延遲采收對(duì)釀酒葡萄類(lèi)黃酮物質(zhì)的影響

趙 婷，吳佳穎，陳黃曌,2，梁 攀，孟江飛，張振文,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046）

類(lèi)黃酮物質(zhì)是植物酚類(lèi)次生代謝物，由苯環(huán)上連有一個(gè)或多個(gè)羥基構(gòu)成[1]。在葡萄與葡萄酒中類(lèi)黃酮物質(zhì)占有舉足輕重的地位，可以抵抗紫外線和病原體對(duì)葡萄的損傷，具有抗氧化性，可預(yù)防冠心病等[2-3]。類(lèi)黃酮物質(zhì)主要包括花色苷、黃酮醇、黃烷-3-醇[4-5]。其中花色苷是主要的呈色物質(zhì)，以花色素（花青素、甲基花青素、花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素）與葡萄糖結(jié)合生成的3-O-葡萄糖苷形式存在[4]?；ㄉ盏孽；梢栽黾踊ㄉ盏姆€(wěn)定性，因此?；潭雀叩奶幚碛欣谄咸丫祁伾姆€(wěn)定性。黃酮醇可以通過(guò)與花色苷的輔色作用對(duì)紅葡萄酒的顏色產(chǎn)生影響[6-7]。黃烷-3-醇是葡萄酒中的苦澀味主要來(lái)源，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)葡萄酒的結(jié)構(gòu)和口感產(chǎn)生很大影響，縮合單寧是黃烷-3-醇二聚體或多聚體聚合物，在口腔中單寧與蛋白質(zhì)或其他聚合體（如多糖）結(jié)合引起收斂性，使人產(chǎn)生苦澀的感覺(jué)[8]。葡萄果實(shí)中類(lèi)黃酮物質(zhì)含量主要受氣候條件[9-11]、品種特性[12-14]、栽培條件[15-18]和成熟度[13,17-19]等因素的影響。

葡萄的成熟度非常重要，它影響著葡萄的組分，決定了品種的特性。在葡萄成熟過(guò)程各品質(zhì)指標(biāo)發(fā)生相應(yīng)的變化且不同步[20]。Kennedy等[17]研究表明，可溶性固形物及花色素在轉(zhuǎn)色期開(kāi)始積累，而單寧的積累發(fā)生在轉(zhuǎn)色期前幾周，并且從轉(zhuǎn)色期開(kāi)始逐漸下降，直到成熟后期進(jìn)入穩(wěn)定階段。釀酒葡萄主要以工業(yè)成熟度（即糖成熟）為采收標(biāo)準(zhǔn)[21]，但是除了糖酸，其他主要的成分，如酚類(lèi)物質(zhì)與香氣達(dá)到適當(dāng)水平也很重要[19,22]。葡萄是呼吸非躍變型水果，無(wú)法在采后進(jìn)一步成熟，因此在合適的成熟度采收對(duì)于釀酒葡萄果實(shí)品質(zhì)與葡萄酒的質(zhì)量至關(guān)重要[19]。釀酒經(jīng)驗(yàn)表明，用更成熟的葡萄能夠釀制出顏色更穩(wěn)定、紫色色調(diào)更高或更強(qiáng)烈的葡萄酒，這與類(lèi)黃酮物質(zhì)密切相關(guān)。因此，研究果實(shí)成熟度與類(lèi)黃酮物質(zhì)之間的關(guān)系是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究延遲采收對(duì)釀酒葡萄梅鹿輒和赤霞珠類(lèi)中黃酮物質(zhì)的影響，為確定梅鹿輒和赤霞珠的最佳采收期提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試釀酒葡萄品種梅鹿輒（Vitis vinifera L.cv. Merlot）和赤霞珠（Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon）均于2016年采摘于山西省襄汾縣堯京酒莊（35.7°～36.1°N，111.1°～111.7°E），該地年平均氣溫11.5 ℃，年降雨量550 mm左右，無(wú)霜期185 d。梅鹿輒和赤霞珠均定植于2012年，株行距為1 m×3 m，傾斜式獨(dú)龍蔓樹(shù)形。

根據(jù)果實(shí)成熟度監(jiān)控結(jié)果，于果實(shí)生理成熟期（可溶性固形物和可滴定酸含量趨于平穩(wěn)）采第1次樣品，之后每隔7 d采1 次樣，共采4 次。梅鹿輒分別于9月11日（ML-對(duì)照）、9月18日（ML-H1）、9月25日（ML-H2）和10月2日（ML-H3）采樣，赤霞珠分別于9月25日（CS-對(duì)照）、10月2日（CS-H1）、10月9日（CS-H2）和10月16日（CS-H3）采樣，試驗(yàn)地區(qū)9～11月的降水與氣溫如圖1所示。每次隨機(jī)選取10 棵植株，每棵植株分別在陰面與陽(yáng)面隨機(jī)采一穗葡萄，共20 穗，每個(gè)時(shí)期采取3 個(gè)重復(fù)。樣品裝在泡沫盒后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并置于-40 ℃超低溫冰箱備用。

圖1 2016年9—11月的氣溫與降水Fig. 1 Precipitation and temperature during September to November of 2016

乙酸乙酯、葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸鈉、硫酸銨、五倍子酸、甲酸、甲醇、乙腈、乙酸（均為分析純）天津市博迪化工有限公司；福林-酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；甲基纖維素、（+）-兒茶素、干沒(méi)食子酸（均為分析純），二甲花翠素、原花色素B1、槲皮素（均為色譜純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1數(shù)顯手持式折糖儀 日本ATAGO公司；Mettler ET18型自動(dòng)點(diǎn)位滴定儀 瑞士Mettler-Toledo公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；FD5系列真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Gold Sim公司；AUW220D電子天平、UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲器 昆山市超聲儀器有限公司；CentriVap離心濃縮儀 美國(guó)Labconco公司；5804R型低溫冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；1100、1200系列LC/MSDTrap-VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Aligent公司。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)基本理化指標(biāo)的測(cè)定

可溶性固形物含量：采用數(shù)顯手持式折糖儀法測(cè)定；可滴定酸含量：采用NaOH滴定法測(cè)定，結(jié)果以酒石酸計(jì)；還原糖含量：采用斐林試劑滴定法測(cè)定，結(jié)果以葡萄糖計(jì)；pH值：采用pH計(jì)測(cè)量法?？偡雍坎捎酶Ａ中たū壬y(cè)定，結(jié)果以沒(méi)食子酸計(jì)（果皮干粉）[23]；單寧含量：采用甲基纖維素法測(cè)定，結(jié)果以?xún)翰杷赜?jì)（果皮干粉）[24]；總花色苷含量采用pH示差法測(cè)定，結(jié)果以二甲花翠素-3-葡萄糖苷計(jì)[25]。酚類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定在避光條件下操作。

1.3.2 果實(shí)類(lèi)黃酮物質(zhì)的提取及測(cè)定

樣品前處理：取每處理200 粒保存于-40 ℃的果實(shí)樣品，在冷凍狀態(tài)下剝皮經(jīng)液氮速凍后用粉碎機(jī)打成末，真空冷凍干燥機(jī)-50 ℃條件下真空冷凍24 h以上，使葡萄皮粉充分干燥，之后保存在-80 ℃冰箱備用。

果皮單體花色苷的提?。悍Q(chēng)取0.500 g葡萄皮干粉于50 mL離心管，加入10 mL提取劑（甲酸-甲醇（98∶2，V/V）），避光超聲10 min，之后在搖床中150 r/min振蕩提取30 min，取出后8 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)上清液于50 mL離心管中，重復(fù)提取4 次，合并上清液在離心濃縮儀于30 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，剩余物質(zhì)用10 mL流動(dòng)相（A-B，9∶1，V/V）定容，于-80 ℃冰箱保存待測(cè)[26]。其中，流動(dòng)相A相為水-甲酸-乙腈（92∶2∶6，V/V），流動(dòng)相B相為水-甲酸-乙腈（44∶2∶54，V/V）。

果皮非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)的提?。悍Q(chēng)取1.0 g葡萄皮干粉于離心管中，加入1 mL蒸餾水之后加9 mL乙酸乙酯，在搖床中避光振蕩提取30 min，轉(zhuǎn)上清液于50 mL離心管中，共提取4 次，合并上清液在離心濃縮儀中于30 ℃蒸干，殘?jiān)蒙V甲醇定容至1 mL，于-80 ℃冰箱保存待測(cè)[27]。

類(lèi)黃酮物質(zhì)采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定?；ㄉ瘴镔|(zhì)的檢測(cè)采用1100系列LC/MSD Trap -VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，二極管陣列檢測(cè)器。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2 次?；ㄉ盏亩ㄐ匝芯扛鶕?jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒中心建立的“葡萄與酒花色苷HPLC-UV-MS指紋譜庫(kù)”進(jìn)行[28]。花色苷定量：以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為外標(biāo)物建立5～500 mg/L之間、9 個(gè)梯度、3 個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，決定系數(shù)在0.999以上，以其他花色苷相當(dāng)于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計(jì)。果皮中花色含量單位為mg/kg（果皮干質(zhì)量）表示。非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)采用1200系列LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，可變波長(zhǎng)檢測(cè)器。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)2 次[27]。非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)的定性與定量參考Liang Nana等[28]的方法進(jìn)行，果皮中非花色苷含量單位用mg/kg（果皮干質(zhì)量）表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010統(tǒng)計(jì)，SPSS 20.0（IBM,Armonk, NY, USA）進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用Tukey’s HSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 延遲采收對(duì)釀酒葡萄果實(shí)基本理化指標(biāo)的影響

表1 延遲采收對(duì)梅鹿輒果實(shí)基本理化指標(biāo)的影響Table 1 Effects of delayed harvest on general composition of Merlot

不同采收期的梅鹿輒和赤霞珠果實(shí)基本理化指標(biāo)見(jiàn)表1、2。隨著采收期的延遲，梅鹿輒和赤霞珠的果粒質(zhì)量和縱徑均顯著減??；可溶性固形物和還原糖含量均增加，可滴定酸的含量持續(xù)下降，H3與對(duì)照差異顯著。H2和H3時(shí)期梅鹿輒總花色苷含量降低，而赤霞珠總花色苷含量隨著延遲采收增加。梅鹿輒和赤霞珠單寧的變化情況一致，H2時(shí)期的單寧含量均為4 個(gè)時(shí)期中最低?？偡雍砍氏仍龊蠼档内厔?shì)，梅鹿輒和赤霞珠總酚含量分別于H2和H1時(shí)期達(dá)到最高。

表2 延遲采收對(duì)赤霞珠果實(shí)基本理化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of delayed harvest on general composition of Cabernet Sauvignon

2.2 延遲采收對(duì)果皮類(lèi)黃酮物質(zhì)的影響

2.2.1 延遲采收對(duì)果皮花色苷組分的影響

表3 延遲采收對(duì)梅鹿輒果實(shí)花色苷的影響Table 3 Effects of delayed harvest on anthocyanin contents of Merlot mg/kg

釀酒葡萄的花色苷組分HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3、4，延遲采收對(duì)葡萄果皮花色苷物質(zhì)的種類(lèi)和含量有顯著影響。梅鹿輒葡萄果皮花色苷組分的種類(lèi)隨著采收期的推遲而減少，分別檢測(cè)出19、18、17和15 種花色苷物質(zhì)。延遲采收的樣品中均未檢測(cè)到順式-二甲花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷；H3時(shí)期花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷、反式-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-(6-O-咖啡酰)-葡萄糖苷均未能檢測(cè)出。延遲采收后梅鹿輒花色苷組分含量減少，含量對(duì)照（16 267.16 mg/kg）＞H2（15 320.81 mg/kg）＞H1（14 878.61 mg/kg）＞H3（9 653.80 mg/kg）。赤霞珠果皮花色苷組分種類(lèi)隨著采收期的推遲呈增加趨勢(shì)，分別檢測(cè)出14、14、15、15 種花色苷。H2和H3時(shí)期均檢測(cè)到反式-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷。赤霞珠花色苷組分含量隨著采收期的延遲而增加，赤霞珠含量H2（13 237.13 mg/kg）＞H3（13 234.30 mg/kg）＞H1（11 322.20 mg/kg）＞對(duì)照（10 823.77 mg/kg）。

表4 延遲采收對(duì)赤霞珠果實(shí)花色苷的影響Table 4 Effects of delayed harvest on anthocyanin contents of Cabernet Sauvignon mg/kg

隨著采收期的延遲，梅鹿輒葡萄果皮中花翠素類(lèi)和二甲花翠素類(lèi)花色苷含量越來(lái)越少，赤霞珠果皮中含量越來(lái)越多。由于花色苷β環(huán)上的羥基數(shù)目越多，其藍(lán)色色調(diào)越深；甲基化數(shù)目越多，紅色越深。因此，隨著采收期的延遲，梅鹿輒葡萄果皮顏色越來(lái)越淺，赤霞珠果皮顏色越來(lái)越深。在赤霞珠和梅鹿輒葡萄果皮花色苷中，含量最多的為非?；ㄉ眨蓟ㄉ湛偤康?0%左右；其次為乙酰化花色苷，占總含量的21%～32%，香豆?；ㄉ照伎偤康?%～16%；只有微量咖啡酰化花色苷。非酰化的基本花色苷是所有花色苷中含量最高的組分，延遲采收后，梅鹿輒非?；ㄉ蘸肯陆?，而赤霞珠非酰化花色苷含量隨著采收期的延遲呈上升趨勢(shì)，在H3時(shí)期達(dá)到最大值8 296.59 mg/kg。?；ㄉ赵诳偦ㄉ蘸恐斜壤脑黾佑欣谔岣呋ㄉ盏姆€(wěn)定性。梅鹿輒延遲采收后，?；ㄉ蘸肯陆?。而赤霞珠乙酰化花色苷含量隨采收期的延遲呈先增后減的趨勢(shì)，其含量H2＞H3＞H1＞對(duì)照；H2與H3時(shí)期赤霞珠香豆?；ㄉ蘸匡@著增加，H1時(shí)期咖啡酰化花色苷含量較高。

從上述分析中可以看出，對(duì)于成熟期較早品種梅鹿輒，果實(shí)花色苷穩(wěn)定性隨著采收期的延遲降低；而對(duì)于晚熟品種赤霞珠，果實(shí)花色苷穩(wěn)定性隨著采收期的延遲提高。

2.2.2 延遲采收對(duì)果皮非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)的影響

從表5、6可以看出，延遲采收對(duì)葡萄果皮非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量有一定的影響。不同采收期的梅鹿輒葡萄共檢測(cè)出21 種非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)，而赤霞珠葡萄中只檢測(cè)出19 種。檢測(cè)出的非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)主要包括黃烷醇類(lèi)和黃酮醇類(lèi)，不同采收期的非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)總量差異顯著。

黃烷醇類(lèi)：延遲采收各時(shí)期梅鹿輒葡萄果皮中均檢測(cè)出6 種黃烷醇，分別為原花色素B1、原花色素B2、原花色素C1、兒茶素、沒(méi)食子酸兒茶素和表沒(méi)食子酸兒茶素。其中，原花色素B1含量最高，占總黃烷醇含量的80%左右。延遲采收不同時(shí)期梅鹿輒果皮中黃烷醇含量H1（69.29 mg/kg）＞CK（41.00 mg/kg）＞ H3（51.22 mg/kg）＞H2（35.33 mg/kg）。不同采收期的赤霞珠葡萄果皮中，只檢測(cè)到4 種黃烷醇，其中未檢測(cè)到原花色素B2和原花色素C1，含量最高黃烷醇類(lèi)物質(zhì)為原花色素B1，占總黃烷醇含量的65%左右。2 個(gè)品種的黃烷醇含量占非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)總量比例均較低，其中梅鹿輒為5%～9%，赤霞珠僅為2.6%～4%。

黃酮醇類(lèi)：延遲采收不同時(shí)期梅鹿輒和赤霞珠葡萄果皮中均檢測(cè)到15 種黃酮醇，且2 個(gè)品種葡萄果皮中黃酮醇含量占非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)總量的比例很高，達(dá)91%以上。不同采收時(shí)期黃酮醇含量差異顯著，梅鹿輒葡萄果皮黃酮醇含量為H1（732.49 mg/kg）＞對(duì)照（720.48 mg/kg）＞H3（688.23 mg/kg）＞H2（668.08 mg/kg)。赤霞珠果皮黃酮醇含量隨著采收期的延遲呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其含量為H3（629.83 mg/kg）＞H2（390.13 mg/kg）＞對(duì)照（349.12 mg/kg）＞H1（338.28 mg/kg）。在赤霞珠和梅鹿輒葡萄果皮中，槲皮素類(lèi)為含量在最高的黃酮醇物質(zhì)，占黃酮醇總量的49%以上。

表5 延遲采收對(duì)梅鹿輒果實(shí)非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)的影響Table 5 Effects of delayed harvest on contents of non-anthocyanins phenolic compounds in Merlot mg/kg

表6 延遲采收對(duì)赤霞珠果實(shí)非花色苷酚類(lèi)物質(zhì)的影響Table 6 Effects of delayed harvest on contents of non-anthocyanins phenolic compounds in Cabernet Sauvignon mg/kg

2.3 主成分分析

對(duì)不同采收期的葡萄果實(shí)基本理化指標(biāo)與類(lèi)黃酮物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢钥闯雒仿馆mPC1解釋了總變量的46.86%，PC2解釋了總變量的23.97%；赤霞珠PC1解釋了總變量的62.10%，PC2解釋了總變量的22.35%。

梅鹿輒基本理化指標(biāo)與酚類(lèi)物質(zhì)的主成分結(jié)果見(jiàn)圖2A、B，可以看出花色苷與黃酮醇類(lèi)物質(zhì)主要集中在PC1正端，黃烷醇類(lèi)物質(zhì)主要集中在PC2正端。在得分圖中，CK位于PC1正端，CK與H3在PC1上差異較大，與H1在PC1上差異較小，PC2能將H2與其他時(shí)期很好的區(qū)分開(kāi)。說(shuō)明隨著采收期的延遲，與正常成熟期相比在與PC1相關(guān)的花色苷和黃酮醇類(lèi)物質(zhì)間差異越大。

對(duì)照赤霞珠載荷圖（圖2C），可以看出在赤霞珠中PC1主要與除二甲花翠素-3-O-(6-O-咖啡酰)-葡萄糖苷、花青素-3-O-(6-O-乙酰)-葡萄糖苷和楊梅酮之外的其他單體酚類(lèi)物質(zhì)呈良好的正相關(guān)。在得分圖中可以看出（圖2 CS-b），PC1能將CK與H3很好的區(qū)分開(kāi)，H2與其他時(shí)期在PC2上差異較大，說(shuō)明CK與H3在與PC1相關(guān)的物質(zhì)上差異較大，隨著采收期的延遲，與正常采收期果實(shí)花色苷的差異越大。

此外，從載荷圖中可以看出不同物質(zhì)間的相互關(guān)系，圖中距離較近的物質(zhì)間有較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，而距離較遠(yuǎn)的物質(zhì)間則呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。圖中可溶性固形物與可滴定酸分別位于PC1兩端，可以看出可溶性固形物與可滴定酸呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖2 不同采收期與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)物質(zhì)的PCAFig. 2 PCA of substances related to grape quality at different harvest stages

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，葡萄果實(shí)延遲采收后的外觀特性和生理指標(biāo)變化顯著。例如，葡萄果實(shí)失水皺縮，質(zhì)量減少、有機(jī)酸含量明顯下降和含糖量增加[29-31]，造成這些變化的原因可能與蒸騰作用和韌皮部的變化有關(guān)[32-33]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著采收期的延遲，葡萄果實(shí)的粒質(zhì)量、粒徑均降低，葡萄果實(shí)中的可滴定酸含量顯著降低、還原糖含量顯著提升，這些結(jié)果與前人研究一致。

本研究中，釀酒葡萄延遲采收后，由于品種差異性和氣候條件等因素，類(lèi)黃酮物質(zhì)的變化趨勢(shì)與他人的研究結(jié)果略有不同。梅鹿輒延遲采收后花色苷含量變化呈下降趨勢(shì)，與王宇等[34]研究結(jié)果相反，結(jié)合氣象數(shù)據(jù)分析，可能與周期內(nèi)降雨量較大有關(guān)；赤霞珠延遲采收后花色苷含量變化呈上升趨勢(shì)，與溫鵬飛等[35]研究結(jié)果一致。延遲采收后，梅鹿輒?；ㄉ蘸砍掷m(xù)降低，赤霞珠?；ㄉ蘸吭谘舆t1～2周時(shí)，呈上升趨勢(shì)，而在3 周后呈下降趨勢(shì)。梅鹿輒延遲1 周黃烷醇與黃酮醇增加，2～3 周后均降低；赤霞珠延遲采收后黃烷醇含量持續(xù)增加，而黃酮醇含量先降低后增加。研究結(jié)果表明，采收期氣溫變化對(duì)類(lèi)黃酮物質(zhì)含量的影響較大，葡萄果實(shí)成熟階段的低溫環(huán)境會(huì)增加花色苷的積累，而高溫會(huì)降低葡萄表皮中類(lèi)黃酮物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，增加花色苷的降解[36-39]。結(jié)合PCA，延遲采收可以提高赤霞珠類(lèi)黃酮物質(zhì)含量，而對(duì)于梅鹿輒，延遲采收不利于類(lèi)黃酮物質(zhì)的積累。