王飛 徐茜 陳志厚

摘要：為探討綠肥對(duì)植煙土壤細(xì)菌的影響，以烤煙K326為研究對(duì)象，設(shè)置CK（不翻壓綠肥）、T1（翻壓光葉苕子）、T2（翻壓黑麥草）和T3（翻壓紫云英）等4個(gè)處理。結(jié)果表明，與CK相比，T2處理土壤細(xì)菌在種分類水平上豐度增加得最多;T1、T2、T3處理明顯提高土壤細(xì)菌α多樣性;旺長(zhǎng)期土壤細(xì)菌豐度超過(guò)2%的屬分別是浮霉?fàn)罹鷮伲≒lanctomyces）、假絲酵母菌屬（Candidatus Solibacter）、羅丹菌屬（Rhodanobacter）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes），成熟期土壤細(xì)菌豐度超過(guò)2%的屬為水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、Planctomyces、普雷沃氏菌屬（Prevotella_9）;冗余分析結(jié)果表明，旺長(zhǎng)期土壤速效鉀含量解釋了細(xì)菌23.50%的變化，成熟期土壤有機(jī)質(zhì)含量解釋了細(xì)菌群落23.50%的變化;T1、T2、T3處理在旺長(zhǎng)期均能顯著降低煙草青枯病致病菌（Ralstonia）豐度，T3處理顯著增加了旺長(zhǎng)期和成熟期土壤中苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、固氮螺菌屬（Inquilinus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等3個(gè)固氮菌屬豐度。說(shuō)明翻壓綠肥可以在一定程度上改善植煙土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：綠肥;烤煙;土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu);豐度;16S rDNA測(cè)序;多樣性指數(shù);土壤微生物群落;連作障礙

中圖分類號(hào)： S154.3;S142? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0317-05

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)重要的分解者，地球生物化學(xué)過(guò)程中的固氮、硝化與反硝化、甲烷氧化、二氧化碳固定等諸多過(guò)程都與之密切相關(guān)[1]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受多方面影響，會(huì)隨著自然環(huán)境中二氧化碳、臭氧、酸雨等環(huán)境因子的變化而改變[2]。人類對(duì)土地的耕作和管理方式也會(huì)影響土壤微生物多樣性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施肥和農(nóng)藥是影響土壤微生物系統(tǒng)穩(wěn)定性的兩大主導(dǎo)因素[3]。Fauci等研究表明，大量使用氮肥會(huì)顯著降低土壤微生物活性，增施有機(jī)肥則可以提高土壤微生物活性[4-5]。

土壤微生物學(xué)興起于19世紀(jì)60年代[6]，隨后關(guān)于土壤微生物的研究方法一直都在改進(jìn)，Garland等發(fā)明提出采用生理學(xué)方法（GLPP）研究土壤酶[7]，Torsvik在前者的基礎(chǔ)上提出采用生態(tài)微平板法（EcoPlates）專門研究土壤微生物[8]。20世紀(jì)70年代，White等采用磷脂脂肪酸（PLFA）圖譜分析法來(lái)鑒定微生物種屬[9]，隨著科技的發(fā)展，高通量測(cè)序法憑借其準(zhǔn)確性高、測(cè)序量大的特點(diǎn)受到人們的青睞[6]。

煙草為重要的經(jīng)濟(jì)作物，連作和增施化肥都會(huì)影響其根際土壤微生物環(huán)境，土壤微生物系統(tǒng)的改變會(huì)引起土壤肥力下降和土壤理化性質(zhì)不協(xié)調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致煙草連作障礙[10]。因此，許多科研工作者致力于從土壤微生物方面解決煙草連作障礙問(wèn)題。關(guān)于煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究已有不少報(bào)道[11]，諸如探討烤煙連作[12]、套作[13]、輪作[14]、秸稈還田[15]、移栽方式[16]等對(duì)植煙地土壤微生物的影響，而關(guān)于綠肥還田對(duì)植煙地土壤細(xì)菌群落、功能微生物影響的報(bào)道相對(duì)較少。因此，本研究結(jié)合16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)探究翻壓光葉苕子（Vicia villosa Roth var.）、黑麥草（Lolium perenne L.）、紫云英（Astragalus sinilus L.）等3種綠肥植物對(duì)植煙地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性指數(shù)和功能菌的影響，旨在為從土壤微生物群落角度解決煙草連作障礙問(wèn)題積累數(shù)據(jù)，為提高烤煙品質(zhì)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于福建省南平市光澤縣寨里鎮(zhèn)小寺州村（117°39′E，27°38′N），屬中亞熱帶氣候，年平均氣溫為 17.5 ℃，年降水量為1 800 mm，年極高、極低溫分別為39.70、-9.50 ℃，無(wú)霜期為271 d?？緹熞圃郧巴寥烙袡C(jī)質(zhì)含量為17.43 g/kg，堿解氮含量為183.56 mg/kg，有效磷含量為39.03 mg/kg，速效鉀含量為100.08 mg/kg，交換性鈣含量為225.66 mg/kg，交換性鎂含量為46.49 mg/kg。土壤細(xì)菌的香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)分別為8.013、0.001。

1.2 材料

光葉苕子、黑麥草、紫云英種子采購(gòu)于山東藍(lán)天種業(yè)專業(yè)種子公司，千粒質(zhì)量分別為70.74、3.28、9.62 g，在試驗(yàn)地發(fā)芽率分別為35.00%、80.00%、35.00%。供試烤煙品種為K326。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)時(shí)間為2016年11月至2017年7月。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置CK（不翻壓綠肥）、T1（翻壓光葉苕子）、T2（翻壓黑麥草）和T3（翻壓紫云英）等4個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)小區(qū)面積為24 m2。綠肥植物在2016年11月采用撒播方式播種，根據(jù)綠肥植物種子發(fā)芽率和千粒質(zhì)量，將3種綠肥植物成活密度控制為200株/m2。在烤煙移栽前 20 d 同時(shí)翻壓3種綠肥植物，翻壓時(shí)光葉苕子、黑麥草、紫云英的鮮生物量分別為4 600.05、6 800.32、4 700.58 kg/hm2?？緹煵シN時(shí)間為2016年12月5日，移栽至試驗(yàn)地時(shí)間為2017年2月18日，基肥為煙草專用肥（施用量為 480.00 kg/hm2）以及鈣鎂磷肥（施用量為150.00 kg/hm2），基肥施用時(shí)間為移栽前20 d;追肥為硝酸鉀（施用量為 300.00 kg/hm2），追肥時(shí)間為移栽后30、60 d，煙田行距為 1.20 m，株距為0.50 m。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定 分別于煙草生長(zhǎng)的旺長(zhǎng)期、成熟期在煙壟上2棵煙株的正中位置（避開(kāi)施肥點(diǎn)），采用3點(diǎn)混合的方式采集0～20 cm耕作層土壤，用滅菌的自封袋裝好后，用保鮮箱帶回實(shí)驗(yàn)室，剔除雜物，一部分用于檢測(cè)土壤細(xì)菌類群，另一部分風(fēng)干后混合均勻過(guò)2.0、0.149 mm篩，用于測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì)。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮含量采用元素分析儀（Elementer公司生產(chǎn)的Vario MAX CN）測(cè)定;堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定;有效磷含量采用NaHCO3浸提后用分光光度計(jì)測(cè)定;速效鉀含量用1 mol/L CH3COONH4浸提后，用火焰光度計(jì)測(cè)定;交換性鈣、交換性鎂含量用1 mol/L CH3COONH4浸提后，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定;土壤pH值用 1 mol/L KCl浸提測(cè)定[17]。

1.4.2 土壤細(xì)菌類群測(cè)定 土壤細(xì)菌類群采用16S rDNA高通量測(cè)序法測(cè)定，具體操作過(guò)程如下。

1.4.2.1 提取土壤微生物DNA 采用MoBio96試劑盒提取土壤微生物DNA。

1.4.2.2 PCR擴(kuò)增 從樣本中提取基因組DNA后，用帶有條形碼（bar code）的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)。引物序列為341F：CCTAYGGGRBGCASCAG;806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT。然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，用Quanti FluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。再將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合、連接測(cè)序接頭、構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，最后利用Hiseq2500 PE250上機(jī)測(cè)序。

1.4.2.3 Tag拼接和過(guò)濾 將測(cè)序結(jié)果中含N堿基比例超過(guò)10%的序列和質(zhì)量值高于20的且堿基數(shù)在堿基總數(shù)中占比小于40%的堿基序列（reads）去除，根據(jù)測(cè)序序列（paired-end reads，簡(jiǎn)稱PE reads）之間的重疊關(guān)系將成對(duì)雙端reads拼接為原始條帶（raw tags）。然后在堿基位點(diǎn)截?cái)鄏aw tags，從連續(xù)低質(zhì)量值（默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤3）堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長(zhǎng)度（默認(rèn)長(zhǎng)度值為3）的第1個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)，得到的條帶（tags）數(shù)據(jù)集之后過(guò)濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于tags長(zhǎng)度75%的tags。

1.4.2.4 OTU聚類分析 將相似性達(dá)到97%的有效tags聚成操作分類單元（operational taxonomic units，簡(jiǎn)稱OTUs），計(jì)算出每個(gè)OTU在各個(gè)樣品中的tags絕對(duì)豐度和相對(duì)信息，用于分析多樣性指數(shù)。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0完成，制圖采用SigmaPlot12.5、Canoco4.5完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)植煙土壤細(xì)菌各分類水平豐度的影響

由圖1、圖2、圖3可以看出，初始、旺長(zhǎng)期、成熟期土壤細(xì)菌的稀釋曲線隨著序列數(shù)的增加逐漸變緩，說(shuō)明隨著序列數(shù)的增加，細(xì)菌數(shù)目趨于穩(wěn)定，表明取樣合理。

由圖4可知，各時(shí)期不同處理土壤細(xì)菌種的相對(duì)豐度普遍低于20%，細(xì)菌屬水平上的相對(duì)豐度在20%～40%之間，細(xì)菌科水平上的相對(duì)豐度在40%～60%之間，土壤細(xì)菌目及以上水平的相對(duì)豐度均超過(guò)60%。各生長(zhǎng)期不同處理土壤細(xì)菌種水平以上的門類在所有分類水平中的比例變化不明顯，而土壤細(xì)菌種的豐度變化較大。初始土壤細(xì)菌種的豐度僅為0.48%，各處理旺長(zhǎng)期土壤細(xì)菌種的豐度均大于1%，與CK處理相比，T1、T2、T3處理土壤細(xì)菌種的豐度分別增長(zhǎng)了15.68%、21.57%、14.71%，成熟期土壤細(xì)菌種的豐度均超過(guò)5%，尤其是T2處理，豐度達(dá)到了9.31%。

2.2 不同處理對(duì)植煙土壤細(xì)菌α多樣性的影響

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)代表細(xì)菌多樣性，表1為旺長(zhǎng)期與成熟期土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。方差分析結(jié)果表明，旺長(zhǎng)期和成熟期土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均明顯高于初始土壤。旺長(zhǎng)期Shannon指數(shù)大小表現(xiàn)為T2處理>T3處理>T1處理>CK處理，其中T2、T3處理顯著大于CK處理;Simpson指數(shù)大小表現(xiàn)為T2處理>T3處理=T1處理>CK處理，T1、T2、T3處理均與CK處理差異顯著;成熟期Shannon指數(shù)大小表現(xiàn)為T3處理>T1處理>T2處理>CK處理，其中T3處理顯著高于CK處理，T1、T2、T3處理差異不顯著。由此可見(jiàn)，綠肥翻壓有助于提高土壤細(xì)菌α多樣性。

2.3 植煙土壤屬分類水平細(xì)菌與土壤養(yǎng)分的冗余關(guān)系分析

由表2可知，烤煙旺長(zhǎng)期T1、T2、T3處理土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、交換性鈣、交換性鎂含量大多顯著高于高于CK處理。與CK處理相比，T2處理對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量提高得最多，在旺長(zhǎng)期、成熟期分別比CK處理高了3.71%、7.59%。T3處理對(duì)土壤堿解氮、交換性鈣、交換性鎂含量提高幅度最大，土壤堿解氮含量的提高說(shuō)明紫云英固氮作用顯著。T1、T2、T3處理的土壤pH值在烤煙旺長(zhǎng)期與CK處理無(wú)顯著差異，而在成熟期顯著低于CK處理。

由圖5可知，CK、T1、T2、T3處理旺長(zhǎng)期土壤細(xì)菌數(shù)量分別為158.00、151.33、157.67、147.00個(gè)，成熟期分別為 373.00、369.33、382.00、403.33。旺長(zhǎng)期和成熟期各處理間土壤細(xì)菌數(shù)量均無(wú)顯著差異，而同一處理成熟期土壤細(xì)菌數(shù)量均顯著大于旺長(zhǎng)期。

圖6、圖7分別為旺長(zhǎng)期、成熟期土壤細(xì)菌豐度大于2%的屬分類水平細(xì)菌。旺長(zhǎng)期4個(gè)處理中未分類屬的豐度均超過(guò) 77.00%，其他屬豐度均超過(guò)12.00%;可分類的屬為浮霉?fàn)罹鷮伲≒lanctomyces）、假絲酵母菌屬（Candidatus Solibacter）、羅丹菌屬（Rhodanobacter）、紅游動(dòng)菌屬（Rhodoplanes）等;T3處理土壤中Planctomyces、Rhodanobacter 2個(gè)屬豐度均高于其他處理，分別比CK處理高128.55%、37.44%。T2處理土壤中Candidatus Solibacter、Rhodoplanes 2個(gè)屬豐度高于其他3個(gè)處理，分別比CK處理高55.68%、7.48%。與旺長(zhǎng)期相比，成熟期土壤細(xì)菌豐度大于2%的屬差異較大，分別為水恒桿菌屬（Mizugakiibacter）、Planctomyces、普雷沃氏菌屬（Prevotella_9），其中Mizugakiibacter豐度在T1處理下最大，比CK處理高165.41%;Planctomyces豐度在T1處理下為2.31%，高于CK處理。T2處理有利于Prevotella_9豐度的提高，與CK處理相比，提高240.66%。

將屬水平上的細(xì)菌與土壤中環(huán)境因子作冗余分析，結(jié)果如圖8、圖9所示。圖中環(huán)境因子與細(xì)菌夾角的余弦值絕對(duì)值大小代表相關(guān)性強(qiáng)弱。當(dāng)夾角呈銳角時(shí)，表示兩者正相關(guān)，夾角越小，則余弦值越大，相關(guān)性越強(qiáng)，反之越弱;當(dāng)夾角為鈍角時(shí)，表示兩者負(fù)相關(guān)，夾角越大，則余弦值絕對(duì)值越大，相關(guān)性越強(qiáng)，反之越弱。旺長(zhǎng)期第1主軸可以解釋細(xì)菌54.41%的變化，第2主軸解釋1.17%的變化。主要環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌變化解釋率大小依次為速效鉀含量（23.50%）>堿解氮含量（9.60%）>土壤有機(jī)質(zhì)含量（8.60%）>土壤酸堿度（4.80%）。由圖8可知，Candidatus Solibacter、Rhodoplanes、Shannon指數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀含量呈較強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系，Rhodanobacter、Planctomyces分別與土壤交換性鈣、全氮含量呈較強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系。由圖9可知，成熟期第1主軸解釋細(xì)菌57.87%的變化，第2主軸解釋2.99%的變化。主要環(huán)境因子對(duì)菌落變化的解釋率大小為土壤有機(jī)質(zhì)含量（23.50%）>交換性鎂含量（10.50%）>有效磷含量（7.90%）>堿解氮含量（6.70%）。該時(shí)期Planctomyces與土壤有機(jī)質(zhì)含量及土壤酸堿度呈較強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系，Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)均與土壤堿解氮、速效鉀含量呈較強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系;物種豐富度指數(shù)（Chaol指數(shù)）大小反映了物種種類多少，本研究中Chao1指數(shù)與土壤全氮、交換性鎂含量呈正相關(guān)關(guān)系。

2.4 不同綠肥翻壓處理對(duì)植煙地土壤致病菌與固氮菌的影響

烤煙之所以產(chǎn)生連作障礙，其主要原因是烤煙根部土壤中易產(chǎn)生致病菌，而固氮菌能夠固定空氣中氮?dú)猱a(chǎn)生養(yǎng)分，因此有必要調(diào)查不同處理后土壤中致病菌與固氮菌的豐度差異。本研究分析了青枯菌屬（Ralstonia）、短桿菌屬（Conexibacter）、柯克斯體屬（Aquicella）等3種致病菌豐度變化情況。由表3可知，Aquicella豐度較高，是主要致病菌;所有處理成熟期土壤中致病菌豐度均高于旺長(zhǎng)期，尤其是

Ralstonia、Aquicella在成熟期除CK處理外土壤中均顯著增加，說(shuō)明烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中根部土壤一直在聚集致病菌，但是同一時(shí)期內(nèi)，翻壓綠肥的土壤致病菌大多顯著低于未翻壓綠肥的土壤，說(shuō)明翻壓綠肥有助于降低植煙地土壤致病菌豐度，尤其是T3處理，在旺長(zhǎng)期與成熟期均能顯著降低Ralstonia豐度。對(duì)土壤中苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、固氮螺菌屬（Inquilinus）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等3個(gè)固氮菌屬的豐度變化研究發(fā)現(xiàn)，Phenylobacterium相對(duì)其他2種固氮菌豐度較高，屬于優(yōu)勢(shì)固氮菌。且本研究表明，與對(duì)照相比，綠肥翻壓能顯著增加旺長(zhǎng)期土壤固氮菌屬Phenylobacterium的豐度。旺長(zhǎng)期T1處理土壤中Phenylobacterium豐度比CK處理提高了75.00%，成熟期T3處理土壤中Phenylobacterium豐度比CK提高了 92.31%，T2處理土壤中Phenylobacterium豐度在旺長(zhǎng)期與成熟期分別比CK處理增加了62.50%、46.15%。由此可見(jiàn)，翻壓豆科綠肥植物有利于增加植煙土壤中Phenylobacterium豐度。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)因土壤類型、作物種類、施用肥料的不同而有很大差異[18]，因此，本研究中除了翻壓的綠肥植物不同外，其他條件均控制一致，避免其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成干擾。本研究發(fā)現(xiàn)，翻壓綠肥植物可以提高土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、土壤速效養(yǎng)分含量，養(yǎng)分含量的提高在旺長(zhǎng)期表現(xiàn)得更明顯，這與葉協(xié)鋒等的研究結(jié)果[19-21]類似。不同種類綠肥植物對(duì)不同養(yǎng)分含量的提高效果也不盡相同，本研究發(fā)現(xiàn)，T2處理有利于提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，T1、T3處理則更有利于增加土壤氮素含量。

綠肥翻壓后提供了大量碳源和氮源，使土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)明顯提高，這與楊昊等的研究結(jié)果[22]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)在旺長(zhǎng)期與有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系，而在旺長(zhǎng)期翻壓黑麥草處理的Shannon指數(shù)提高得最多，因此可以得出，有機(jī)質(zhì)含量高的綠肥植物更有利于提高土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)。

通過(guò)對(duì)土壤細(xì)菌屬分類水平的分析發(fā)現(xiàn)，綠肥翻壓后，旺長(zhǎng)期Planctomyces豐度有很大提高，已有研究表明，Planctomyces是Planctomycetaceae下的1個(gè)屬，具有參與碳循環(huán)、富集礦物的功能[23]，這與本研究發(fā)現(xiàn)的Planctomyces與有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷含量呈正相關(guān)關(guān)系的結(jié)果類似。

通?？緹熓斋@之后，為防止烤煙根際土壤中致病菌對(duì)下茬作物的影響，煙農(nóng)要將煙株連根挖起。對(duì)植煙地土壤中致病菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，Ralstonia、Conexibacter、Aquicella等3種致病菌相對(duì)豐度較大，其中Ralstonia是煙草青枯病的主要病原菌[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，翻壓綠肥的土壤中致病菌豐度均低于CK處理，其中T3處理對(duì)降低植煙地土壤致病菌的作用最明顯，這可能是由于綠肥翻壓為土壤其他類細(xì)菌提供了繁殖的條件，與致病菌產(chǎn)生拮抗作用。對(duì)固氮菌的豐度分析發(fā)現(xiàn)，T3處理土壤Phenylobacterium、Inquilinus、Cupriavidus等3種固氮菌豐度較對(duì)照均有顯著提高。土壤致病菌與固氮菌豐度的變化說(shuō)明翻壓綠肥能夠改善植煙土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)。

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