸道環(huán)境，增加小鼠腸道菌群的多樣性，提高腸道優(yōu)勢菌屬的相對豐度，優(yōu)化小鼠腸道菌群組成。