郭棟 張蕾 程云霞 江幸福 羅禮智

摘要為揭示黏蟲被病原菌侵染后的免疫應(yīng)答機(jī)制，本試驗分析比較了黏蟲幼蟲被金龜子綠僵菌metarhiziumanisopliae侵染后不同時間其血淋巴蛋白含量、免疫關(guān)鍵酶系（酚氧化酶PO，溶菌酶）活性、抗菌活力以及血細(xì)胞數(shù)量等免疫相關(guān)指標(biāo)的變化。結(jié)果表明：受綠僵菌侵染后，黏蟲6齡幼蟲血淋巴蛋白含量在侵染初期（6h和24h）顯著高于對照，侵染48、72和96h后幼蟲血淋巴蛋白質(zhì)含量顯著低于對照。且侵染后幼蟲血淋巴PO活性也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，侵染初期（6h和24h）顯著高于對照，侵染后期除72h外與對照組無顯著差異。侵染初期（24h）溶茵酶活性也顯著升高，隨后出現(xiàn)下降，并于48h顯著低于對照，但在化蛹時（96h）再次上升。綠僵菌侵染后期，黏蟲的抗菌活性下降，于侵染后72h抗菌活性顯著低于對照，而侵染初期抗菌活性與對照無顯著差異。另外，綠僵茵侵染對幼蟲血細(xì)胞數(shù)量以及漿血胞比率也有顯著的影響，表現(xiàn)為：侵染后6h和24h血細(xì)胞總數(shù)、漿血胞比率均顯著高于對照，隨后與對照并無顯著差異。綜上，綠僵茵侵染黏蟲幼蟲初期會顯著誘導(dǎo)其免疫反應(yīng)的啟動，體現(xiàn)在主要免疫指標(biāo)升高，而后隨著免疫系統(tǒng)的破壞與能量的消耗，其免疫反應(yīng)能力降低，生理活動受到干擾。

關(guān)鍵詞黏蟲;金龜子綠僵菌;免疫反應(yīng)

中圖分類號：S476.12文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2017132

昆蟲在繁衍過程中會因為種種原因受到外界天敵寄生或病原物侵染，其正常的生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響。而昆蟲能在各種不同的外界環(huán)境中生存，與其自身的免疫反應(yīng)有重要的關(guān)系。昆蟲作為無脊椎動物，免疫系統(tǒng)以先天性免疫為主。與高等動物相比，昆蟲體內(nèi)缺乏更高等級的免疫球蛋白等免疫物質(zhì)，但在長期的進(jìn)化過程中發(fā)展出一套獨(dú)特的防御系統(tǒng)來阻止外來生物的侵入。除堅硬的表皮、組織外，昆蟲血淋巴系統(tǒng)在免疫機(jī)制中也承擔(dān)著重要的作用，其中主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩大系統(tǒng)。當(dāng)昆蟲受到外源病原物的刺激時，酚氧化酶（phenoloxidase，PO）可以參與昆蟲表皮的硬化和黑化，從而支撐和保護(hù)蟲體正常的生長發(fā)育;而當(dāng)病原物進(jìn)入蟲體后，溶菌酶可以導(dǎo)致病原體細(xì)胞壁破裂并使內(nèi)容物逸出，最終病原細(xì)胞破裂死亡;抗菌肽是昆蟲被病原菌感染后，蟲體內(nèi)快速產(chǎn)生的一種免疫誘導(dǎo)分子，對外源病原物具有強(qiáng)有力的殺傷作用;血淋巴細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞免疫的主要執(zhí)行者，血細(xì)胞的種類和數(shù)量是細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，免疫血細(xì)胞可對外源異物進(jìn)行吞噬、形成結(jié)節(jié)、包被和血凝等，從而參與傷口的愈合、凝結(jié)、合成及分泌免疫相關(guān)因子。因此，PO活性、溶菌酶活性、抗菌活力和免疫血細(xì)胞數(shù)量等免疫指標(biāo)的變化是昆蟲免疫反應(yīng)的標(biāo)志性參數(shù)。這些免疫反應(yīng)同時也會影響昆蟲的資源分配并可能改變其行為或發(fā)育方向，從而影響種群動態(tài)。

黏蟲Mythimna separata（Walker）是一種典型的季節(jié)性遠(yuǎn)距離遷飛害蟲，是嚴(yán)重威脅我國主要糧食作物生產(chǎn)安全的重大害蟲。黏蟲發(fā)生范圍廣，為害世代多，除2012年和2013年連續(xù)在全國大發(fā)生外，近年來，在我國局部地區(qū)同樣暴發(fā)成災(zāi)。而在全國開展的黏蟲為害調(diào)查顯示，幼蟲表皮發(fā)生黑化可作為成災(zāi)種群典型的預(yù)警信息。黑化幼蟲抵抗天敵和病原物入侵的能力明顯增強(qiáng)，一些常用的生物制劑對其防治效果不明顯。研究發(fā)現(xiàn)，黏蟲幼蟲黑化是一種典型的密度依賴型現(xiàn)象，黑化幼蟲適應(yīng)能力的增強(qiáng)主要體現(xiàn)在取食量大、抗逆能力增加和由其發(fā)育而來的成蟲遷飛能力提高等方面，從而導(dǎo)致生產(chǎn)上為害更加嚴(yán)重。近年研究也發(fā)現(xiàn)高密度飼養(yǎng)的幼蟲表皮黑化程度明顯高于單頭飼養(yǎng)的黏蟲，較高密度飼養(yǎng)的黏蟲（10頭/瓶）抵抗傘裙追寄蠅Exorista civilis Rondani的寄生和綠僵菌侵染的能力明顯增加，其6齡幼蟲表皮和血淋巴酚氧化酶（PO）的活性也顯著高于單頭飼養(yǎng)的黏蟲，這些結(jié)果初步明確了PO活性的增加是高密度幼蟲黑化及抗病能力提高的關(guān)鍵因素。然而，目前對黑化黏蟲的研究多集中在生長發(fā)育和行為變化方面，關(guān)于黑化黏蟲防御的免疫應(yīng)答機(jī)制方面還未有報道。因此，本研究旨在通過綠僵菌侵染黑化黏蟲6齡幼蟲后測定其血淋巴蛋白質(zhì)含量、PO活性、溶菌酶活性、抗菌物質(zhì)和血細(xì)胞數(shù)量等免疫指標(biāo)的變化，揭示黑化黏蟲的相關(guān)免疫反應(yīng)，從而對指導(dǎo)和發(fā)展其生物防治提供重要數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：金龜子綠僵菌Metarhizium aniso-pliae（Metch.）Sor購自神威生物公司。

供試?yán)ハx及飼養(yǎng)：在吉林采集的高齡黏蟲，在實驗室繁殖6代。在飼養(yǎng)密度為10頭/瓶（直徑9cm×高13cm）條件下誘導(dǎo)出的黑化型黏蟲。幼蟲飼養(yǎng)參照呂偉祥等室內(nèi)人工飼養(yǎng)方法，培養(yǎng)溫度為（23-1-1）℃，光周期為L∥D=14h∥10h，濕度為70%～80%，飼料為30～50cm高的新鮮玉米苗，每日更換飼料，直至幼蟲老熟為止。幼蟲老熟時瓶中加入含水量10%～15%的土壤供其化蛹和羽化。

1.2方法

1.2.1綠僵菌侵染方法

根據(jù)白毓昕的試驗結(jié)果，10⁶cfu/mL的孢子濃度可以激活黏蟲6齡幼蟲免疫反應(yīng)且幼蟲不會迅速死亡，故本試驗接種用孢子懸浮液濃度設(shè)為10⁶cfu/mL。用含0.01%吐溫-80的無菌水配制該濃度的綠僵菌分生孢子懸浮液，將蛻皮24h以內(nèi)的黏蟲6齡幼蟲浸于孢子懸浮液中5s后取出，放在吸水紙上吸干蟲體表面水分，然后將其置于盛有新鮮玉米葉的養(yǎng)蟲瓶中按1.1的方法繼續(xù)飼養(yǎng)，以含0.01%吐溫80的無菌水浸泡蟲體為對照。處理后每天更換新鮮葉片，去除死亡幼蟲。每個處理重復(fù)3瓶，共30頭。

3討論

昆蟲體內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)不僅在昆蟲組織形成、物質(zhì)代謝的過程中起著重要作用，同時與蟲體生長發(fā)育的激素調(diào)控及免疫應(yīng)答機(jī)制等方面也有著密切的聯(lián)系。昆蟲蛋白通過調(diào)節(jié)機(jī)體特異性和非特異性免疫功能，發(fā)揮其增強(qiáng)免疫的作用，從而提高蟲體對外界刺激的抵御能力。本研究結(jié)果表明，黑化黏蟲被侵染后，血淋巴蛋白含量出現(xiàn)顯著的變化，表明綠僵菌的入侵刺激黑化黏蟲產(chǎn)生防御反應(yīng)，誘導(dǎo)脂肪體中蛋白質(zhì)的合成與分泌發(fā)生變化;同時在侵染初期蛋白含量顯著增加，推測此時黏蟲幼蟲初始接受到外源刺激，產(chǎn)生相關(guān)的免疫反應(yīng)來抵抗綠僵菌的侵染，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)含量明顯增加;之后隨著免疫反應(yīng)的趨緩與免疫能量的消耗，蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量開始減少。

PO是昆蟲體液免疫中及其重要的免疫防衛(wèi)因子，酚氧化酶可以催化酪氨酸產(chǎn)生多巴，多巴氧化為醌并最終產(chǎn)生黑色素。當(dāng)外源生物入侵時通過特異性級聯(lián)反應(yīng)而活化，產(chǎn)生黑化反應(yīng)來提高昆蟲的抵抗能力。試驗中PO的活性隨著日齡的增加而下降，與小菜蛾幼蟲受小菜蛾顆粒體病毒PlXyGV感染后PO活性的變化規(guī)律相同;綠僵菌侵染后，幼蟲PO活性也發(fā)生顯著變化，表明幼蟲免疫水平的改變。綠僵菌侵染初期PO活性增強(qiáng)顯著，且在這個時期，幼蟲蛻皮后表皮開始逐漸變黑，較高的PO活性有助于蟲體防御能力的提高，同時PO介導(dǎo)的黑化作用來幫助幼蟲抵抗綠僵菌的侵染，并且在病原物刺激的初始階段，是蟲體內(nèi)部免疫反應(yīng)最活躍時期。

溶菌酶來源于昆蟲的脂肪體，釋放到血淋巴中。昆蟲處于不正常生理狀態(tài)下時，血淋巴中的溶菌酶的活性會產(chǎn)生極大變化。感染、出血、受傷以及各種環(huán)境壓力下，都能使溶菌酶的數(shù)量急劇增加。之后隨著免疫反應(yīng)的進(jìn)行，其免疫能力的消耗會導(dǎo)致溶菌酶活性的減少，本試驗中所得結(jié)果與許紅兵等相似，但在侵染后96h，與對照組相比，其溶菌酶活性再次升高，這可能由于幼蟲即將化蛹的原因，黏蟲對外界刺激更加敏感，誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)來協(xié)助化蛹的進(jìn)行。綠僵菌侵染后，黏蟲血淋巴中抗菌活性物質(zhì)開始生成，其抗菌活力先增加后趨緩，與PO活性、溶菌酶等免疫指標(biāo)的變化趨勢有所不同，這些結(jié)果表明昆蟲免疫功能之問很可能存在著相互平衡，在受到外界脅迫時，可以將有限的能量進(jìn)行合理分配，從而最大化地有利于蟲體正常生長發(fā)育。

本試驗中綠僵菌侵染后黏蟲幼蟲血細(xì)胞總數(shù)目和免疫血細(xì)胞數(shù)目與比率均有不同程度的提升，與鄧日強(qiáng)等用核多角體病毒SpltMNPV感染斜紋夜蛾幼蟲后血細(xì)胞總數(shù)目、比率變化相同，初步表明了蟲體內(nèi)細(xì)胞免疫過程的發(fā)生，而相關(guān)免疫過程如吞噬作用、形成結(jié)節(jié)、包被等免疫行為還需要進(jìn)一步的研究。粒血胞和漿血胞是參與細(xì)胞免疫應(yīng)答最相關(guān)的兩種細(xì)胞，侵染后黏蟲幼蟲粒血胞和漿血胞數(shù)量和比率的增加是幼蟲群體抵抗外源刺激物的適應(yīng)性特征，與幼蟲免疫能力的提升密切相關(guān)。

綜上所述，對黏蟲各免疫指標(biāo)的分析表明，綠僵菌侵染對黏蟲6齡幼蟲的蛋白含量、免疫酶活性、血細(xì)胞數(shù)量等生理指標(biāo)有顯著影響。黏蟲幼蟲在受到侵染后，蟲體會通過體液免疫和細(xì)胞免疫的共同作用而產(chǎn)生防御反應(yīng)。本文對黏蟲防御行為免疫應(yīng)答問的關(guān)系提供了一定的理論依據(jù)，對揭示黏蟲抵抗病原物侵染的能力、機(jī)理及黏蟲成災(zāi)機(jī)制具有重要意義。