楊東升，于 卓，于肖夏，李佳奇,吳國芳，牛亞青青

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

冰草(AgropyroncristatumGaertn.)別名野麥子，是小麥族(TriticeaeDumort)密叢型多年生禾草。其根系發(fā)達，具沙套，抗旱、抗寒性強，適應性廣，蘊藏著麥類作物抗逆性遺傳改良的重要基因資源[1-2]。冰草春季返青早，秋季枯黃晚，生長期在200 d以上，是早春和晚秋放牧的重要牧草[3]。此外，冰草葉量較大，草質(zhì)好，飼用價值高，并富含蛋白質(zhì)。一般拔節(jié)期鮮草蛋白質(zhì)含量約17%，開花期約14%，是禾本科牧草中蛋白質(zhì)含量較高的草種。

近年來，有關(guān)冰草的形態(tài)學、生物學、細胞學、抗逆性、遺傳多樣性和基因工程、分子標記技術(shù)等已有廣泛研究，并在生產(chǎn)實踐中得以應用[2-6]。為創(chuàng)制抗逆性強、品質(zhì)好、產(chǎn)量高的四倍體雜交冰草新種質(zhì)，本課題組前期將產(chǎn)自內(nèi)蒙古錫林郭勒草原的具優(yōu)良抗性基因的二倍體野生蒙古冰草(AgropyronmongolicumKeng，2n=2x=14)與引自美國加州的具優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)基因的栽培品種航道冰草(Agropyroncristatumcv. Fairway，2n=2x=14)進行人工授粉雜交，成功獲得種間雜種F1植株，并通過秋水仙堿溶液誘導分蘗苗莖尖得到了遺傳穩(wěn)定的四倍體雜交冰草，其鮮草產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量均顯著優(yōu)于二倍體親本及其雜種F1[3-5]；為構(gòu)建四倍體雜交冰草的分子遺傳連鎖圖譜，經(jīng)人工套袋自交得到了加倍植株的F2代分離單株群體，以此為材料建立了高密度的遺傳連鎖圖譜[6]。

植物重要性狀的QTL定位是基因圖位克隆、功能解析和分子標記輔助育種研究的基礎(chǔ)。目前，在小麥[7]、水稻[8]、玉米[9]、馬鈴薯[10]、大豆[11]、油菜[12]等主要農(nóng)作物的重要性狀QTL定位研究方面已有較多報道，而有關(guān)牧草的QTL定位研究報道甚少，僅見于黑麥草[13]、紫花苜蓿[14]、高丹草[15]、鴨茅[16]等草種。在雜交冰草QTL定位方面，本課題組李小雷[17]、姜志艷等[18]分別對二倍體和四倍體雜交冰草的株高、分蘗數(shù)及穗型等性狀進行了初步定位研究；Che等[19]以雜交冰草F1群體為材料，對其穗莖節(jié)長、穗寬等6個產(chǎn)量相關(guān)的性狀進行了QTL定位。但有關(guān)冰草品質(zhì)性狀，如蛋白質(zhì)、脂肪含量等性狀的QTL定位尚未見報道。

本試驗擬在課題組已構(gòu)建出的四倍體雜交冰草高密度分子遺傳連鎖圖譜(含763個SRAP和248個SSR標記，圖譜標記間平均距離2.19 cM)基礎(chǔ)上，對經(jīng)兩年一點測定的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量、莖葉比和單株產(chǎn)量共4個性狀進行QTL定位分析，以期為深入開展冰草品質(zhì)、產(chǎn)量等相關(guān)性狀的基因克隆、標記輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為四倍體雜交冰草(蒙古冰草×航道冰草)F2代246個分離單株及其親本，均種植在呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場的多年生草種圃內(nèi)。種植行距為40 cm，株距為25 cm。生長期內(nèi)，視生長狀況及時灌水、施肥，滿足其對水分和養(yǎng)分的需求。每個單株分蘗后均形成無性株系。試驗地土壤為沙壤土，肥力中等，具灌溉條件。

1.2 研究方法

1.2.1 性狀的測定

于2017年6月和2018年6月，分別從四倍體雜交冰草F2代分離單株形成的246個無性系及親本材料中，各剪取盛花期有效分蘗株，測定粗蛋白質(zhì)含量、粗脂肪含量、莖葉比和單株產(chǎn)量4個重要性狀。具體方法如下：

(1)冰草粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的測定：于盛花期田間隨機剪取四倍體雜交冰草F2單株及親本的地上部鮮樣各30株，用羊皮紙袋分裝后帶回實驗室；105 ℃殺青30 min；60 ℃烘干48 h，晾至室溫后用小型粉碎機打成粉末狀、備用。將粉碎好的樣品裝入檢測盒，用INSTALAB○R700系列近紅外品質(zhì)分析儀(USA)進行測定。

(2)單株產(chǎn)量和莖葉比的測定：于盛花期隨機剪取各供試材料50株地上部植株，稱重后迅速分離莖稈與葉片，并稱重，計算單株產(chǎn)量、莖稈與葉片的鮮重比值(莖葉比)。

1.2.2 各性狀的QTL定位

在我們已構(gòu)建出的四倍體雜交冰草高密度分子遺傳連鎖圖譜[6]上，利用Map QTL 4.0[20]提供的區(qū)間作圖法(Interval mapping，IM)對測定的各性狀數(shù)據(jù)進行全基因組QTL掃描檢測。掃描步長為1.0 cM，并將連鎖系數(shù)LOD(logarithm of odds)區(qū)間視為95%的置信區(qū)間[21]。依據(jù)檢測結(jié)果尋找各性狀確切的QTL在不同連鎖群上與其緊密連鎖的標記位置和數(shù)目，并確定其遺傳效應、貢獻率和LOD閾值。LOD閾值確定后，將各性狀檢測到的QTLs用Word 2003繪圖軟件組合繪制成定位分布圖。QTL位點命名方法為：Q+目標性狀英文名縮寫+QTL數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

利用Excel 2003對數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 22.0進行表現(xiàn)型及其分布分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰草4個性狀的表型及其分析

從表1可看出，4個被測性狀在雙親間均存在顯著差異，其中粗蛋白質(zhì)含量(Cpc)、粗脂肪含量(Cfc)和單株產(chǎn)量(Fwsp)3個性狀在雙親間差異極顯著，且在性狀表型值上，父本航道冰草均高于母本蒙古冰草(莖葉比除外)。四倍體雜交冰草F2群體的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量、莖葉比、單株產(chǎn)量均出現(xiàn)超親現(xiàn)象，表明雙親含有對這些性狀變異起調(diào)控作用的基因位點。4個性狀的平均廣義遺傳率為70.25%，其中，莖葉比的廣義遺傳率為81%；單株產(chǎn)量的廣義遺傳率為59%，表明其易受環(huán)境影響。說明4個被測性狀是既受環(huán)境影響又受微效多基因控制的數(shù)量性狀。

由圖1可知，冰草4個性狀的測定值均呈正態(tài)性分布，可用于QTL定位。

2.2 被測4個性狀的QTL定位

由表2、圖2可知，在連鎖系數(shù)LOD>2.0條件下，冰草粗蛋白質(zhì)含量、粗脂肪含量、莖葉比、單株產(chǎn)量4個性狀共檢測到37個QTLs，每個連鎖群上平均分布2.6個。以在連鎖群LG8和LG10上分布最多，各為5個QTL；在連鎖群LG5和LG6上分布最少，各為1個QTL。各性狀QTL的遺傳貢獻率為6.1%～37.8%，其遺傳效應、數(shù)目及作用方式有一定差異。

表1 冰草F2群體4個性狀表現(xiàn)型分析Table 1 Phenotyping analysis of the four traits in F2 population of wheatgrass

*和**分別表示雙親間差異達0.05和0.01顯著水平。

* and ** represent significant difference between parents at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

M和F分別表示母本蒙古冰草和父本航道冰草。

M and F representA.mongolicumKeng(female) andA.cristatumcv. Fairway(male)，respectively.

圖1 F2群體各性狀的頻數(shù)分布

Fig.1 Frequency distribution of each trait of F2population

2.2.1 粗蛋白質(zhì)含量的QTL

檢測到與冰草粗蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL共6個，分別是Qcpc1、Qcpc2、Qcpc3、Qcpc4、Qcpc5、Qcpc6，其分布在連鎖群LG1、LG8、LG10和LG11上，遺傳貢獻率為6.1%～15.7%。貢獻率最高的Qcpc1位于LG1的102.1 cM處，與SRAP標記m7e8-154共分離；貢獻率最低的Qcpc3位于LG8的84.3 cM處，與SRAP標記m4coe9-58共分離。

2.2.2 粗脂肪含量的QTL

檢測到與粗脂肪含量相關(guān)的QTL有9個，即Qcfc1～Qcfc9。其分布在連鎖群LG1、LG3、LG4、LG7、LG8、LG10、LG11和LG13上，遺傳貢獻率為7.5%～27.2%，貢獻率較高的(>15%)分別是位于LG7和LG8上160.0 cM和32.6 cM處的Qcfc4和Qcfc5，Qcfc4與SRAP標記m5e7-56共分離，Qcfc5與SSR標記xtxp230-386和SRAP標記m3e3-539緊密連鎖。

2.2.3 莖葉比的QTL

檢測到與莖葉比相關(guān)的QTL有12個，即Qslrw1～Qslrw12，其分別位于連鎖群LG1、LG3、LG4、LG5、LG6、LG8、LG9、LG12、LG13和LG14上，遺傳貢獻率為11.6%～33.4%，超過20%的主效QTL有5個，其緊密連鎖標記分別是m7e8-154、xtxp159-89、m10be7-957、m3e8-935和m7be7-184，貢獻率最高的是位于LG1上 102.1 cM處的Qslrw1，對應標記為m7e8-154，作用方式表現(xiàn)為顯性。

表2 冰草4個重要性狀的QTL及其遺傳效應Table 2 QTLs for four important traits and its genetic effect in wheatgrass

緊密連鎖標記中，以英文字母m和bm開頭的標記為SRAP標記，其余均為SSR標記。 PD:部分顯性(|d/a|=0.20～0.80)；D:顯性(|d/a|=0.81～1.20)；OD:超顯性(|d/a|>1.20)。*和**：0.05和0.01水平偏分離標記。

SRAP markers are beginning with the letters of m or bm，and the rest are SSR markers. PD:Partial dominant(|d/a|=0.20- 0.80); D:Dominant(|d/a|=0.81-1.20); OD:Over dominant(|d/a|>1.20).* and **:Distorted markers of 0.05 and 0.01 levels.

(圖續(xù)轉(zhuǎn)下頁 Be continued in next page)

圖2 4個性狀的QTLs在各連鎖群上的分布

2.2.4 單株產(chǎn)量的QTL

檢測到與單株鮮草產(chǎn)量相關(guān)的QTL位點有10個，即Qfwsp1～Qfwsp10。分別位于連鎖群LG2、LG3、LG7、LG8、LG10、LG11、LG12和LG14上，遺傳貢獻率為13.8%～37.8%，超過20%的主效QTL 6個，其連鎖標記分別是m10be7-405、bm10e11-657、m3e2-408—m7be7-63、m5e7-56、m3e2-683和AH99-153—m4coe9-1524。

3 討 論

有研究表明，作物品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性等重要性狀相關(guān)的QTLs存在著“一因多效”的遺傳效應[22-24]。在牧草上，石 悅等[15]對高丹草產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL研究發(fā)現(xiàn)，在同一連鎖群上存在“一因多效”現(xiàn)象。本試驗發(fā)現(xiàn)，控制冰草粗蛋白質(zhì)含量和莖葉比的個別QTL在LG1上的102.1 cM處存在共位點標記m7e8-154，控制粗脂肪含量和單株產(chǎn)量的QTL在LG7的160.0 cM處存在共位點標記m5e7-56，控制粗蛋白含量和粗脂肪含量的QTL在LG10的72.6 cM處均與標記xtxp230-386—m3e3-539緊密連鎖。進一步比較發(fā)現(xiàn)，這3個共位點標記QTL的遺傳貢獻率均較高，如控制粗蛋白質(zhì)含量與莖葉比共位點標記m7e8-154的QTL遺傳貢獻率分別為15.7%和33.4%；控制粗脂肪含量和單株產(chǎn)量共位點標記m5e7-56的QTL遺傳貢獻率分別為19.2%和29.2%(表2)。這表明QTLs“一因多效”現(xiàn)象是植物的重要遺傳效應之一，對這些“一因多效”的QTL進行跟蹤和選擇，可能有利于從正向遺傳學角度開展目標性狀QTL精細定位、基因圖位克隆、功能解析和標記輔助育種的深入研究。

在植物性狀QTL定位研究中，連鎖系數(shù)LOD值的確定關(guān)系到QTLs在連鎖群上的可信度。李慧慧等[25]研究指出，為盡可能多的定位到遺傳效應較小的控制目標性狀的QTLs，確?？刂朴N性狀的基因不遺漏，需適度減小QTL閾值。Tanksley等[26]研究表明，高密度、高飽和度的分子遺傳圖譜適當降低檢測QTLs時的LOD閾值，有利于提高定位的準確性。一般認為LOD閾值≥3.0時進行QTL位點檢測效果較好，而當LOD<2.0時兩位點間連鎖效應較弱或不存在連鎖；LOD>2.0時定位連鎖群上的QTLs可以保證極小概率(P<0.05)錯誤的出現(xiàn)[27-28]。趙方媛等[29]以飼草型小黑麥F2群體的184個單株為材料，對其抗條銹病進行QTL定位分析時，將LOD≥2.0設為QTL閾值，共定位到6個抗條銹病QTLs。本試驗在已構(gòu)建出的四倍體雜交冰草分子遺傳圖譜上，用246個加倍植株F2群體分離單株為材料，定位冰草粗蛋白質(zhì)含量等4個重要性狀QTLs，由于該圖譜為高密度圖譜(含1 011個標記、平均間距2.19 cM)，且各標記在連鎖群上分布均勻、未出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，因此確定LOD>2.0為閾值，使得同一性狀檢測到的QTL較多，保證了QTL檢測結(jié)果的真實性和可靠性。

4 結(jié) 論

在前期已構(gòu)建出的四倍體雜交冰草SRAP和SSR高密度分子遺傳連鎖圖譜上，定位了控制粗蛋白質(zhì)含量等4個重要性狀的QTLs 37個，其中控制粗蛋白質(zhì)含量性狀的有6個、粗脂肪含量的有9個，莖葉比的有12個、單株產(chǎn)量的有10個。明確了各QTL在冰草14個連鎖群上的分子標記位點和遺傳效應，各QTL的遺傳貢獻率范圍為6.1%～37.8%。