王 盈，趙 磊，董中東，任 妍，張 寧，陳 鋒

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450046)

小麥株型是指小麥植株地上部分的生長態(tài)勢，包括株高、旗葉長寬、莖節(jié)比、分蘗數(shù)和分蘗夾角等[1-2]，是諸多重要農(nóng)藝性狀的綜合體現(xiàn)，直接影響小麥的適應(yīng)性、產(chǎn)量和收獲指數(shù)。張?zhí)m萍等[3]研究表明，理想的株型能改善植株和群體的受光態(tài)勢，減少群體間的競爭力，提高光能利用效率和收獲指數(shù)，增加籽粒同化物的積累，從而提高作物產(chǎn)量。株高是小麥最易觀測的農(nóng)藝性狀，與小麥的抗倒伏能力密切相關(guān)，間接影響小麥產(chǎn)量；旗葉是小麥植株上最后長出來的一片葉子，影響著小麥后期的生殖生長，特別是對小麥籽粒形成起著很重要的作用，小麥籽粒成熟過程中積累的糖類約50%來自旗葉，因此旗葉性狀也直接關(guān)乎小麥產(chǎn)量[4]。綜上所述，株高和旗葉是與小麥生長發(fā)育相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，與小麥抗逆、產(chǎn)量密切相關(guān)，是小麥高產(chǎn)育種的重要目標(biāo)性狀。對株高和旗葉長寬等株型相關(guān)性狀進(jìn)行QTL遺傳研究，不僅能加深對小麥株型遺傳機(jī)理的認(rèn)識，同時還可以為小麥株型改良育種提供重要的參考。

目前國內(nèi)外已有許多學(xué)者利用不同遺傳分離群體圍繞株高和旗葉性狀的遺傳機(jī)制和QTL定位開展了大量工作，取得了一定進(jìn)展。對株高而言，Cadalen等[5]利用中國春和Courtot為親本構(gòu)建的DH群體檢測到9個控制株高的QTLs，其中兩個RFLP標(biāo)記(Xfba1-4B和Xfba211-4D)分別與矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b連鎖，其余QTL可以分別解釋11.9%～19.1% 的表型變異；張坤普等[6]利用DH群體也檢測到9個控制株高的QTLs，其中兩個(Qph4B和Qph4D)與Rht1(Rht-B1b)和Rht2(Rht-D1b)位置相同，其余QTL可以分別解釋2.84%～20.22%的表型變異；劉冬成等[7]利用矮稈冬小麥品系ND3338和F390雜交得到的F2:3群體，在四個環(huán)境中共發(fā)現(xiàn)了7個影響株高的QTLs，單個QTL可解釋5.2%～37.2%的表型變異，其中4B染色體上一個主效QTL與Rht-Blb位置一致；周淼平等[8]用望水白與墨西哥小麥品種Alondra雜交構(gòu)建的重組自交系在三個環(huán)境下檢測到4個影響小麥株高的QTLs，分別位于1D、2B、4A和4D染色體上，單個QTL能夠解釋10.3%～33.8%的表型變異，其中4D染色體上的主效QTL推測是Rht-D1b基因。前人研究結(jié)果中，能重復(fù)被檢測到且效應(yīng)較大的主效QTLs大多都指向已知的Rht基因，表明Rht基因?yàn)橹旮叩闹餍д{(diào)控基因，但它們并不能解釋株高帶來的所有變異，且目前僅有部分被克隆出，仍需進(jìn)一步挖掘出更多的、穩(wěn)定的株高調(diào)控位點(diǎn)來加深對株高遺傳機(jī)理的認(rèn)識。

與株高相比，目前對小麥旗葉性狀的遺傳研究相對較少，但也取得了一些進(jìn)展。常 鑫等[9]以小偃81和西農(nóng)1376構(gòu)建的RIL群體為材料，在多個環(huán)境中檢測到多個控制旗葉長、寬和面積的QTLs；閆 雪等[10]利用以旱選10號和魯麥14構(gòu)建的DH群體，在干旱脅迫和正常灌溉條件下檢測到多個控制旗葉長、寬及面積的QTLs，其中部分表現(xiàn)為一因多效；連俊方等[11]以周8425B和小偃81構(gòu)建的重組自交系為材料，結(jié)合90K 基因芯片技術(shù)，也在不同染色體上檢測到了多個旗葉相關(guān)性狀QTLs，并鑒定出3個QTL富集區(qū)段及一因多效QTL；呂學(xué)蓮等[12]利用寧春4號和Drasdale構(gòu)建的RIL群體，在正常灌溉和不同干旱脅迫共3種處理下，共檢測到了22個控制旗葉大小的QTLs，并推測部分QTL可能具有一因多效；Liu等[13]利用由小麥品種ND3331和西藏半野生小麥Zang 1817構(gòu)建的RIL群體為材料，同樣定位到了多個控制旗葉不同性狀的一因多效QTLs。分析先前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中僅有很少的QTL定位結(jié)果一致，且效應(yīng)值普遍不高，表明旗葉相關(guān)性狀受微效多基因位點(diǎn)控制，且易受外界因素影響，雖然定位技術(shù)日漸完善，但目前仍未有相關(guān)基因圖位克隆的報道，還需繼續(xù)加強(qiáng)對旗葉相關(guān)性狀調(diào)控位點(diǎn)的發(fā)掘。

小麥株型相關(guān)性狀大多為復(fù)雜的數(shù)量性狀，雖然目前針對株高和旗葉性狀已經(jīng)開展了大量的遺傳研究工作，但廣度和深度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，不能滿足育種生產(chǎn)實(shí)踐的需要。本研究以小麥品系SHA3/CBRD和Naxos雜交獲得的F10代重組自交系為材料，調(diào)查其在2年3個環(huán)境下的株高、旗葉長和旗葉寬等株型相關(guān)性狀的表型值，并進(jìn)行QTL定位分析，以期進(jìn)一步挖掘小麥株型相關(guān)性狀的QTL，實(shí)現(xiàn)小麥株型相關(guān)QTLs的精細(xì)定位和定向改良，為培育株型合理、高產(chǎn)小麥新品種提供有價值的參考信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用以Shanghai 3/CBRD和Naxos為親本進(jìn)行雜交、通過單籽傳法創(chuàng)制的含有137個家系的F10代重組自交系群體為試驗(yàn)材料，該群體F6家系由挪威生命科學(xué)大學(xué)的Morten Lillemo教授提供，后經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥分子育種實(shí)驗(yàn)室繁育選擇而成。該群體親本間株高及旗葉性狀差異顯著，且群體家系間分離明顯。參試材料于2015-2016年度種植于鄭州(E1)，2016-2017年度種植于鄭州(E2)和原陽(E3)。兩年種植均采用2行區(qū)，行長1.5 m，行距25 cm，株距5 cm。在整個生育期進(jìn)行正常的田間管理。

待試驗(yàn)材料進(jìn)入灌漿期且生長穩(wěn)定后，測量株高、旗葉長和旗葉寬。調(diào)查時每個株系隨機(jī)選取10株，對主莖穗進(jìn)行測量，取平均值并保留兩位小數(shù)點(diǎn)作為相應(yīng)性狀的表型數(shù)值(表1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用十二烷基肌氨酸鈉法(SLS法)[14]提取RIL群體雙親及137個家系的基因組DNA。選取952對SSR引物在雙親間進(jìn)行篩選，最終篩選出373對能夠覆蓋小麥21條染色體的多態(tài)性引物，利用其對群體各株系進(jìn)行基因型鑒定，引物信息來源于GrainGenes(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR體系與程序參考2×Taq PCR MasterMix(天根，北京)說明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度根據(jù)具體引物設(shè)定，延伸時間為1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2010軟件對親本表型值進(jìn)行描述性統(tǒng)計。利用SPSS 20.0軟件對親本及RIL群體各表型數(shù)值進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建與QTL分析

通過PCR擴(kuò)增及電泳檢測，分析鑒定由Shanghai 3/CBRD和Naxos構(gòu)建的F10重組自交系(RIL)每一個品系的基因型，利用QTL IciMapping 4.1.0.0軟件，LOD閾值設(shè)定為2.5，進(jìn)行遺傳連鎖分析，并構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。結(jié)合表型數(shù)據(jù)，設(shè)置步移距離為1cM，PIN為0.001，采用完備區(qū)間作圖法(ICIM-ADD)進(jìn)行QTL定位分析，QTL的命名按照Mccouch等[15]的方法命名，即“Q+性狀名稱英文縮寫+“-”+染色體編號”。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及RIL群體株高和旗葉性狀的表型變異

對參試RIL群體表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，RIL群體的雙親SHA3/CBRD和Naxos在株高、旗葉長和旗葉寬上均存在顯著性差異(表1)。同時，所考察性狀的表型值在RIL群體中的變異系數(shù)均大于10%，表明所考察性狀的表型在該群體中的變異較豐富，變異范圍較廣；同時根據(jù)所考察性狀表型的頻率分布和偏度、峰度檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同環(huán)境下各考察性狀表型頻率分布均呈現(xiàn)正態(tài)或近似正態(tài)的連續(xù)分布(表2，圖1)，適合進(jìn)行QTL檢測。

表1 Shanghai 3/CRBD和Naxos的表型差異Table 1 Phenotypic variation of Shanghai 3/CBRD and Naxos

表中同列數(shù)字后大、小寫字母不同分別表示在0.01和0.05水平上差異顯著。

The small and capital letters following data indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.2 QTL定位

2.2.1 株高的QTL定位

利用完備區(qū)間作圖法，在3個環(huán)境中共檢測到1個株高相關(guān)QTL，位于6A染色體上，將其命名為Qph-6A；此QTL在3個環(huán)境中均可被檢測到，表現(xiàn)穩(wěn)定一致，所在標(biāo)記區(qū)間為XwPt2153～XwPt0832，標(biāo)記間遺傳距離為5.11 cM，在3個環(huán)境下能夠解釋的表型貢獻(xiàn)率分別為 13.93%、8.33%和8.35%(表3，圖2)；該QTL在3個環(huán)境中的加性效應(yīng)值分別為-5.53、-4.18和 -3.97(表3)，均為負(fù)值，表明其增效等位基因來自低值親本Shanghai 3/CBRD。

2.2.2 旗葉性狀的QTL定位

在3個環(huán)境中共檢測到1個旗葉長的QTL，位于6A染色體上，將其命名為Qfll-6A；該QTL在2個環(huán)境中(E1和E2)可被檢測到，所在標(biāo)記區(qū)間為Xgwm169～Xwpt6829，標(biāo)記間距離為17.2 cM，加性效應(yīng)值均為1.02，對表型的貢獻(xiàn)率分別為8.10%和8.18%，平均貢獻(xiàn)率為8.14%(表3，圖2)。

表2 RIL群體在不同環(huán)境下株高和旗葉性狀的變異分析Table 2 Variance analysis of plant height and flag leaf traits in RILs in different environments

PH:Plant height;FLL:Flag leaf length;FLW:Flag leaf width.The same below.

ZZ：鄭州；YY：原陽。下同。

ZZ:Zhengzhou; YY:Yuanyang.The same below.

圖1 不同環(huán)境下小麥RIL群體株型相關(guān)性狀的頻率分布

Fig.1 Frequency of plant architecture related traits in wheat RILs under different environments

在3個環(huán)境中共檢測到2個旗葉寬的QTL，分別命名為Qflw-2B.1和Qflw-2B.2，所在標(biāo)記區(qū)間分別為Xbarc159～XwPt5017和XwPt8284～Xbarc159，對表型的貢獻(xiàn)率分別為9.14%和9.46%，其加性效應(yīng)值均為0.07(表3，圖2)；同時，這2個QTL的定位區(qū)間含有一個相同標(biāo)記，因此推測這2個QTL可能為同一個QTL，將其記為Qflw-2B，標(biāo)記間距離為2.75 cM。

表3 株高和旗葉性狀的QTL定位結(jié)果Table 3 QTL mapping results for plant height and flag leaf traits

圖2 株高(PH)、旗葉長(FLL)、旗葉寬(FLW)的QTL在染色體上的分布

3 討 論

小麥株高與旗葉相關(guān)性狀均屬于典型的數(shù)量性狀，受多個遺傳位點(diǎn)調(diào)控，且受環(huán)境影響較大。即使利用相同的遺傳群體在不同環(huán)境下檢測出的QTL也存在較大差異，因而雖然株高和旗葉性狀表型數(shù)據(jù)較易觀察，但遺傳研究卻進(jìn)展緩慢，對相關(guān)性狀調(diào)控基因的克隆更是困難。目前，通過研究人員不懈努力，在株高上已有二十多個矮稈基因被陸續(xù)鑒定出來[16-19]，其中擁有良好遺傳特性的Rht-B1b和Rht-D1b自然突變基因，在小麥遺傳育種進(jìn)程中已被廣泛應(yīng)用并取得良好效果[5,20-22]。但分析大量前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，到目前為止，株高上可被重復(fù)檢測的QTL位點(diǎn)僅限于Rht-B1b和Rht-D1b等少數(shù)幾個主效位點(diǎn)，其余位點(diǎn)雖然獲得大量QTLs，但穩(wěn)定性較差，其可靠性仍需進(jìn)一步檢驗(yàn)，生產(chǎn)應(yīng)用更是相距甚遠(yuǎn)。因此為了獲得更多實(shí)際生產(chǎn)上可以利用的株高調(diào)控位點(diǎn)，還需對其遺傳研究進(jìn)一步加強(qiáng)。小麥旗葉性狀遺傳研究進(jìn)度較株高而言更為滯后，到目前為止，雖然借助不同遺傳群體和技術(shù)手段鑒定出一大批QTLs，但對相關(guān)基因的克隆仍鮮有報道，整體研究水平仍停留在QTL檢測階段，究其原因，可能是其調(diào)控位點(diǎn)較多且效應(yīng)偏低，因此要克隆相關(guān)基因就愈加困難，前人的研究結(jié)果很好的反映了這一點(diǎn)。鑒于此，仍需進(jìn)一步加大對旗葉相關(guān)性狀遺傳調(diào)控位點(diǎn)的挖掘，期待未來在量變的基礎(chǔ)上取得突破。

作圖群體親本的選擇直接影響遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的準(zhǔn)確性和適用性。本研究選用以Shanghai 3/CBRD和Naxos為親本構(gòu)建的重組自交系群體為試驗(yàn)材料，其中Naxos為來自于德國的春小麥品種，Shanghai 3/CBRD為由CIMMYT創(chuàng)制的一個小麥品系，血統(tǒng)來源為：Shanghai 3//Chuanmai 18/Bagula。所選用群體親本親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳背景差異較大，變異豐富，有助于發(fā)掘較多的潛在調(diào)控位點(diǎn)。同時本研究所用群體親本在株高和旗葉性狀上表現(xiàn)出明顯差異，且在群體間分離明顯，比較適合于QTL定位。

本研究利用一個高代遺傳分離群體在3個環(huán)境下對株高和旗葉相關(guān)性狀進(jìn)行了QTL分析，共檢測到了3個控制株高和旗葉長寬等株型相關(guān)性狀的QTLs，分別位于6A與2B染色體，單個QTL在不同環(huán)境中對表型的貢獻(xiàn)率均達(dá)到8%以上；且3個QTLs均可在2個及以上環(huán)境中被檢測到，其中與株高相關(guān)的QTLQph-6A在三個環(huán)境下均可檢測到，表明這些數(shù)量性狀位點(diǎn)的遺傳比較穩(wěn)定；同時在個別環(huán)境中檢測不到QTL，可能是受環(huán)境影響造成的。

對小麥株高性狀QTL進(jìn)行檢測，挖掘出更多調(diào)控株高的基因位點(diǎn)，將進(jìn)一步豐富小麥株高的遺傳研究。本研究在6A染色體上、標(biāo)記XwPt2153～XwPt0832之間檢測到一個株高相關(guān)QTLQph-6A，對比前人研究結(jié)果，雖與劉冬成等[7]和王竹林等[23]所檢測到的QTL位于同一染色體上，但是與其不在同一標(biāo)記上或標(biāo)記附近，推測其可能為新的位點(diǎn)，但是不排除與前人檢測到的是同一QTL的可能性。旗葉在小麥生產(chǎn)中常被稱作“功能葉”，對籽粒的形成亦即小麥的產(chǎn)量有著非常重要的作用[2]，對旗葉性狀進(jìn)行QTL分析，能進(jìn)一步加深對其調(diào)控方式與遺傳機(jī)理的認(rèn)識。近年來已有較多對旗葉性狀的研究，包括旗葉姿態(tài)、旗葉長、旗葉寬、旗葉面積、旗葉周長等等。本研究檢測到的旗葉長QTLQfll-6A和旗葉寬QTLQflw-2B，與前人對旗葉長和旗葉寬的研究所檢測到的QTL位置均不相同，推測這兩個QTL可能是新的調(diào)控旗葉性狀的QTLs。在本研究中未能檢測出與Rht-B1b和Rht-D1b等矮稈基因相一致的株高遺傳位點(diǎn)以及前人所報道的調(diào)控旗葉性狀的一因多效QTL，可能是受限于本試驗(yàn)所選用材料的遺傳背景，及群體相對較小，也可能受不同環(huán)境以及測量誤差的影響。如果能構(gòu)建遺傳變異較大的分離群體，利用高密度的標(biāo)記，對相關(guān)性狀進(jìn)行定位分析，將更有利于獲得更多穩(wěn)定的QTL。本研究作為小麥株高和旗葉性狀遺傳位點(diǎn)發(fā)掘的有益嘗試，可為相關(guān)基因的分離鑒定以及分子標(biāo)記輔助育種提供有用的參考信息。