郭楠楠,張 巖,李永波,張 濤,張雅倫,周 巍,*,王 紅,,*
(1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 石家莊 050024;2.河北省食品檢驗研究院,河北省食品安全重點實驗室,河北 石家莊 050071)
植物蛋白飲料目前已成為飲料市場上不可或缺的產(chǎn)品,“天然、綠色、營養(yǎng)、健康”的特征使其越來越受消費者的喜愛,擁有廣闊的消費市場[1]。與此同時,一些不法商家為謀取利益在植物蛋白飲料中摻雜使假、以次充好,欺騙消費者,擾亂市場秩序等質(zhì)量安全問題受到了社會的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的定性檢測方法難以準確甄別摻假程度,因此建立精準的定量分析檢測方法意義重大。
在食品安全檢測領(lǐng)域,應(yīng)用較為廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)和實時熒光PCR技術(shù)等。常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好[2],DNA條形碼技術(shù)成本低、快速可靠[3],均被廣泛用于食品中進行定性檢測;實時熒光PCR技術(shù)不僅可用于定性檢測,還可測定循環(huán)閾值(Ct值)和初始DNA模板濃度進行相對定量[4-5]。但這些技術(shù)卻無法滿足精準定量分析的需求,微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的出現(xiàn)為食品安全檢測帶來了新的方案。ddPCR是準確定量核酸的一門新興核酸擴增技術(shù)[6-7],其利用有限稀釋分析和泊松分布分析來實現(xiàn)靶DNA拷貝數(shù)的絕對定量[8-10],被稱為“第三代PCR”技術(shù)[11]。ddPCR不依賴標準曲線,對稀有事件檢測準確、靈敏,廣泛應(yīng)用于拷貝數(shù)變異檢測分析[12-13]、單核苷酸多態(tài)性分析[14]、產(chǎn)前診斷[15-17]、轉(zhuǎn)基因食品檢測[18-20]和微生物檢測[21-23]等。
ddPCR技術(shù)的興起為解決食品的摻雜使假問題提供了思路,目前,ddPCR技術(shù)在肉源性食品真?zhèn)舞b別領(lǐng)域研究較多,而在植物源性食品真?zhèn)舞b別領(lǐng)域應(yīng)用較少。在肉類摻假研究中,王珊等[24]建立了羊肉制品中羊肉和豬肉的定量檢測方法,完成了ddPCR技術(shù)和熒光PCR技術(shù)的比較;Cai Yicun[25]、苗麗[26-27]、陳晨[28]等分別研究豬肉和雞肉產(chǎn)品、肉及肉制品中豬牛源和羊源成分、羊肉和豬肉制品的定量分析方法。在植物源性食品真?zhèn)舞b別中,楊碩等[1]采用多重ddPCR技術(shù),通過單位質(zhì)量下靶基因拷貝數(shù)之比換算植物源性成分投料比,完成了核桃露中核桃、大豆成分的定量檢測研究。
本研究在前人的基礎(chǔ)上探索植物及植物蛋白飲料(杏仁露)中杏仁和花生的定量檢測方法,基于ddPCR技術(shù)建立兩物種質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的計算公式,進行特異性、人為摻假樣品和市售樣品的檢驗,確定該方法的準確性和適用性,達到定量分析和甄別摻假的目的。
杏仁、花生購自石家莊大型超市;10 個品牌12 個批次的杏仁露購自石家莊大型超市和農(nóng)貿(mào)市場。
深加工食品DNA提取試劑盒(非離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司;氯仿 北京酷來博科技有限公司;異丙醇、無水乙醇(均為分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;分析研磨機 德國IKA公司;AdVantage Pro真空冷凍干燥機 美國VirTis公司;Milli-Q Integral 3純水/超純水一體化系統(tǒng) 美國Millipore公司;SHA-AD恒溫振蕩器 金壇市華城敏科實驗儀器廠;1-15PK冷凍離心機 德國Sigma公司;NanoDrop 2000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司;QX200 ddPCR微滴生成儀、微滴讀取儀、S1000 thermal cycler基因擴增儀 美國Bio-Rad公司。
1.3.1 樣品制備
杏仁、花生:用分析研磨機進行初步研磨于超低溫真空冷凍干燥機中凍干,用液氮進行破碎處理研磨成超細的粉末,此樣品用作本研究的模板樣品及摻假模型的制備。
市售杏仁露:分裝于玻璃容器內(nèi)于超低溫真空冷凍干燥機中凍干,用液氮進行破碎處理研磨成超細的粉末,此樣品用于實際檢測分析。
樣品制備過程中注意防止交叉污染。
1.3.2 DNA提取
梯度稱取10~100 mg杏仁、花生的模板樣品,采用優(yōu)化的深加工食品DNA提取試劑盒法進行DNA的提取:1)取梯度稱取的模板樣品至滅菌離心管中,加入500 μL的緩沖液GMO1和20 μL的Proteinase K(20 mg/mL),振蕩混勻;2)56 ℃孵育1 h,其間每隔15 min上下顛倒混勻一次;3)加入200 μL緩沖液GMO2和400 μL氯仿,振蕩混勻,靜置10 min;4)12 000 r/min離心5 min,小心吸取上清液;5)向上清液中加入0.7 倍體積的異丙醇,充分混勻后12 000 r/min離心3 min,小心棄上清液;6)加入700 μL 70%的乙醇溶液,渦旋振蕩5 s,12 000 r/min離心2 min,棄上清液;7)重復(fù)6);8)于室溫開蓋放置,晾干殘留的乙醇;9)加入50 μL洗脫緩沖液TE,吹吸混勻,即可得到基因組DNA溶液,儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 特異性引物和探針
根據(jù)GenBank中公布的杏仁過敏源性成分Pru du1基因序列,通過軟件Primer 5.0和PRIMER設(shè)計杏仁源性的特異性引物和探針序列Almond1~5;花生源性和真核生物18S rRNA內(nèi)參照基因的引物和探針序列參考國家出入境檢驗檢疫行業(yè)標準[29-30]。本實驗所用引物和探針(表1)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probes used in this study
1.3.4 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)程序
20 μL反應(yīng)體系:ddPCRTMSupermix for Probes(no dUTP)10 μL,上下游引物各1.2 μL(900 nmol/L),探針0.4 μL(250 nmol/L),DNA模板4 μL,剩余用ddH2O補足。用微滴發(fā)生器生成微滴,進行普通PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃、10 min;94 ℃、30 s,60 ℃、1 min,40 個循環(huán);98 ℃ 10 min。最后用微滴分析器分析擴增產(chǎn)物。發(fā)生微滴過程中注意避免產(chǎn)生氣泡。
1.3.5 特異性分析
基于實時熒光PCR和數(shù)字PCR技術(shù)對特異性設(shè)計序列進行初步篩選,將初篩所得引物以無菌雙蒸水作為空白對照,分別選用植物源性物種杏仁、花生、核桃、大豆、榛果、芝麻、腰果、開心果、松子、葵花籽的DNA為模板進行數(shù)字PCR檢測,驗證引物的特異性。
1.3.6 杏仁和花生質(zhì)量與拷貝數(shù)計算公式的確定
1.3.6.1 兩物種質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系
分別準確稱取10 個質(zhì)量梯度的杏仁和花生(質(zhì)量依次從10~100 mg)樣品,提取植物基因組DNA,用NanoDrop 2000測定所提DNA的濃度。每個梯度實驗進行3 次重復(fù)。相關(guān)系數(shù)R2用Origin 9分析生成。
1.3.6.2 兩物種DNA含量與DNA拷貝數(shù)的關(guān)系
為摸索DNA含量與拷貝數(shù)的線性關(guān)系,將提取好的杏仁和花生DNA進行梯度稀釋,分別稀釋為5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ng/μL,以ddH2O為空白對照,取4 μL DNA進行ddPCR檢測。每個梯度實驗進行3 次重復(fù)。相關(guān)系數(shù)R2用Origin 9分析生成。
1.3.7 方法驗證實驗
為驗證所建立的ddPCR方法的準確性,在80 mg的質(zhì)量范圍內(nèi)建立杏仁和花生已知混合比例的摻假模型(杏仁和花生的最低質(zhì)量分數(shù)均為6.25%),按1.3.2節(jié)的方法提取各混合樣品的DNA,將提取的DNA進行30 倍稀釋,取4 μL進行ddPCR檢測,進行3 次重復(fù)。
1.3.8 檢測方法的實際應(yīng)用
10 個不同品牌12 個批次的杏仁露,按1.3.1節(jié)的方法進行前處理,按1.3.2節(jié)的方法提取DNA,用建立的ddPCR定量分析方法對杏仁露中杏仁和花生源性成分的質(zhì)量進行檢測分析,進行3 次重復(fù),進一步驗證本研究所建方法的準確性和實際適用性。
采用Origin 9對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析和圖表繪制。
用真核生物18S rRNA通用引物分別對杏仁、花生模板樣品和12 個市售樣品的DNA進行普通PCR擴增,并進行2%瓊脂糖凝膠電泳。如圖1所示,空白對照、陰性對照均未出現(xiàn)擴增條帶,杏仁、花生和樣品DNA均出現(xiàn)大小140 bp左右的目的條帶,證明DNA提取成功,適宜進行后續(xù)PCR擴增反應(yīng)。
圖1 植物源性成分通用引物PCR結(jié)果Fig. 1 PCR results obtained with the 18S rRNA primers and probe
基于實時熒光PCR技術(shù)對杏仁引物進行初步篩選,結(jié)果顯示引物Almond1、2 對杏仁模板DNA均有明顯擴增曲線;將這2 對引物以杏仁DNA為模板進行ddPCR檢測分析,結(jié)果顯示引物Almond1能更好地區(qū)分陰、陽性微滴,初步確定Almond1為杏仁的特異性引物。在此基礎(chǔ)上,選擇多種常見植物物種作為DNA模板對杏仁、花生引物進行進一步的特異性檢測分析,ddPCR結(jié)果(圖2、3)顯示本研究選用的杏仁和花生的引物和探針特異性良好,與其他植物物種均無交叉反應(yīng),適用于杏仁和花生的定量檢測。
圖2 杏仁引物和探針的特異性檢測Fig. 2 Specificity evaluation of apricot kernel primer-probe system
圖3 花生引物和探針的特異性檢測Fig. 3 Specificity evaluation of peanut primer-probe system
為考察杏仁、花生質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系,各提取10 個質(zhì)量梯度(10~100 mg)杏仁和花生的DNA,測得DNA含量。每個梯度各重復(fù)測得DNA含量的變異系數(shù)最大為4.13%,差異較小。取3 次重復(fù)實驗的平均值進行線性擬合,結(jié)果顯示杏仁在10~100 mg的質(zhì)量范圍內(nèi)與DNA含量呈明顯的線性關(guān)系,花生在10~80 mg的質(zhì)量范圍內(nèi)與DNA含量呈明顯線性關(guān)系(圖4)。兩物種的質(zhì)量與其DNA含量呈明顯線性關(guān)系,杏仁和花生的相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.997和0.994。
圖4 杏仁(A)和花生(B)質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系Fig. 4 Linear relationship between plant quantity and nucleic acid contents of apricot kernel (A) and peanut (B)
將提取的杏仁、花生DNA分別進行梯度稀釋,取4?μL稀釋后的DNA進行ddPCR檢測,每個梯度實驗進行3 次重復(fù),擴增結(jié)果如圖5所示。每個梯度各重復(fù)所得DNA拷貝數(shù)的變異系數(shù)最大為4.72%,差異較小。取DNA拷貝數(shù)的平均值進行線性擬合,結(jié)果顯示杏仁稀釋質(zhì)量濃度在5~50 ng/μL范圍內(nèi)、花生稀釋質(zhì)量濃度在5~100 ng/μL范圍內(nèi),隨著DNA含量的增加,DNA拷貝數(shù)相應(yīng)增加,兩者呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系(圖6),杏仁和花生線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.997和0.999。
圖5 梯度DNA含量條件下的杏仁(A)和花生(B)拷貝數(shù)Fig. 5 DNA copy numbers of apricot kernel (A) and peanut (B) at different nucleic acid contents
圖6 杏仁(A)和花生(B)DNA含量與DNA拷貝數(shù)的關(guān)系Fig. 6 Linear relationship between nucleic acid content and DNA copy number of apricot kernel (A) and peanut (B)
根據(jù)杏仁、花生質(zhì)量和DNA含量、DNA含量和DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系,分別以DNA含量為中間換算值,計算得出兩物種質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)之間的公式,M杏仁=0.13C+1.24,M花生=0.081C-0.63,其中,M為植物源性成分的質(zhì)量(mg),C為DNA拷貝數(shù)(copies/μL)。
分別提取已知比例混合樣品的基因組DNA,30 倍稀釋后,取4 μL進行ddPCR檢測,進行3 次重復(fù)測定,分析各重復(fù)間變異系數(shù),將測得的拷貝數(shù)取平均值代入本研究建立的計算公式中得到測得杏仁和花生的質(zhì)量。結(jié)果顯示,各重復(fù)間變異系數(shù)均小于15%,混合樣品中杏仁、花生的測得值與實際值基本一致,最大相對誤差為-12.86%(表2),在統(tǒng)計學(xué)許可范圍內(nèi)。通過對已知摻假模型的檢測,驗證本研究所建立的ddPCR精準定量方法的準確性,表明該方法可有效應(yīng)用于對市售杏仁露樣品的檢測。
表2 已知比例摻假模型分析結(jié)果Table 2 Results of quantification of known samples
利用本研究建立的ddPCR方法,對12 個市售杏仁露中的杏仁和花生源性成分進行檢測分析,取3 次重復(fù)實驗平均值進行計算,各重復(fù)間差異較小,變異系數(shù)均小于15%。如表3所示,實驗測得杏仁露2的杏仁含量最高(90.93%),杏仁露3中未測得杏仁源性,杏仁露10、11中測得杏仁含量極少,杏仁露1、9中測得微量的花生,杏仁露12中測得杏仁含量較少(5.22%)而花生含量較多(47.61%)。這一系列的檢測結(jié)果表明市售杏仁露中存在不同程度的摻假現(xiàn)象。
表3 市售樣品檢測結(jié)果Table 3 Detection of commercial samples
本研究采用ddPCR技術(shù)探索杏仁露中杏仁和花生的定量檢測方法,通過建立質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系,換算出杏仁、花生質(zhì)量與DNA拷貝數(shù)的計算公式,建立了可靠的定量分析方法。
本研究中將杏仁、花生原料和市售杏仁露進行凍干處理并研磨成粉,采用優(yōu)化的深加工食品DNA提取試劑盒法提取DNA,提高了提取效率,且多次重復(fù)實驗結(jié)果中杏仁、花生的質(zhì)量與DNA含量均呈明顯線性關(guān)系。該提取方法將原料與產(chǎn)品的提取方法一致化,保證了本研究所建立計算公式的適用性。
基于ddPCR技術(shù)建立了杏仁、花生的計算公式,通過已知比例摻假模型驗證了該方法體系的準確性。在摻假模型中,混合樣品的總質(zhì)量為80 mg,杏仁和花生的最低摻入量均為5 mg(6.25%),混合樣品中杏仁、花生的實驗測得含量與其真實含量相差不大,其中人為摻入量越小相對誤差值越大,最大誤差為-12.86%。表明該方法能對杏仁、花生源性進行準確定量,可有效應(yīng)用于市售杏仁露的定量檢測。
對市售的10 個品牌12 個批次的杏仁露樣品進行檢測分析,其中,杏仁露2測得杏仁質(zhì)量分數(shù)最高,占90.93%;杏仁露3中杏仁質(zhì)量分數(shù)最低,為0%且并未測得花生源性,判斷該樣品可能摻假其他物種;杏仁露9測得杏仁質(zhì)量分數(shù)不到10%;杏仁露10和11的杏仁質(zhì)量分數(shù)極少,占2%左右;杏仁露12中測得杏仁質(zhì)量分數(shù)為5.22%但花生質(zhì)量分數(shù)為47.61%,可判斷其為惡意摻假;杏仁露1和9中測得花生含量近乎為零,而實時熒光PCR檢測1、9的結(jié)果均為檢出花生源性成分,判斷可能是生產(chǎn)過程中的無意帶入而非惡意摻雜。檢測結(jié)果表明市售杏仁露中存在摻假現(xiàn)象,且摻假程度不一,本研究建立的定量分析方法可準確區(qū)分惡意摻假與無意摻雜,適宜推廣應(yīng)用。
ddPCR的每個反應(yīng)中,總微滴數(shù)均大于13 000,檢測有效,確保了本研究中定量方法的準確性。
本研究中定量方法的建立、驗證和實際應(yīng)用中各重復(fù)實驗之間差異較小,變異系數(shù)均小于15%,在統(tǒng)計學(xué)許可范圍內(nèi)。
本研究建立的ddPCR定量檢測體系準確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好,可有效甄別市售杏仁露中的無意摻雜和惡意假冒偽劣問題,適合用于常規(guī)的量化檢測分析。該方法實現(xiàn)的精準定量檢測,可有效保護植物源性成分過敏人群,打擊制假摻假的不法商家,保護消費者權(quán)益,為植物蛋白飲料的市場監(jiān)管提供了新思路。
與此同時,該方法也可應(yīng)用于其他植物及植物蛋白飲料的定量檢測,并有望實現(xiàn)多種植物源性成分的同時定量,建立更健全的定量檢測體系,監(jiān)控植物蛋白飲料的摻假問題,維持市場秩序,為市場監(jiān)管提供技術(shù)保障。