印尼虎魚RAD-seq數(shù)據(jù)中微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選及特征分析

屈政委，宋紅梅，汪學(xué)杰，劉 奕，牟希東，劉 超，胡隱昌

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省現(xiàn)代休閑漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

印尼虎魚，又名印尼擬松鯛(DatnioidesPulcher)，隸屬鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Percoidei)松鯛科(Lobotidae)擬松鯛屬(Datnioides)，俗稱印尼虎魚，主要分布于湄南河流域、湄公河流域以及印尼蘇門答臘的婆羅洲西部，是當(dāng)?shù)匾环N非常珍稀的物種。印尼虎魚因其紋路深邃，對(duì)比分明，身板寬厚有力，捕食間隙展示了它的力量之美，因而備受人們喜愛，本世紀(jì)初作為觀賞魚引入我國(guó)，常與龍魚同池養(yǎng)殖，寓意“龍爭(zhēng)虎斗”。然而虎魚價(jià)格一直居高不下，關(guān)于其遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)生物學(xué)等研究嚴(yán)重匱乏，虎魚存在雌雄難以辨別、雌雄發(fā)育成熟時(shí)期不一致等特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)也尚未有人工繁殖成功的報(bào)道，在雌雄鑒別、親本鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)等方面資料甚少，僅有線粒體數(shù)據(jù)分析[1]，急需填補(bǔ)相關(guān)基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)又稱微衛(wèi)星序列，是由長(zhǎng)度為1～6 bp的重復(fù)單元和側(cè)翼序列組成的DNA序列串，而根據(jù)其開發(fā)的DNA分子標(biāo)記具有共顯性、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單、遍布整個(gè)基因組等特點(diǎn)。自20世紀(jì)70年代發(fā)展起來，已被廣泛應(yīng)用到動(dòng)植物的遺傳研究中，隨著更多物種轉(zhuǎn)錄組等基因組數(shù)據(jù)的獲得，SSR標(biāo)記應(yīng)用于布什羅非魚(Tilapiabuttikoferi)[2]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[3]、鯽(Carassiusauratus)[4]等水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳圖譜、遺傳多樣性、遺傳進(jìn)化、親緣關(guān)系分析等方面研究也多有報(bào)道。近年來，依據(jù)磁珠富集法及EST及數(shù)據(jù)開發(fā)和挖掘SSR標(biāo)記的方法廣泛被采用，如孔杰等采用磁珠富集法開發(fā)長(zhǎng)臀鮠(Cranoglanisbouderius)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記27對(duì)[5]，曹柱等采用磁珠富集法開發(fā)方正銀鯽(C.auratusgibelio(Bloch))具有多態(tài)性位點(diǎn)的微衛(wèi)星標(biāo)記30對(duì)，并進(jìn)行群體驗(yàn)證[6]。此后，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法也在動(dòng)植物中被大量報(bào)道，如銀鲴(Xenocyprisargentea)[7]、紅鯛(Lutjanuscampechanus)[8]、鮸(Miichthysmiiuy)[9]、烏鱧(Channaargus)[10]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[11]、馬氏珠母貝[12]、臘梅(Chimonanthuspraecox)[13]等的SSR標(biāo)記開發(fā)。然而轉(zhuǎn)錄組相對(duì)成本較高，目前，印尼虎魚尚未獲得全基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，甚至也沒有擬松鯛科近源物種的可參考全基因組序列。

近年來，在第2代測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展而來的RAD測(cè)序技術(shù)(Restriction-site-associated DNA sequencing)應(yīng)運(yùn)而生，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切片段進(jìn)行高通量測(cè)序，所實(shí)現(xiàn)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)被逐步運(yùn)用。簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)極大的降低基因組的復(fù)雜度，且不受參考基因組的限制，無(wú)參考基因組的物種也可以使用該技術(shù)進(jìn)行大量的 SNP 和 SSR 標(biāo)記開發(fā)，測(cè)序成本也顯著降低、準(zhǔn)確率高[14-15]。采用此方法，已經(jīng)在煙草[16]、大刺鰍[17]、異型花[18]等其他動(dòng)植物中開發(fā)出 SSR 標(biāo)記并應(yīng)用于遺傳研究。本研究采用RAD-seq技術(shù)，對(duì)印尼虎魚進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，分析SSR位點(diǎn)的數(shù)量、基序類型、基序重復(fù)次數(shù)，開發(fā)印尼虎魚微衛(wèi)星標(biāo)記，篩選具有多態(tài)性的SSR引物，為印尼虎魚擬松鯛魚類多態(tài)性SSR的篩選和遺傳研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體和基因組DNA的提取

試驗(yàn)魚取自廣州珠江水產(chǎn)研究所觀賞魚基地，試驗(yàn)魚三尾，采樣后取鰭條在4 ℃冰箱中放置，過夜后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用試劑?TIANamp Genomic DNA Kit,TIANGEN)提取基因組DNA。

提取過程：每尾魚取約0.03 g組織，加400 μL裂解液，用勻漿機(jī)將樣品充分研磨。室溫10 000 r/min離心1 min,倒掉上清液，加200 μL緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮。隨后再加20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混勻后55 ℃恒溫水浴，水浴過程中上下顛倒加速溶解，至組織消解完全，簡(jiǎn)短離心。加200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃水浴10 min，混合液變得清亮后，簡(jiǎn)短離心。加200 μL無(wú)水乙醇，充分震蕩15 s，簡(jiǎn)短離心。將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，室溫12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。向吸附柱中加500 μL緩沖液GD，室溫12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。向吸附柱中加600 μL漂洗液PW，室溫12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。12 000 r/min離心2 min,倒掉廢液，室溫下晾干至無(wú)乙醇味。將吸附柱放在新的離心管中，加30 μL雙蒸水靜置數(shù)分鐘充分溶解，12 000 r/min離心2 min，將DNA收集到離心管中。所提取的模板DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠定性檢測(cè)，再用酶標(biāo)儀定量檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)OD260/OD280的比值以及模板DNA濃度符合作為模板DNA的條件，保存在-20 ℃中備用。

1.2 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

利用RAD-seq測(cè)序技術(shù)，對(duì)印尼虎魚的基因組DNA進(jìn)行簡(jiǎn)化測(cè)序。簡(jiǎn)易流程如下：采用6堿基酶EcoRI進(jìn)行RAD酶切建庫(kù)，Paired-End100策略上機(jī)(Illumina HiSeq2000)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行RAD tag(標(biāo)簽)的聚類，產(chǎn)生組裝apire-end read(read 2)，通過contig檢測(cè)和組裝得到長(zhǎng)度約300 bp的酶切相關(guān)contig，用以開發(fā)SSR標(biāo)記。

1.3 基因組SSR位點(diǎn)的篩選和引物設(shè)計(jì)

利用MISA軟件(MicroSatellite identification tool，http://pgrc.ikp- gatersleben.de/misa)在read 2覆蓋的參考基因組序列中進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，搜索標(biāo)準(zhǔn)為單堿基、二堿基和三堿基重復(fù)次數(shù)分別在15、6和5次及以上，四、五、六堿基重復(fù)類型在4次及以上，相鄰的SSR序列不少于100 bp。根據(jù)SSR位點(diǎn)兩翼序列，利用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)引物，數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)選取100對(duì)微衛(wèi)星引物，由廣州擎科生物技術(shù)公司合成。對(duì)虎魚基因組DNA樣品(6個(gè)樣品)進(jìn)行序列分析，若在測(cè)序個(gè)體間存在重復(fù)差異即為多態(tài)性SSR。

1.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)

PCR反應(yīng)為25 μL體系：酶0.25 μL,10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，4×dNTP 0.5 μL，10 μmol/L上游引物0.5 μL，10 μmol/L下游引物0.5 μL，模板cDNA 0.5 μL，加無(wú)菌水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s(退火溫度視情況而定)，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,然后再通過銀染得到目的條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 印尼虎魚簡(jiǎn)化基因組序列產(chǎn)出的檢測(cè)

印尼虎魚RAD-seq結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得總長(zhǎng)度為1.96 Gb，具有13 427 412個(gè)干凈讀長(zhǎng)(clean reads)的原始數(shù)據(jù)(表1)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、過濾，共獲得13 308 806個(gè)高質(zhì)量干凈讀長(zhǎng)(HQ clean reads)，平均Q30(測(cè)序堿基質(zhì)量值，即測(cè)序時(shí)錯(cuò)誤識(shí)別的概率為0.1%、正確率為99.9%的堿基比例)為93.31%，平均的GC含量為42.72%。從表1得知，過濾前后差異不大，Q30處于較高水平，表明測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠性，GC含量稍低，但對(duì)此次測(cè)序反應(yīng)的影響不大。

表1 RAD-seq 基因組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.2 印尼虎魚簡(jiǎn)化基因組中的SSR位點(diǎn)頻率和分布特征

此次RAD-seq獲得的干凈讀長(zhǎng)(clean reads)進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組組裝，read2拼接所得平均長(zhǎng)度333 bp大小的片段163 510個(gè)，利用MISA軟件在reads覆蓋區(qū)域中查找SSR位點(diǎn)，在樣本中共有21 259個(gè)reads含有SSR位點(diǎn)，共檢測(cè)到26 359個(gè)SSR位點(diǎn)， SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率(含SSR位點(diǎn)個(gè)數(shù)與read2的contig總個(gè)數(shù)的比值)為16.1%。這些SSR位點(diǎn)中，完全重復(fù)型(P型)所占比例最大，共計(jì)20 616個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的78.21%；復(fù)合型(C型)只有3 105個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的11.78%。

26 359個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)由496種重復(fù)基序組成(表2)，主要分布在三、四、五堿基重復(fù)類型中,分別有57、173和199種，占基元總數(shù)比為11.49%、34.88%和40.12%。而單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)的基元種數(shù)共4種(即ATCG四種堿基)，六核苷酸重復(fù)基元種數(shù)為51種，所占基元總數(shù)比例為10.28%。

2.3 SSR的位點(diǎn)基序重復(fù)次數(shù)與序列類型

印尼虎魚不同類型SSR位點(diǎn)中單核苷酸基元的重復(fù)次數(shù)集中在15～20次，二核苷酸和三核苷酸基元主要集中在6～13次和5～9次，四核苷酸基元在4～6次，而五核苷酸和六核苷酸基元的重復(fù)次數(shù)4～5次；以6次基元重復(fù)次數(shù)的SSR位點(diǎn)數(shù)最高，達(dá)到5 214個(gè)SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)19.78%；7次和8次重復(fù)次數(shù)分別為3 076和2 176個(gè)SSR位點(diǎn)，占總SSR位點(diǎn)數(shù)11.67%和8.26%。另外，隨重復(fù)次數(shù)的增加各個(gè)位點(diǎn)類型出現(xiàn)的頻率逐漸下降。通過分析所得到的SSR數(shù)目的具體結(jié)果列入表3。

表2 印尼虎魚基因組-微衛(wèi)星位點(diǎn)的分布信息

表3 印尼虎魚基因組中 SSR 位點(diǎn)的基序重復(fù)次數(shù)分布

如表3所示，SSR位點(diǎn)中二核苷酸類型出現(xiàn)比例最高，達(dá)19 492個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的73.95%；其次是單核苷酸類型和三核苷酸類型差別不大，分別為2 209(8.38%)和2 271個(gè)(8.62%)；四核苷酸類型為1 847個(gè)(7.01%)；五核苷酸和六核苷酸類型最少，分別僅有479(1.82%)和61個(gè)(0.23%)。此外，有3 105個(gè)位點(diǎn)以復(fù)合重復(fù)形式出現(xiàn),多態(tài)性SSR數(shù)目為2 783個(gè)。

圖1 基元類型比例圖Fig.1 Primitive type scale

在SSR重復(fù)序列中，二堿基重復(fù)序列所占比最大，主要有AC/GT、AG/CT、AT/AT三種重復(fù)序列，其中AC/GT重復(fù)序列16 040個(gè)，占比最高為總數(shù)的60.9%，其次為AG/CT重復(fù)序列3 027個(gè),占11.5%，最后是AT/AT重復(fù)序列374個(gè)，所占比例為1.4%；其次是單堿基重復(fù)序列，主要有A/T、C/G兩種重復(fù)類型，其中A/T重復(fù)序列1 998個(gè)，所占比例較大，比例為7.6%，C/G重復(fù)序列211個(gè)，占比為0.8%。三堿基重復(fù)序列包含6種重復(fù)類型，分別為AAC/GTT、AAG/CTT、AAT/ATG、AGC/CTG、AGG/CCT、ATC/ATG，各個(gè)序列的數(shù)目分別為339、364、348、381、468、179，所占比例分別為1.3%、1.0%、1.3%、1.4%、1.8%、0.7%；四堿基重復(fù)序列包括4種重復(fù)類型，分別為AAAC/GTTT、AAAT/ATTT、ACAG/CTGT、AGAT/ATCT，每個(gè)重復(fù)序列的數(shù)目分別為344、305、215、211，所占比例分別為1.3%、1.2%、0.8%、0.8%；五堿基重復(fù)序列和六堿基重復(fù)序列共有1 665個(gè)，占序列總數(shù)目的6.3%。除二堿基重復(fù)類型外，A/T重復(fù)序列占比7.6%最大，其他類型的基元占比相差無(wú)幾，大部分在1%左右。各基元頻率分布見圖1。

2.4 多態(tài)性SSRs標(biāo)記的序列信息

利用Primer 3.0軟件對(duì)26 359個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，成功設(shè)計(jì)出20 066對(duì)SSR引物，引物設(shè)計(jì)成功率為76.13%；根據(jù)印尼虎魚簡(jiǎn)化測(cè)序數(shù)據(jù)，初步發(fā)現(xiàn)其中有2 783對(duì)引物的SSR位點(diǎn)具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為13.9%。隨機(jī)選擇100對(duì)可能具有多態(tài)性位點(diǎn)的SSR引物，對(duì)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證。有92對(duì)引物在檢測(cè)樣品中均能擴(kuò)出清晰的條帶，其中有 20對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性。具有多態(tài)性的20對(duì)SSR引物信息及驗(yàn)證結(jié)果如表 4 所示。

表4 20對(duì)多態(tài)性SSRs引物信息

3 討論

本研究在21 259個(gè)reads覆蓋的參考基因組序列中共檢測(cè)到完全重復(fù)型(P型)和復(fù)合型(C型)兩種SSR位點(diǎn)共計(jì)26 359個(gè)，其中P型20 616個(gè)，所占比例最大(78.21%)，C型只有3 105個(gè)，占位點(diǎn)總數(shù)的11.79%。在所有SSR位點(diǎn)中二核苷酸類型出現(xiàn)比例最高，達(dá)73.95%，這與其他動(dòng)植物基因組中SSR位點(diǎn)的分布特征相符[16,19,20]，其他物種中大多數(shù)都是二堿基重復(fù)類型占據(jù)主體地位，但二堿基比例如此高的并不多見。如對(duì)牙鲆(Paralichthysolivaceus)EST資源的SSR信息分析中，二堿基重復(fù)類型所占比例為59.02%[21]。從目前報(bào)道的結(jié)果來看,馬氏珠母貝的EST-SSR也是以二核苷酸重復(fù)類型為主(48.5%)[12]，而在縊蟶(Sinonovaculaconstricta)EST-SSR分布特征及引物開發(fā)利用研究中卻是以三核苷酸重復(fù)類型為主(37.13%)[22]。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)槊艽a子以三核苷酸為功能單位,在翻譯成蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)生基因突變而造成三核苷酸的位移,但沒有對(duì)一個(gè)表達(dá)基因的閱讀框造成太大的影響[23]。

在SSR 位點(diǎn)重復(fù)類型上，本研究中印尼虎魚的二核苷酸類型出現(xiàn)比例最高，這與多數(shù)物種中以二核苷酸重復(fù)類型為主的結(jié)果一致[21]；在SSR基序的結(jié)構(gòu)方面，共發(fā)現(xiàn)496種基序，各核苷酸類型中以A/T、AC/GT、AG/CT、AGG/CCT 、AGC/CTG、AAAC/GTTT基序最為豐富，這與烏鱧、斑鱧、鳙魚等SSR位點(diǎn)特征相似[10,24]，在重復(fù)類型分布上，單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸均表現(xiàn)出一定的偏倚性，如單核苷酸重復(fù)類型中A/T重復(fù)序列1 998個(gè)，而C/G重復(fù)序列只有211個(gè)，在二核苷酸重復(fù)類型中AC/GT占主要優(yōu)勢(shì)，三堿基重復(fù)類型中最多的是AGG/CCT，二、三核苷酸重復(fù)類型在不同物種間差異較大[6,17]，這種重復(fù)單元的偏倚性和重復(fù)類型的差異與種間差異性有關(guān)[5,22]。

SSR位點(diǎn)的多態(tài)性與重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系[25]。本研究中獲得的SSR位點(diǎn)中，單核苷酸基元類型重復(fù)次數(shù)集中在15～20次，二核苷酸和三核苷酸基元主要集中在5～13次，隨重復(fù)次數(shù)的增加各個(gè)位點(diǎn)類型出現(xiàn)的頻率逐漸下降。為找到具有多態(tài)性的位點(diǎn)，本研究挑選的基元類型中，二核苷酸類型重復(fù)次數(shù)≥6、三核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5、四核苷酸重復(fù)次數(shù)≥4，錦鯉選取重復(fù)單元次數(shù)較高的序列進(jìn)行篩選。挑出100對(duì)SSR引物，以6個(gè)印尼虎魚樣本基因組DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，其中肯定能擴(kuò)增出目的片段的引物有73對(duì)，剩余27對(duì)未擴(kuò)增出條帶或擴(kuò)增出非目的片段。73對(duì)有效擴(kuò)增的引物中有20對(duì)具有多態(tài)性，初步開發(fā)的20個(gè)具有多態(tài)性的SSR位點(diǎn)，可用于擬松鯛魚類的群體遺傳背景分析，同時(shí)本研究也證實(shí)了通過RAD-seq技術(shù)開發(fā)印尼虎魚SSR標(biāo)記的可行性。

4 結(jié)論

本研究采用RAD-seq首次對(duì)印尼虎魚樣本進(jìn)行了測(cè)序，共獲得13 308 806個(gè)高質(zhì)量干凈讀長(zhǎng)(HQ clean reads)，通過序列分析，在21 259個(gè)reads覆蓋的參考基因組序列中共檢測(cè)到26 359個(gè)SSR位點(diǎn)，主要以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型為主。從中隨機(jī)選二、三、四核苷酸重復(fù)類型微衛(wèi)星位點(diǎn)100個(gè)，合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，可穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶的有73對(duì)，其中20對(duì)具有多態(tài)性。