傅鈺 王苓 龍鴻

摘 ?要 ?高等植物生長發(fā)育階段可分為營養(yǎng)生長和生殖生長2個階段，其中營養(yǎng)生長階段中只有通過營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變方可進入生殖生長階段。營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變（vegetative phase change，VPC）是植物從幼齡期（juvenile stage）到成熟期（adult phase）的轉(zhuǎn)變，受到基因表達的調(diào)控。生物鐘（circadian clock）相關(guān)基因LHY和CCA1單獨作用延遲VPC的發(fā)生，這2個基因的共同作用下VPC是否受到影響尚未見報道。本研究以擬南芥（Arabidopsis thaliana）為研究對象，通過形態(tài)和莖尖分生組織（shoot apical meristem，SAM）解剖結(jié)構(gòu)觀察及調(diào)控因子miR156和靶基因SPL3的表達變化，分析LHY和CCA1 2個基因在VPC過程中的作用。結(jié)果表明：雙突變體lhycca1生長周期為15 d，蓮座葉第5片時（第10天）出現(xiàn)遠軸面表皮毛，此時葉基角和葉長寬比增大且莖尖分生組織凸起明顯，miR156和SPL3的表達水平在植物生長發(fā)育階段呈負相關(guān)變化。而野生型生長周期為20 d，蓮座葉第6片（第15天）時才出現(xiàn)遠軸面表皮毛、葉長寬、葉基角、SAM、miR156和SPL3的變化。這些結(jié)果說明在LHY和CCA1的共同作用下，VPC提前發(fā)生，LHY和CCA1 2個基因參與VPC的調(diào)控。

關(guān)鍵詞 ?營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變;lhycca1;生物鐘;擬南芥

中圖分類號 ?Q945 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?Developmental phase of higher plant is composed of two stages： vegetative growth and reproductive growth. Only after the phase transition through vegetative growth does plant go through further reproductive growth. The transition from the juvenile stage to the adult phase in plants is termed vegetative phase change （VPC）， which is regulated by genes. Circadian clock-related genes LHY and CCA1 delay the occurrence of VPC by oneself， but the combined effects of these genes on VPC are not clear. Here， a double mutant lhycca1 of Arabidopsis thaliana was used to investigate the characters of VPC through the observation of plant morphology and anatomical structure of shoot tip meristem （shoot apical meristem， SAM）. The expression of molecular regulatory factor miR156 and its target gene SPL3 in VPC were also analyzed. Our results showed that the growth cycle of the lhycca1 double mutant lasted for 15 d. The onset of abaxial trichomes was on the fifth rosette leaf （the 10th day）. Meanwhile， the base angle and the length： width ratio of leaves increased dramatically， and the shoot tip meristem bulged obviously. During growth and development， the expression levels of miR156 and SPL3 was negatively correlated. By contrast， the growth cycle of the wild-type was about 20 d， with the changes of the abaxial trichomes， length： width ratio of leaves， leaf base angle， SAM， miR156 and SPL3 on the sixth rosette leaf （the 15th day）. These results indicated that VPC in the lhycca1 double mutant occurred in advance under the combined effects of the two genes. LHY and CCA1 genes regulated VPC to some extent.

Keywords ?vegetative phase change; lhycca1; circadian clock; Arabidopsis thaliana

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.008

高等植物的生命周期經(jīng)歷一系列不同的生長發(fā)育階段，其中會經(jīng)歷營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段。大多數(shù)高等植物的營養(yǎng)生長和生殖生長階段通常以花芽的分化作為界限，通常一年生植物（擬南芥）在此過渡階段形態(tài)上變化較不明顯[1]。其中營養(yǎng)生長階段又分為幼齡期（juvenile stage）和成熟期（adult phase），從幼齡期到成熟期的轉(zhuǎn)變稱為營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變（vegetative phase change，VPC）[2]。

一年生擬南芥通常作為研究VPC過程的模式植物，VPC過程會伴隨其形態(tài)學、細胞學以及分子層面上的變化。形態(tài)學的研究已經(jīng)表明，擬南芥植株幼年期葉片呈圓形，葉邊緣光滑，只生長近軸面表皮毛;植株成熟期葉片呈匙形，葉邊緣呈鋸齒狀，生長近軸面表皮毛和遠軸面表皮毛，其發(fā)生VPC的標志即出現(xiàn)遠軸面表皮毛[3-4]。而細胞學上的標志以莖尖分生組織（shoot apical meristem， SAM）生長錐從平坦到凸起的變化[5]。分子研究表明，小分子RNA—miR156，及SPLs（SQUAMOSA promoter binding protein-like）基因家族中的靶基因SPL3在VPC中起重要作用[6]，miR156通過抑制SPLs基因家族中靶基因SPL3的表達進而實現(xiàn)自身表達，VPC的變化與miR156和SPL3表達水平的變化密切相關(guān)[7]，且研究結(jié)果顯示，在植物生長發(fā)育階段，miR156幼齡期高水平表達，進入成熟期其表達量大幅度下降，而靶基因SPL3表達模式則與miR156相反[8-9]，因而miR156通過對SPL3基因的表達來調(diào)節(jié)VPC。

VPC與植物自身生物鐘密切相關(guān)。生物鐘是生物體內(nèi)周而復(fù)始的節(jié)律，常見為近似24 h的生物節(jié)律鐘[10]。其中CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1?（CCA1），LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）， 和TIMING OF CAB EXPRESSION 1?（TOC1）是擬南芥生物鐘相關(guān)基因，且構(gòu)成中央振蕩器的3個核心組成部分[11-12]，有研究發(fā)現(xiàn)，TOC1促進LHY和CCA1的表達，而LHY和CCA1的結(jié)合抑制TOC1的表達[13]。前期本課題組研究結(jié)果表明[14]，生物鐘相關(guān)基因LHY和CCA1單一缺失突變體均在第7片蓮座葉（第16天）出現(xiàn)遠軸面表皮毛、莖尖分生組織生長錐出現(xiàn)明顯凸起以及發(fā)生miR156明顯下降的結(jié)果，均說明生物鐘相關(guān)基因LHY和CCA1單一突變體對VPC起延遲作用。那么，兩基因共同缺失對VPC的影響值得進一步研究。本研究通過觀察lhycca1雙突變體植株生長發(fā)育各階段的形態(tài)學變化、莖尖分生組織以及對miR156和SPL3的表達變化，探究了生物鐘相關(guān)基因?qū)M南芥VPC的影響，為深入研究生物鐘相關(guān)基因?qū)PC的調(diào)節(jié)機制提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究所用的擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（WT）種子由本實驗室保存。

擬南芥生物鐘相關(guān)基因雙突變體lhycca1的種子購自美國俄亥俄州立大學種子中心庫（Arab idopsis Biological Resource Center，ABRC）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?種植 ?將在4?℃低溫處理3 d的種子均勻點種在濕潤的人工土[蛭石與大漢土體積比=1∶1混合，高溫（121?℃，30 min）滅菌]表面，貼好標簽，覆上具有透氣孔的保鮮膜，放入人工培養(yǎng)室中，待子葉較大時揭膜。培養(yǎng)條件為22?℃，16?h光照，20?℃，8 h黑暗，相對濕度60 %，光照強度80～200 μmol/（cm2·s）。

1.2.2 ?形態(tài)學觀察 ?觀察野生型擬南芥及l(fā)hycca1雙突變體的生長發(fā)育過程。記錄其蓮座葉葉片總數(shù)、最早出現(xiàn)遠軸面表皮毛的葉片數(shù)及葉片形態(tài)變化趨勢;植物抽薹后，將全部蓮座葉摘取排列拍照，并使用DWRuler測量其葉片及葉柄之間形成的葉片基角。蓮座葉片長與寬使用數(shù)顯游標卡尺進行測量，葉片長為葉片頂端到葉柄與葉片連接處，葉片寬為葉片中最寬處，且用SPSS軟件對葉片長寬比數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

1.2.3 ?石蠟切片的制作 ?擬南芥長出真葉時，根據(jù)李和平[15]的方法，取不同生長時期的野生型和雙突變體的植株于FAA固定液中固定24 h以上，用愛氏蘇木精整染3 d，梯度乙醇脫水，梯度二甲苯透明。浸蠟包埋后，用切片機LEICA RM2265切片，切片厚度9 ?m。中性樹脂封片后，于正置顯微鏡Olympus BX53下觀察，Spot Idea相機拍照，并保存。

1.2.4 ?熒光定量PCR對VPC相關(guān)基因進行分析 ?使用實時熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX96）和大連寶生物熒光定量試劑（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）進行檢測。

在熒光定量PCR中，提取野生型和雙突變體生長發(fā)育階段各個時期的葉片組織中的RNA，且反轉(zhuǎn)成cDNA作為樣品模板，每個樣品重復(fù)3次，以Actin-2為內(nèi)參基因，對植株葉片中調(diào)控基因miR156和靶基因SPL3的表達進行分析檢測。熒光定量PCR所用引物序列為：Actin-2-F： 5-GCTG

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?雙突變體的葉形觀察

觀察野生型和lhycca1雙突變體的葉形變化，進而了解雙突變體對營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變的影響特征。實驗觀察到，野生型和雙突變體的第1對真葉分別出現(xiàn)在第7天和第6天，第2對真葉分別出現(xiàn)在第11天和第9天，第3對真葉分別出現(xiàn)在第15天和第13天。其中野生型在第20天時發(fā)生抽薹，但雙突變體在第15天時已經(jīng)出現(xiàn)抽薹。根據(jù)圖2顯示，野生型蓮座葉葉片總數(shù)為15片，前5片葉形為近圓形，后期變?yōu)闈u長的匙形（圖1A），葉片寬度變小，葉型伸長，第6片（第15天）為遠軸面表皮毛出現(xiàn)的葉序數(shù);雙突變體蓮座葉總數(shù)為7片，其中前4片接近圓形，后期葉片逐漸變?yōu)闈u長匙形（圖1B），在第5片（第10天）葉片寬度開始變小，葉緣出現(xiàn)鋸齒，且出現(xiàn)遠軸面表皮毛。

結(jié)果表明，野生型和雙突變體分別在第6片和第5片時發(fā)生VPC，雙突變體的遠軸面表皮毛和抽薹時間均早于野生型，說明雙突變體VPC提前。

2.2 ?葉片基角的變化趨勢

植物營養(yǎng)生長發(fā)育時期，觀察葉片基角的變化，可觀察VPC發(fā)生時間。測量與統(tǒng)計野生型和雙突變體的葉片基角。雙突變體第3、4、5片蓮座葉葉基角分別為：111.35°、118.17°、128.83°，野生型第3、6、9片蓮座葉葉片基角分別為

A：野生型蓮座葉葉形;B：lhycca1雙突變體蓮座葉葉形。

106.38°、119.54°、127.34°。結(jié)果顯示，雙突變體的葉片基角均比野生型角度大，其中雙突變體的葉基角在第5片明顯增大，而野生型葉基角在第6片明顯增大。說明雙突變體VPC比野生型發(fā)生時間提前。

2.3 ?雙突變體葉長寬比的變化

由圖2可知，野生型和雙突變體前2片葉近似圓形，長寬比比值接近于1，第3、4片葉長寬比略增大，但比值基本相同;而野生型和雙突變體葉片長寬比隨葉片數(shù)增多而逐漸增大，且分別在第6片和第5片葉長寬比比值相比前一片蓮座葉極顯著增大（P<0.01）。因此，根據(jù)葉長寬比分析，得到雙突變體VPC提前。

2.4 ?莖尖分生組織石蠟切片

野生型植株生長第5天時（圖3A），SAM解剖結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，葉原基已生成，SAM生長錐呈平坦狀，原套區(qū)域細胞為單層（圖3a）;WT植株生長到第8天時（圖3B），生長錐略有凸起，細胞為單層（圖3b）;第10天時（圖3C），SAM與第8天相比凸起略有升高（圖3c）;第13天時（圖3D），隨植株進一步生長發(fā)育，莖尖分生組織細胞增多，同時具有單層和多層細胞，但未進入成熟期（圖3d）;第15天時（圖3E），生長錐持續(xù)生長發(fā)育，凸起明顯增高，具多層原套細胞，原體和髓分生組織細胞分裂，數(shù)量增多（圖3e）;第20天時，花芽出現(xiàn)（圖3F），雄蕊原基出現(xiàn)（圖3f）。雙突變體lhycca1生長第5天（圖3G）時，SAM生長錐也呈平坦狀，細胞未分化（圖3g）;第10天（圖3H）時，生長錐較野生型凸起明顯，細胞分裂、增多（圖3h）;第13天（圖3I）時，生長錐凸起十分明顯，原套細胞為多層，原體和髓分生組織細胞均分裂、增多（圖3i）;第15天時，已出現(xiàn)花芽（圖3J），出現(xiàn)典型的花原基（圖3j）。根據(jù)野生型和雙突變體莖尖分生組織生長錐明顯凸起的時間對比發(fā)現(xiàn)，雙突變體VPC提前，與形態(tài)上觀察結(jié)果一致。

2.5 ?熒光定量PCR

在植株的生長發(fā)育過程中，野生型和雙突變體植株的miR156表達水平均呈現(xiàn)下降的趨勢，但雙突變體在各個發(fā)育階段的miR156表達量均比野生型低。從圖4可以看出，野生型在第15天時的miR156的表達量顯著低于第13天（P<0.05），說明野生型在此時發(fā)生VPC，而雙突變體在第10天時相比于第8天時的miR156的表達量顯著降低（P<0.05），說明雙突變體在此時發(fā)生VPC。結(jié)果表明雙突變體VPC發(fā)生的時間比野生型提前。對于SPL3的檢測結(jié)果表明，隨著植株的生長發(fā)育，野生型和雙突變體的SPL3的表達水平均出現(xiàn)上升趨勢，但野生型均比雙突變體表達量高。從圖5可以看出，野生型第15天的SPL3表達量顯著高于第13天時的表達量（P<0.05），雙突變體在第10天時的SPL3表達量顯著高于第8天的表達量（P<0.05），說明野生型和雙突變體VPC分別發(fā)生在第15天和第10天，與miR156所得出的結(jié)果一致，且與本研究中的其他結(jié)果一致。

3 ?討論

高等植物生長發(fā)育經(jīng)歷營養(yǎng)生長和生殖生長，其中營養(yǎng)生長時期由幼齡期和成熟期組成，從幼齡期到成熟期過渡的重要轉(zhuǎn)變時期為營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變，經(jīng)歷這一階段后，植株進入生殖生長[4]。如今對于營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變的研究已有越來越多的學者關(guān)注，如Usami等[17]觀察蓮座葉葉形、遠軸面表皮毛的出現(xiàn)等形態(tài)學和細胞學方面探究其VPC發(fā)生時間，因此在研究擬南芥VPC方面已有較為成熟的體系。前期本課題組[14]在單一生物節(jié)律鐘相關(guān)基因缺失對VPC的影響已有研究，而對于兩個生物節(jié)律鐘相關(guān)基因共同缺失對營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變體制的影響尚缺乏詳盡的研究。

本實驗通過研究雙突變體lhycca1在形態(tài)學、細胞學以及基因表達3個方面，分析其對VPC的影響。結(jié)果表明，野生型和雙突變體分別在蓮座葉第6片（第15天）和蓮座葉第5片（第10天）出現(xiàn)遠軸面表皮毛等形態(tài)上的變化，與野生型相比，雙突變體的VPC提前，而前期研究表明[14]各單一基因突變體均在蓮座葉第7片（第16天）發(fā)生形態(tài)變化，VPC均被延遲。說明LHY和CCA1雙基因突變造成植株VPC提前，單基因突變導(dǎo)致VPC發(fā)生延遲。為清楚了解野生型和雙突變體VPC變化特征，通過SAM的觀察得到，雙突變體SAM的原套、原體及髓分生組織提前發(fā)育，而前期結(jié)果中[14]各單一突變體其SAM發(fā)育遲緩。說明LHY和CCA1共同作用下促進SAM的發(fā)育，從而造成VPC提前，但單基因作用下，SAM發(fā)育延緩，延遲VPC的發(fā)生。且VPC的變化伴隨主要調(diào)控基因miR156及靶基因SPL3表達量的改變，從分子水平上證實雙突變體VPC提前，而前期[14] 對各單一基因突變體進行miR156檢測發(fā)現(xiàn)VPC均被延遲。以上對其分析結(jié)果表明，生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY和CCA1導(dǎo)致VPC發(fā)生變化，且兩基因作用下使VPC提前，而單基因作用下VPC被延遲。

因此在前期研究發(fā)現(xiàn)缺失LHY或CCA1單一基因延遲VPC發(fā)生的基礎(chǔ)上，進一步得到生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY和CCA1同時缺失會造成VPC提前，促進植株生長發(fā)育的進程，且仍能保持自身生物鐘運轉(zhuǎn)，說明生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY和CCA1參與調(diào)控VPC，是生物鐘核心振蕩器發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的核心組成部分。據(jù)此可以推測生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY和CCA1在植株的生長發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用。但其他生物節(jié)律鐘基因的雙重缺失是否會導(dǎo)致VPC以及生長發(fā)育的改變，還玆待研究。

參考文獻

[1]Huijser P， Schmid M. The control of developmental phase transitions in plants[J]. Development， 2011， 138（19）： 41.

[2]Poethig R S. The past， present， and future of vegetative phase change[J]. Plant Physiology， 2010， 154： 541-544.

[3]Telfer A， Bollman K M， Poethig R S. Phase change and the regulation of trichome distribution in Arabidopsis thaliana[J]. Development， 1997， 124： 645-654.

[4]Wu G， Park M Y， Conway S R， et al. The sequential action of miR156 and miR172 regulates developmental timing in Arabidopsis[J]. Cell， 2009， 138： 750-759.

[5]Jacqmard A， Gadisseur I， Bernier G. Cell division and morphological changes in the shoot apex of Arabidopsis thaliana during floral transition[J]. Annals of Botany， 2003， 91： 571-576.

[6]Yang L， Conway S R， Poethig R S. Vegetative phase change is mediated by a leaf-derived signal that represses the tran-

scription of miR156[J]. Development， 2011， 138（2）： 245-249.

[7]Spanudakis E， Jackson S. The role of microRNAs in the control of flowering time[J]. Journal of Experimental Botany， 2014， 65（2）： 365-380.

[8]Wu G， Park M Y， Conway S R， et al. The sequential action of miR156 and miR172 regulates developmental timing in Arabidopsis[J]. Cell， 2009， 138： 750-759.

[9]Gou J Y， Felippes Felipe F， Liu C J， et al. Negative regulation of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis by a miR156-Targeted SPL transcription factor[J]. Plant Cell， 2011， 23（4）： 1512-1522.

[10]Tsuyoshi M， Kay W， Yoshie H， et al. LHY and CCA1 are partially redundant genes required to maintain circadian rhythms in Arabidopsis[J]. Developmental Cell， 2002， 2（5）： 629-641.

[11]Schaffer R， Landgraf J， Accerbi M， et al. Microarray analysis of diurnal and circadian-regulated genes in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2001， 13（1）： 113-123.

[12]Gendron Joshua M， Pruneda-Paz José L， Doherty Colleen J， et al. Arabidopsis circadian clock protein， TOC1， is a DNA-binding transcription factor[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2012， 109（8）： 3167-3172.

[13]AlabadílabaOyama T， Yanovsky M J， et al. Reciprocal regulation between TOC1 and LHY/CCA1 within the Arabidopsis circadian clock[J]. Science， 2001， 293（5531）： 880-883.

[14]郭 ?蕊. 擬南芥生物節(jié)律鐘相關(guān)基因LHY、CCA1和GI對其營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變的作用[D]. 天津： 天津農(nóng)學院， 2017.

[15]李和平. 植物顯微技術(shù)[M]. 2版. 北京： 科學出版社， 2009：12-14， 29， 32-33.

[16]盧 ?陽， 龍 ?鴻. 擬南芥葉片數(shù)目變化突變體對營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變的影響[J]. 植物學報， 2015， 50（3）： 331-337.

[17]Usami T， Horiguchi G， Yano S， et al. The more and smaller cells mutants of Arabidopsis thaliana identify novel roles for SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes in the control of heteroblasty[J]. Development， 2009， 136： 955-964