鹿志偉 侯曉婉 楊子平 張燕梅 李俊峰 周文釗

摘 ?要 ?單子葉甘露糖結(jié)合植物凝集素基因能夠有效抑制具有刺吸式口器的同翅目害蟲的生長(zhǎng)與繁殖，它被證實(shí)在掌葉半夏、小麥、煙草、棉花等單子葉和雙子葉植物中均具有較好的抗蟲效果，但其在劍麻中的功能尚缺乏深入研究。本研究以劍麻為材料，利用RT-PCR技術(shù)成功克隆劍麻lectin基因，命名為AsLEC，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：該基因CDS序列全長(zhǎng)為561 bp，編碼186個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量預(yù)測(cè)為19.97 ku，理論等電點(diǎn)為4.96，為疏水性蛋白;同源氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明劍麻lectin基因與火燒蘭、雪花蓮、君子蘭與菠蘿等植物的單子葉甘露糖結(jié)合凝集素基因同源性較高，氨基酸匹配度達(dá)到48%以上，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明AsLEC基因與火燒蘭親緣關(guān)系更近;對(duì)AsLEC基因進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析表明其具有B-lectin基因家族典型特征，屬于B-lectin基因家族成員;功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有一段33個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，同時(shí)在N端第5～27位置處存在一個(gè)跨膜α螺旋，表明AsLEC蛋白為分泌型蛋白質(zhì)，這與B-lectin蛋白的功能特點(diǎn)相吻合;AsLEC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含11個(gè)β折疊，3個(gè)α螺旋;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該基因很有可能定位在細(xì)胞膜上。劍麻AsLEC基因的克隆對(duì)于研究其在劍麻中的抗蟲功能具有重要意義，同時(shí)豐富了單子葉植物中植物凝集素的相關(guān)研究成果。

關(guān)鍵詞 ?劍麻;單子葉甘露糖結(jié)合植物凝集素;lectin

中圖分類號(hào) ?S563.8 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?The monocotyl mannose-binding plant lectin gene can effectively inhibit the growth and reproduction of Homoptera pests with sucking mouthparts， and it was verified that those genes represent better resistance against insects in monocotyledonous and dicotyledonous plants such as Pinellia ternata， Triticum aestivum L.， Nicotiana tabacum L.， Gossypium spp. However， its function in sisal is still lack of in-depth study. In this study， sisal was used as materials， and the sisal lectin gene was successfully cloned by RT-PCR and named as AsLEC. Bioinformatics analysis were conducted. The results showed that the full-length CDS of AsLEC gene was 561 bp， encoding 186 amino acids. The protein molecular weight was predicted to be 19.97 ku， and the theoretical isoelectric point was 5.01， which was a hydrophobic protein. The results of homologous amino acid sequence alignment indicated that sisal lectin gene had high homology with the superfamily of monocotyl mannose-binding lectin gene in Epipactis helleborine， Leucojum vernum， Cliviaminiata， Ananas comosus （Linn.） Merr. and so on. The amino acid matching degree was more than 48%. The phylogenetic tree analysis indicated that AsLEC gene was more closely related to the lectin genes in Epipactis helleborine. Functional domain analysis of AsLEC gene suggested that it had the typical characteristics of the B-lectin gene family and belongs to the B-lectin gene family. A signal peptide of 33 amino acid residues was predicted in AsLEC protein， and there was a transmembrane alpha helix at the position from the 5th amino acid to the 27th amino acid in the N-terminus， which implyed that AsLEC protein was a secreted protein and was consistent with the functional characteristics of B-lectin protein. AsLEC protein secondary structure contained 11β-sheets， 3α-helices. Subcellular localization prediction showed that AsLEC gene was likely positioned on the cell membrane. Thecloning of sisal AsLEC gene was of great significance for studying its anti-insect function in sisal， and enriches the related research of plant lectin in monocotyledon.

Keywords ?Agave sisalana; monocotyl mannose-binding plant lectin; lectin

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.013

新菠蘿灰粉蚧（Dysmicoccus neobrevipes，Beardsley）屬于同翅目（Homoptera）、粉蚧科（Pseudococcidae）、潔粉蚧屬（Dysmicoccus），其主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，如夏威夷、斐濟(jì)、牙買加、馬來群島、墨西哥、密克羅尼西亞、菲律賓以及中國(guó)臺(tái)灣等國(guó)家和地區(qū)。1998年，新菠蘿灰粉蚧首次出現(xiàn)在我國(guó)海南昌江劍麻種植區(qū)，并迅速大面積爆發(fā)，隨后快速蔓延至廣東湛江地區(qū)，被中國(guó)列為外來有害生物。針對(duì)該害蟲，目前尚無有效的防治措施，其對(duì)我國(guó)劍麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了極大的損失[1]。而植物凝集素作為抗蟲育種工作的重要資源，對(duì)于新菠蘿灰粉蚧的防治具有重要作用[2-3]。

植物凝集素（lectin）是在植物中普遍存在的一類可以與單糖或者寡糖可逆性結(jié)合的蛋白質(zhì)[4]，根據(jù)結(jié)合糖的特異性，植物凝集素主要包括單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族、木菠蘿（Jacalin）凝集素家族、豆科類凝集素家族、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素家族、莧菜凝集素家族、Ⅱ-型核糖體失活蛋白家族、葫蘆科韌皮部凝集素家族等7個(gè)蛋白質(zhì)家族，其中單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族基因?qū)ν崮看涛胶οx具有較好的毒殺作用[2-3， 5]。如徐瓊芳等[6]將雪花蓮凝集素基因轉(zhuǎn)入小麥中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)蚜蟲具有較好的抗性;Liu等[7]成功將AalT/GNA融合蛋白轉(zhuǎn)入煙草后，其對(duì)咀嚼式和刺吸式昆蟲表現(xiàn)出明顯的抗性;肖松華等[8]報(bào)道轉(zhuǎn)外源凝集素的棉花對(duì)棉蚜的吸引力降低。然而，植物凝集素在劍麻中是否具有相同或相似的功能有待進(jìn)一步研究。

本研究擬在前期已完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組拼接序列設(shè)計(jì)劍麻lectin基因CDS全長(zhǎng)序列克隆引物，并對(duì)克隆得到的基因序列進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)、同源氨基酸比對(duì)、進(jìn)化樹構(gòu)建、功能結(jié)構(gòu)域分析、亞細(xì)胞定位以及信號(hào)肽預(yù)測(cè)等一系列生物信息學(xué)分析，以期初步闡明劍麻lectin基因的一系列相關(guān)基礎(chǔ)功能，為進(jìn)一步深入研究其表型功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

所用材料為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所劍麻研究室種質(zhì)資源圃保存的3年生劍麻H.11648葉片。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA的提取與cDNA鏈的合成 ?利用全式金生物技術(shù)有限公司的RN04-總RNA提取試劑盒（TRIzol法）對(duì)劍麻葉片進(jìn)行總RNA提取，同時(shí)利用瓊脂糖電泳及微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)技術(shù)對(duì)總RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)分析。取3 μg總RNA，使用全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

對(duì)PCR產(chǎn)物純化后，連接至pEASY?-T1 Cloning Kit（全式金公司）載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色的陽性克隆菌斑后進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)檢測(cè)，最后送菌液至華大基因進(jìn)行測(cè)序分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?AsLEC基因T克隆菌落PCR結(jié)果

如圖1所示，1、2、3三個(gè)菌落PCR結(jié)果中，1大小為561 bp左右，與目的條帶大小一致，而2、3條帶大小與目的條帶不符，因此，菌落1可能為克隆的AsLEC基因菌落。

2.2 ?AsLEC基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

以劍麻cDNA為模板，用AsLEC基因CDS全長(zhǎng)引物L(fēng)EC-F1，LEC-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段包含完整的CDS序列，長(zhǎng)561 bp，編碼186個(gè)氨基酸殘基

利用ExPasy軟件對(duì)劍麻AsLEC氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。結(jié)果表明AsLEC氨基酸序列的理論等電點(diǎn)（PI）為4.96，分子量為19.97?ku，AsLEC基因編碼蛋白質(zhì)的分子式為C893H1375 N231O273S8，蛋白質(zhì)半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為18.68，為穩(wěn)定蛋白。AsLEC基因編碼的蛋白有12個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Glu+Asp），9個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基（Lys+Arg），總的親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity）為0.003，氨基酸組成見表1。

2.3 ?劍麻AsLEC功能結(jié)構(gòu)域分析及同源氨基酸序列比對(duì)

利用NCBI在線軟件對(duì)AsLEC蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該氨基酸屬于B-lectin蛋白超家族[11]，見圖3。通過NCBI的Blast工具對(duì)AsLEC基因序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果表明AsLEC與單子葉植物lectin基因同源性更高，氨基酸相圖中數(shù)字表示氨基酸位置。

似性達(dá)到50%以上，其中與魔芋lectin （AHE93335.1）相似性達(dá)到60%，與姜黃lectin（AKT75734.1）相似性達(dá)到59%，與菠蘿mannose-specific lectin-like（XP_020104167.1）相似性達(dá)到58%，與水仙lectin（ACR15122.1）相似性達(dá)到48%，與君子蘭lectin（AAA19912.1）相似性達(dá)到53%，與雪花蓮lectin（1MSA_A）相似性達(dá)到55%。

選取上述Blast的部分結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)（圖4），由圖2和圖4可知，劍麻AsLEC氨基酸序列和其他植物lectin一樣，具有B-lectin（Bulb-type mannose-specific lectin）基因家族的

AsLEC蛋白氨基酸序列與其他物種具有較高的同源性。其中，JNetPRED（prediction）即為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，

α螺旋（helices）用紅色的條形表示，β折疊（sheets）用綠色箭頭表示，差異主要出現(xiàn)在N端和C端，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，

AsLEC蛋白含有11個(gè)β折疊。典型特征：氨基酸序列高度保守，每個(gè)多肽具有11個(gè)折疊，其中前3個(gè)為成熟蛋白質(zhì)單體的Ⅰ型亞結(jié)構(gòu)域，后面8個(gè)分別形成均具有4個(gè)折疊的Ⅱ和Ⅲ型亞結(jié)構(gòu)域，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)亞結(jié)構(gòu)域之間通過環(huán)相連（圖5）。每個(gè)亞結(jié)構(gòu)域表面的縫隙中均存在一個(gè)相同的保守性甘露糖結(jié)合位點(diǎn)（Q-D-N-V-Y，在圖4中分別用紅框做標(biāo)記）。4個(gè)這樣的單體通過非共價(jià)鍵結(jié)合成為成熟的蛋白質(zhì)，上述Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)典型的亞結(jié)構(gòu)域?yàn)锽- lectin基因家族的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域[12-13]，表明克隆得到的基因片段為單子葉甘露糖結(jié)合凝集素類lectin基因，并命名為AsLEC。

2.4 ?AsLEC蛋白的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用SignalIP4.1Server和TMHMM Server v.2.0在線軟件對(duì)AsLEC蛋白進(jìn)行信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果見圖6和圖7。從圖6中可以看出，在AsLEC蛋白的N端第33～34位置處氨基酸的S值最為陡峭，C值最大，因此該位置為信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)，AsLEC蛋白具有一段33個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。從圖7可以看出，在AsLEC 蛋白的N端第5～27位置處存在一個(gè)跨膜α螺旋（TMhelix）。綜合以上信息，表明AsLEC蛋白為分泌型蛋白質(zhì)，這與B-lectin蛋白的功能特點(diǎn)相吻合。

2.5 ?AsLEC系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

根據(jù)1.2.3中NCBI的blast結(jié)果，選取部分植物的lectin氨基酸序列以及另外三類lectin氨基酸序列，利用MEGA6和FigTree軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，其中構(gòu)建方法采用最大相似法，Bootstrap值為1000（圖8）。進(jìn)化樹整體聚為星號(hào) 表示糖結(jié)合位點(diǎn)，不同顏色條帶代表不同的亞結(jié)構(gòu)模塊。

四大類，其中HrLEC、MtLEC和RcLEC屬于幾丁質(zhì)結(jié)合類植物凝集素，SeLEC和SnLEC2屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白類植物凝集素，DbLEC和UeLEC屬于豆科類植物凝集素，而AsLEC和其他的蛋白質(zhì)均屬于單子葉甘露糖結(jié)合類植物凝集素，進(jìn)一步驗(yàn)證了AsLEC基因的凝集素類別。

2.6 ?AsLEC蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.7 ?AsLEC基因表達(dá)模式分析

對(duì)AsLEC基因在劍麻紫色卷葉病高抗和高感植株不同發(fā)病階段進(jìn)行表達(dá)模式分析，結(jié)果見圖10。從圖10中可以看出，與高感植株相比，AsLEC基因在劍麻紫色卷葉病高抗植株不同發(fā)病階段中均呈現(xiàn)較高表達(dá)量，兩者之間表達(dá)量最高可相差3.5倍，推測(cè)AsLEC基因在劍麻對(duì)紫色卷葉病抗性中起著重要作用。

3 ?討論

本研究克隆獲得AsLEC基因，通過功能結(jié)構(gòu)域分析得出其具有B-lectin基因家族特有的典型特征序列，歸為B-lectin（Bulb-type mannose-spe c fic lectin）基因家族。B-lectin基因家族為植物凝集素超家族重要的一員[14]，除了B-lectin（單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族）外，植物凝集素家族還包括葫蘆科韌皮部凝集素家族、2-型核糖體失活蛋白家族、豆科類凝集素家族、木菠蘿（Jacalin）凝集素家族、莧菜凝集素家族、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素家族[15]。與雪花蓮、水仙、君子蘭等植物的單子葉結(jié)合甘露糖凝集素家族相比，劍麻AsLEC單體蛋白除具有3個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域、每個(gè)亞結(jié)構(gòu)域表面的縫隙中均存在一個(gè)相同的保守性甘露糖結(jié)合位點(diǎn)以及11個(gè)保守的折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)等這些單子葉結(jié)合甘露糖凝集素家族的共同特征外，還含有一些變異結(jié)構(gòu)，如其N端明顯多出5個(gè)氨基酸殘基以及保守性的甘露糖結(jié)合區(qū)域也發(fā)生1個(gè)氨基酸殘基的改變等。其中，甘露糖結(jié)合區(qū)域作為單子葉結(jié)合甘露糖凝集素基因發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)功能所必不可少的結(jié)構(gòu)成分，它的典型結(jié)構(gòu)為：結(jié)合區(qū)域均位于每個(gè)凝集素蛋白的亞結(jié)構(gòu)域表面縫隙處[16]，高度保守的Q-D-N-V-Y氨基酸殘基通過氫鍵與甘露糖特異性結(jié)合，每個(gè)凝集素蛋白單體含有3個(gè)同樣的位點(diǎn)，成熟的凝集素蛋白共有12個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)[17]。然而在劍麻AsLEC蛋白中，其甘露糖結(jié)合區(qū)域中高度保守的Q-D-N-V-Y突變?yōu)镼-D-N-A-Y。推測(cè)這種變化為進(jìn)化中堿基突變產(chǎn)生，此變化對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)合甘露糖是否產(chǎn)生影響，尚有待進(jìn)一步研究。

總之，單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族在多種植物中均存在，且在抗蟲、抗病毒、免疫誘導(dǎo)以及入藥[18-19]等方面發(fā)揮著重要作用。本研究克隆得到的劍麻AsLEC基因雖然在N端保守結(jié)構(gòu)域和甘露糖特異結(jié)合位點(diǎn)處存在部分變異，但是其在總體機(jī)構(gòu)上仍符合單子葉結(jié)合甘露糖凝集素家族的基本特征，且在劍麻紫色卷葉病高抗植株中呈現(xiàn)較高的表達(dá)量。然而這些結(jié)構(gòu)的差異是否影響AsLEC基因在劍麻中行使正常的功能，這些尚不清晰，有待進(jìn)一步研究。因此，本研究獲得了劍麻AsLEC基因，對(duì)于后續(xù)研究其在劍麻中的功能奠定了重要基礎(chǔ)。

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