田 勇，郅 琦，李福香，李富華,2，趙吉春,2，曾凱芳,2，明 建,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）屬于菊科（Compositae）金雞菊屬（Coreopsis），是一種廣泛分布于世界各地的小型、無毛、芳香類一年生草本植物[1]。在中國，因其生長在新疆南部海拔3 000 m以上的喀喇昆侖山脈常年積雪高山區(qū)域而被當?shù)厝朔Q為“昆侖雪菊”或“昆侖雪茶”。它的干燥花蕾被稱為昆侖胎菊（C. tinctoria buds），不僅用作花茶類飲料，還用作維傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中治療高血壓和高脂血癥的民間藥物[2-3]。植物化學(xué)研究表明，雪菊含有多種生物活性物質(zhì)，包括黃酮類、酚類、苯丙素類、聚乙炔糖苷和甾醇等，其中黃酮類化合物含量最為豐富，是其主要的功能活性成分[2,4-5]。目前，國內(nèi)外研究者們對雪菊黃酮類化合物的提取條件和工藝進行了部分研究，初步判斷出其主要黃酮類物質(zhì)包括總黃酮、水溶性黃酮、原花青素等[6-8]。昆侖胎菊在日常生活中主要作為花茶沖泡飲用，所以其水溶性黃酮的提取及功能活性研究更加值得關(guān)注。

沙愛龍等[9]研究發(fā)現(xiàn)雪菊黃酮可顯著減緩動物腦和器官的萎縮和退化過程，促進新陳代謝，提高免疫功能，證明其具有抗衰老功能。Zhang Weixin等[10]研究發(fā)現(xiàn)雪菊水提取物顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠體內(nèi)的抗氧化防御功能，從而延緩衰老。以上研究表明，昆侖雪菊黃酮具有良好的抗衰老作用，但對其作用機制研究尚不深入。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性核組蛋白去乙?；?，參與多種生理過程的調(diào)節(jié)，包括衰老、DNA修復(fù)、細胞周期、新陳代謝、應(yīng)激條件下的細胞存活等[11-12]。p53是一種腫瘤抑制因子，可被許多應(yīng)激物激活，誘導(dǎo)細胞凋亡、細胞周期停滯或衰老，在衰老過程中也起著重要作用[13-14]。研究表明，SIRT1的激活對衰老調(diào)節(jié)因子p53有明顯的抑制作用，從而減少細胞凋亡，延緩衰老[15-16]。

本實驗以干燥昆侖胎菊為原料，利用水浸提其水溶性黃酮，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化浸提工藝。同時，通過D-半乳糖致衰老小鼠模型，探討優(yōu)化工藝提取條件下制備的昆侖胎菊水溶性黃酮（C. tinctoria buds water soluble flavonoids，CBF）對衰老小鼠肝組織SIRT1、p53表達的影響，以期為深入研究昆侖胎菊的營養(yǎng)價值及保健功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動物

昆侖胎菊由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院提供，并經(jīng)主任醫(yī)師趙生俊鑒定。

蘆丁標準品（色譜級）、D-半乳糖（分析純）美國Sigma-Aldrich公司；SIRT1抗體、p53抗體 美國Proteintech公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒、抗兔二抗武漢賽維爾生物科技有限公司；乙醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3均為國產(chǎn)分析純。

60 只SPF級昆明小鼠（雌雄各半，（20±2）g）購于重慶市中藥研究院，動物生產(chǎn)許可證為SCXK（渝）2017-003。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；VIS-722紫外-可見分光光度計 上海精科科學(xué)儀器有限公司；FA1004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DF8517超低溫冷凍儲存箱（-80 ℃） 韓國Ilshin公司；RM2016病理切片機 上海徠卡儀器有限公司；HI1220烤片機 德國LEICA公司；DYCZ-24DN雙垂直電泳儀 北京六一儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮提取量的測定

參照吳瑛等[17]的方法進行。以蘆丁制作標準曲線：稱取蘆丁標準品11.2 mg，置于50 mL容量瓶中，加適量體積分數(shù)60%乙醇溶液，水浴加熱使之溶解，并定容至刻度，即得到0.224 mg/mL的對照品溶液。移取對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至6 mL。加入1 mL的50 g/L NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；加入1 mL的100 g/L Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6 min；加入10 mL的40 g/L NaOH試液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后靜置15 min。以不加樣品溶液為空白對照，于波長510 nm處測定各標準溶液吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標，蘆丁對照溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為Y=0.012 6X-0.006 1（R2=0.999 6）。在蘆丁質(zhì)量濃度0～53.76 μg/mL范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

總黃酮提取量的測定：移取1 mL適當稀釋倍數(shù)的樣品溶液，加蒸餾水至6 mL，以不加樣品溶液為空白，按蘆丁標準曲線制作步驟處理后，在波長510 nm處測得吸光度，帶入標準曲線回歸方程，并按下式計算昆侖胎菊水提取液中總黃酮提取量：

式中：C1為根據(jù)標準回歸方程計算的黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；N1為稀釋倍數(shù)；V1為樣品溶液總體積/mL；m1為樣品質(zhì)量（干基）/g。

1.3.2 CBF提取的單因素試驗

采用水溶劑提取法提取昆侖胎菊中水溶性黃酮類化合物，稱取3 g昆侖胎菊（干質(zhì)量），固定其他條件，分別考察水提時間（2、5、8、11、14、17 min）、水提溫度（75、80、85、90、95、100 ℃）、液料比（50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1（mL/g））3 個因素對昆侖胎菊總黃酮提取量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以水提時間、水提溫度、液料比為自變量，提取液中總黃酮提取量為響應(yīng)值，進行3因素3水平的響應(yīng)面分析，優(yōu)化CBF提取條件。各因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗自變量因素與水平Table 1 Independent variable and levels used in response surface analysis

1.3.4 CBF的高效液相色譜分析

1.3.4.1 色譜條件

參照Liang Qian等[18]的方法，稍作修改。采用BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為乙腈、B為體積分數(shù)0.1%甲酸溶液；流速0.7 mL/min；進樣量10 μL；柱溫40 ℃；LC-20A二極管陣列檢測器；色譜數(shù)據(jù)在200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，檢測波長280 nm。梯度洗脫程序如表2所示。

表2 高效液相色譜洗脫條件Table 2 Elution conditions for HPLC

1.3.4.2 標準品溶液制備

準確稱取綠原酸、黃諾馬苷、兒茶素、花旗松素和馬里苷標準品各5.0 mg，用色譜甲醇溶解并分別定容于5 mL棕色容量瓶中，配制成1 mg/mL標準儲備液，并稀釋成不同質(zhì)量濃度溶液（0、10、40、70、100、200、400 μg/mL），經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，備用。按照上述的色譜條件制作標準曲線。以標準品液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），以峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，分別得到回歸方程：y綠原酸=24 279x-99 047，R2=0.999 1；y黃諾馬苷=17 868x-72 736，R2=0.999 2；y兒茶素=16 162x-53 422，R2=0.999 3；y花旗松素=29 328x-75 521，R2=0.999 5；y馬里苷=10 549x-18 026，R2=0.999 5；在0～400 μg/mL線性關(guān)系良好。結(jié)果以干質(zhì)量表示（mg/g）。

1.3.5 動物分組與給藥

用于動物模型給藥處理的CBF濃縮制備：稱取10 g干燥昆侖胎菊，按照響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝條件提取3 次，每次提取液過濾后合并濾液。在減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，真空冷凍干燥成棕褐色粉末。按照1.3.1節(jié)方法測定其總黃酮含量占（35.27±1.81）%。用藥處理時用滅菌生理鹽水溶解稀釋到相應(yīng)的黃酮濃度。參考Zhang Weixin等[10]的方法建立衰老小鼠模型，小鼠隨機分為5 組，每組12 只，除正常對照組外，其余4 組每日頸背部皮下注射D-半乳糖（無菌生理鹽水溶解，300 mg/（kg·d）），連續(xù)造模45 d。每日D-半乳糖造模后，每組分別進行給藥灌胃處理，小鼠分組及給藥情況如表3所示。小鼠體質(zhì)量每隔7 d稱量一次。

表3 各組小鼠的基本給藥情況Table 3 Animal grouping and administration protocol

1.3.6 小鼠一般行為學(xué)的觀察及肝組織樣品的制備

造模給藥期間每天觀察并記錄各組小鼠的一般行為學(xué)變化，包括進食、皮膚、毛色、活動和精神等情況。小鼠造模45 d后，禁食不禁水24 h，頸椎脫臼處死，迅速摘取小鼠肝臟組織，用預(yù)凍4 ℃滅菌生理鹽水分別洗凈淤血。將肝組織分為2 份，一份固定在福爾馬林中，用于制備石蠟切片（4 μm）；另一份液氮凍存于-80 ℃冰箱，用于測定衰老相關(guān)蛋白表達。

1.3.7 肝組織切片的制作及病理學(xué)形態(tài)觀測

新鮮肝組織→放入10%福爾馬林試劑固定24 h→分別經(jīng)體積分數(shù)為75%、85%、90%、95%乙醇溶液脫水處理4、2、2、1 h→無水乙醇I 30 min→無水乙醇II 30 min→醇苯5～10 min→二甲苯I 5～10 min→二甲苯II 5～10 min→石蠟包埋組織塊→石蠟切片機切片厚4 μm→烤片→石蠟切片脫蠟復(fù)水→蘇木素染液染3～5 min→分化液分化→返藍液返藍→流水沖洗→切片依次入體積分數(shù)85%、95%的梯度乙醇脫水各5 min→入伊紅染液中染色5 min→切片依次放入無水乙醇I、II、III和二甲苯I、II各5 min→中性樹膠封片→顯微鏡鏡檢（×200），圖像采集分析[19]。

1.3.8 肝組織中SIRT1、p53蛋白表達水平

采用Western blot法測定。稱取適量肝組織，加入蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，徹底勻漿，離心，提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加熱使之變性，每個蛋白樣品等量（30 μg）進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉1 h后，加入稀釋一抗（SIRT1、p53）4 ℃孵育過夜，TBST洗3 次，加二抗（TBST稀釋3 000 倍）室溫下孵育30 min，TBST洗3 次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影曝光，掃描記錄，采用alphaEaseFC軟件測定條帶灰度值[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 水提時間對總黃酮提取量的影響

圖1 水提時間對總黃酮提取量的影響Fig. 1 Effect of extraction time on the yield of flavonoids from C. tinctoria buds

由圖1可知，在水提時間2～17 min的范圍內(nèi)，隨著時間的延長，昆侖胎菊總黃酮的提取量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。但考慮到日常生活中昆侖胎菊用于茶飲的水提時間一般不會超過15 min，故選擇水提時間14 min較佳。

2.1.2 水提溫度對總黃酮提取量的影響

圖2 水提溫度對總黃酮提取量的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids from C. tinctoria buds

由圖2可知，在水提溫度75～100 ℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，昆侖胎菊總黃酮的提取量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，當溫度達到95 ℃以上，總黃酮提取量的增加不明顯。因此選擇水提溫度95 ℃較為合適。

2.1.3 液料比對總黃酮提取量的影響

圖3 液料比對總黃酮提取量的影響Fig. 3 Effect of water-to-material ratio on the yield of flavonoids from C. tinctoria buds

由圖3可知，在液料比為50∶1～100∶1的范圍內(nèi)，隨著液料比的增加，昆侖胎菊總黃酮的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當液料比為70∶1（mL/g）時，總黃酮提取量達到最高值。因此最合適的液料比為70∶1。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，以考察各因素間的交互作用以及優(yōu)化最佳提取工藝，結(jié)果見表4。對表4的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到總黃酮提取量對水提時間（A）、水提溫度（B）和液料比（C）的二次回歸模型方程為：

總黃酮提取量=-2 191.079 28+28.798 36A+36.740 05B+9.382 85C-0.163 97AB-0.010 747AC-0.045 800BC-0.385 66A2-0.160 00B2-0.033 759C2

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

表5 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance (ANOVA) for the yield of flavonoids against various extraction conditions

對此模型進行回歸方差分析，由表5可知，總黃酮提取試驗設(shè)計的整體模型呈現(xiàn)極顯著水平（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明模型選擇合適。回歸模型的一次項、二次項均顯著，交互項AB、BC顯著，AC不顯著。表明各因素對于昆侖胎菊提取過程中總黃酮提取量的影響并不是簡單的線性關(guān)系。由F值可知，各因素對總黃酮提取量影響大小順序為水提時間（A）＞水提溫度（B）＞液料比（C）?；貧w方差分析結(jié)果表明，該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.973 7，模型校正決定系數(shù)R2Adj為0.939 9，表明此模型可以解釋93.99%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的6.01%，不能用此模型來解釋。模型的變異系數(shù)為1.11%，較小，表明試驗結(jié)果重復(fù)性較好。此外，模型的信噪比較高（為16.513），表明此模型的擬合度和可信度較好，可用于預(yù)測和優(yōu)化CBF提取工藝的實驗結(jié)果[21-22]。

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖4 各因素交互作用對總黃酮提取量的影響Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three extraction parameters on the yield of flavonoids from C. tinctoria buds

為了更直觀反映各因素對昆侖胎菊總黃酮提取量的影響以及最佳工藝參數(shù)和參數(shù)間的交互作用，采用響應(yīng)面及其等高線圖分析，如圖4所示。圖4可以直觀地反映出水提時間、水提溫度和液料比3 個因素之間的交互作用對昆侖胎菊水溶性總黃酮提取量的影響。響應(yīng)面陡峭表明該因素對總黃酮提取量的影響較強，曲面平緩表明影響較弱；等高線的形狀可反映出各因素間交互效應(yīng)的強弱，趨于橢圓形表明兩因素的交互作用顯著，而圓形表明不顯著[23-24]。由圖4可知，比較響應(yīng)面的陡峭程度為水提時間（A）＞水提溫度（B）＞液料比（C），表明各因素對總黃酮提取量影響大小順序為水提時間（A）＞水提溫度（B）＞液料比（C），其結(jié)論同表5方差分析結(jié)論一致；比較3 個因素交互作用的等高線：AB橢圓形，AC圓形，BC橢圓形，表明水提時間與水提溫度、水提溫度與液料比交互作用顯著，水提時間與液料比交互作用不顯著，其結(jié)論同表5方差分析結(jié)論一致。

2.2.3 提取工藝條件的優(yōu)化及驗證

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計獲得的結(jié)果和二次回歸方程，利用Design-Expert軟件優(yōu)化分析得到總黃酮的最佳提取條件為：水提時間15.39 min、水提溫度95.89 ℃、液料比71.04∶1（mL/g），在此條件下預(yù)測的總黃酮提取量為143.04 mg/g，結(jié)合實際操作，選取最佳條件的近似值，即水提時間15 min、水提溫度96 ℃、液料比71∶1（mL/g）進行3 次重復(fù)驗證實驗，得到總黃酮提取量為（145.45±4.60）mg/g，與理論預(yù)測值相比，相對誤差僅為1.68%，表明該回歸模型優(yōu)化得到的提取工藝條件實際有效。

2.2.4 CBF的高效液相色譜分析

研究表明，昆侖胎菊的活性成分主要是黃酮類化合物[2-3]。由圖5所示，CBF包含綠原酸（0.94±0.09） mg/g、黃諾馬苷（13.64±0.13）mg/g、兒茶素（2.22±0.11）mg/g、花旗松素（2.11±0.10） mg/g和馬里苷（13.39±0.34）mg/g，表明CBF的主要活性成分由酚酸和黃酮類化合物組成，其中黃酮類化合物種類更多且含量更高。

圖5 標準品（A）與CBF（B）色譜圖Fig. 5 Chromatograms of reference substances of CBF (A) and flavonoid composition of CBF (B)

2.3 CBF對衰老小鼠體質(zhì)量及一般行為學(xué)的影響

圖6 CBF對衰老小鼠體質(zhì)量變化的影響Fig. 6 Effect of CBF on body mass changes of aging mice

D-半乳糖長期注射導(dǎo)致衰老小鼠動物模型是抗衰老理論及藥理學(xué)研究的經(jīng)典方法[25-26]。D-半乳糖造衰老小鼠模型期間，觀測小鼠體質(zhì)量的增長變化情況可反映其生長發(fā)育及健康狀況[27]。由圖6所示，隨著衰老造模期間的延長，各組小鼠體質(zhì)量均有所增加。衰老模型組小鼠體質(zhì)量增長逐漸緩慢，并出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、行動緩慢、皮膚松弛、毛色灰暗粗糙、經(jīng)常脫毛炸毛、經(jīng)常扎堆嗜睡、活動量明顯減少等一般行為學(xué)狀況。從第7天開始，衰老模型組小鼠體質(zhì)量低于正常組，呈顯著性差異（P＜0.05），并且差異隨時間延長呈逐漸增大的趨勢。整個實驗期間，陽性對照組（VE）和高劑量組（CBF-H）小鼠體質(zhì)量與正常組之間無顯著差異（P＞0.05），同時衰老小鼠在精神狀況、行動、皮膚及毛發(fā)等狀態(tài)方面均得到一定改善。這說明CBF對小鼠生長發(fā)育無不良影響且可改善衰老小鼠的行為狀況，具有抗衰老作用[28]。

2.4 CBF對衰老小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)變化的影響

圖7 CBF對衰老小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響（HE染色，×200）Fig. 7 Effect of CBF on liver tissues of aging mice observed by HE staining (× 200)

大量研究表明，許多天然成分的用藥處理能在D-半乳糖誘導(dǎo)的動物衰老模型中發(fā)揮有效的保肝作用[29-30]。如圖7所示，正常組小鼠肝組織顯示出正常的結(jié)構(gòu)和明顯的肝細胞邊界，沒有充血現(xiàn)象。與正常組小鼠相比，衰老模型組小鼠肝組織切片顯示出明顯的損傷，表現(xiàn)出幾種類型的病理損傷，如細胞間隙增大（長箭頭）和氣球樣變性（短箭頭）。此外，肝細胞還觀察到其他損傷，如局灶性壞死，纖維化，淋巴細胞浸潤等。CBF的灌胃給藥有效地改善了D-半乳糖引起的肝臟異常變化。在VE組和低劑CBF-L組中，可觀察到肝臟細微充血，氣球樣變性和纖維化的改善；CBF-H組的改善效果更顯著，小鼠肝臟的組織病理學(xué)形態(tài)與正常組沒有明顯差異。結(jié)果表明，CBF對D-半乳糖引起的衰老小鼠肝損傷有一定抑制作用。

2.5 CBF對衰老小鼠肝臟SIRT1、p53蛋白表達的影響

大量研究表明，SIRT1與p53基因參與衰老過程的調(diào)節(jié)[15-16]。如圖8A所示，衰老模型組小鼠肝組織中SIRT1蛋白表達量顯著低于正常組（P＜0.05），降低了57.75%。與衰老組相比，VE及CBF高低劑量給藥處理均能顯著地提高衰老小鼠肝組織SIRT1蛋白表達（P＜0.05），VE、CBF-L和CBF-H組分別提高了106.99%、160.45%和279.02%。如圖8B所示，衰老模型組小鼠肝組織中p53蛋白表達量顯著高于正常組（P＜0.05），提高了390.13%。與衰老組相比，除CBF-L組降低效果不顯著外，VE及CBF-H能顯著降低衰老小鼠肝組織p53蛋白表達（P＜0.05），VE、CBF-L和CBF-H組分別降低了23.22%、12.25%和30.90%。結(jié)果表明，CBF抑制衰老作用可能與激活SIRT1/p53信號通路有關(guān)。

圖8 CBF對衰老小鼠肝組織中SIRT1、p53蛋白表達的影響Fig. 8 Effect of CBF on protein expression levels of SIRT1 and p53 in liver tissues of aging mice

3 結(jié) 論

本實驗以昆侖胎菊為原料，采用水溶劑提取法對其水溶性總黃酮進行提取并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，即水提時間15 min、水提溫度96 ℃、液料比71∶1（mL/g），在此最優(yōu)條件下進行驗證得到提取液中的總黃酮提取量可達到145.45 mg/g，與理論預(yù)測值的相對誤差僅為1.68%，表明該回歸模型合理可靠，優(yōu)化得到的提取工藝條件實際有效。

本實驗同時研究CBF對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用及其對衰老小鼠肝組織中SIRT1、p53蛋白表達的影響。造模過程觀測各組小鼠體質(zhì)量變化和一般行為學(xué)狀態(tài)表明，CBF對小鼠生長發(fā)育無不良影響且可改善衰老小鼠的行為狀況；各組小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)觀測表明，VE和CBF能顯著改善D-半乳糖引起的肝組織異常變化，特別是CBF-H組小鼠肝組織細胞結(jié)構(gòu)完整，幾乎沒有充血現(xiàn)象，與正常組小鼠肝組織細胞基本一致；Western blot法分析各組小鼠肝組織SIRT1、p53蛋白表達情況表明，CBF能顯著提升衰老小鼠肝組織中SIRT1蛋白表達（P＜0.05），有效抑制D-半乳糖引起的p53過量表達（P＜0.05）。以上結(jié)果說明CBF具有良好的抗衰老作用，其作用機理可能與激活SIRT/p53信號通路有關(guān)。

本實驗以響應(yīng)面法優(yōu)化確定CBF的提取工藝，并初步探討其抗衰老作用機制，為昆侖胎菊實際應(yīng)用及食藥作用的進一步研究提供理論基礎(chǔ)。