雷莎莎 朱紅雨 張國華 徐明波 楊仲璠 姚文兵

（1. 中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009；2. 北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司北京市重組蛋白及其長效制劑工程技術(shù)研究中心，北京 100143）

據(jù)2018年最新國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，乳腺癌位居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位。根據(jù)基因表達(dá)模式不同可將乳腺癌分為四個(gè)亞型：基底細(xì)胞 樣（Basal-like type）、HER2過 表 達(dá) 型（HER2-overexpressing type）、管腔 A 型（Luminal subtype A）、管腔B型（Luminal subtype B）。不同亞型的乳腺癌常伴有不同的臨床特征差異，在復(fù)發(fā)率和總生存期方面也存在差異［1]。其中，約有15%-30%乳腺癌患者表現(xiàn)為HER2陽性［2-3]，而HER2陽性也意味著腫瘤細(xì)胞惡性程度更高、疾病進(jìn)展速度更快、更易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、預(yù)后不佳等臨床表現(xiàn)。因此，HER2陽性乳腺癌也被稱為“最兇險(xiǎn)的乳腺癌”［4]。

1 曲妥珠單抗簡介

曲妥珠單抗為抗乳腺癌藥物赫賽?。℉eceptin）的活性成分，是首個(gè)以人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2，C-ErbB-2）為靶點(diǎn)的人源化單克隆抗體藥物。該單抗分子量為148 kD，可選擇性地作用于HER2的胞外結(jié)構(gòu)域。赫賽汀最早由羅氏研發(fā)，1998年獲得美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)上市，用于HER-2陽性乳腺癌的治療。目前曲妥珠單抗產(chǎn)品已被應(yīng)用于乳腺癌從晚期到輔佐治療以及新輔助治療的各個(gè)階段，能減緩腫瘤發(fā)展速度，明顯延長患者生存期［5]。

目前中國市場(chǎng)上的曲妥珠單抗產(chǎn)品，只有羅氏生產(chǎn)的赫賽汀，其原零售價(jià)格平均為24 500元/支（含量440 mg），而患者一個(gè)治療周期至少需要注射14支，意味著一個(gè)治療周期需要30多萬，這一費(fèi)用對(duì)于國內(nèi)多數(shù)患者來說是無法承擔(dān)的，因此這種治療方案的經(jīng)濟(jì)可持續(xù)性引起密切關(guān)注［6]。2017年赫賽汀納入國家醫(yī)保目錄，下調(diào)為7 600元/支，這代表著未來對(duì)該產(chǎn)品的需求將進(jìn)一步擴(kuò)大。2018年3月開始，多地市場(chǎng)出現(xiàn)“藥荒”，很多患者由于無法購買到藥物而被迫停止治療。為了打破羅氏赫賽汀對(duì)市場(chǎng)的壟斷、降低治療成本、滿足市場(chǎng)需求，國內(nèi)藥企紛紛投入到赫賽汀生物類似藥的研發(fā)中。國家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心公布的數(shù)據(jù)顯示，目前赫賽汀生物類似藥國內(nèi)臨床申報(bào)情況如表1所示。除生物類似藥，國內(nèi)藥企也加緊自我新藥研發(fā)，一些靶向HER2的創(chuàng)新抗體藥物已申報(bào)臨床。其中主要是ADC藥物（如：齊魯制藥的注射用重組抗HER2人源化單克隆抗體-DM1），也有雙特異性抗體（如友芝友的注射用重組抗HER2和CD3人源化雙特異性抗體）以及單抗（如：麗珠的重組抗HER2結(jié)構(gòu)域Ⅱ人源化單克隆抗體注射液）等。與生物類似藥相比，創(chuàng)新藥具有研發(fā)和市場(chǎng)雙重高風(fēng)險(xiǎn)，只有兼顧臨床療效和價(jià)格，才能有望取得市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。

作為乳腺癌治療領(lǐng)域內(nèi)第一個(gè)分子靶向性藥物，曲妥珠單抗單藥有效率為12%-34%，在和多種化療藥物聯(lián)合治療過程中也體現(xiàn)出有協(xié)同或相加作用［7]。曲妥珠單抗與鉑類、長春瑞濱、多西他賽、環(huán)磷酰胺有協(xié)同作用，與多柔比星、紫杉醇有相加作用。盡管如此，仍約有40% 的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者表現(xiàn)出對(duì)曲妥珠單抗治療的新生（原發(fā)）耐藥性，并且大部分HER2陽性患者在經(jīng)過1年的曲妥珠單抗治療后，也會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥。此外，HER2低表達(dá)、異質(zhì)表達(dá)或可疑表達(dá)的患者也均不適合使用曲妥珠單抗進(jìn)行治療。

表1 赫賽汀生物類似藥國內(nèi)臨床申報(bào)情況

曲妥珠單抗與HER2的結(jié)合對(duì)以HER2上調(diào)作為擴(kuò)增基礎(chǔ)的腫瘤細(xì)胞具有直接抑制作用。曲妥珠單抗破壞配體非依賴性HER2-HER3二聚體相互作用，導(dǎo)致HER3/PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)的快速抑制，最終引起CDK2抑制劑p27的增加，導(dǎo)致癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯［8-10]。此外，曲妥珠單抗還能抑制HER2胞外域脫落［11]。除了直接抑制腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)外，曲妥珠單抗還可以通過抗體的Fc片段介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。ADCC效應(yīng)依賴于抗體的Fc部分與先天免疫的免疫效應(yīng)細(xì)胞上的Fcγ受體（FcγR）之間的相互結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，特別是表達(dá)FcγRIIIa的自然殺傷細(xì)胞，且這種結(jié)合受到FcγRIIIa158纈氨酸（V）/苯丙氨酸（F）基因組多態(tài)性的影響［12]。Clynes等［13]發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)曲妥珠單抗的Fc端進(jìn)行一定修飾后ADCC效應(yīng)消失，而對(duì)小鼠的FcγR進(jìn)行敲除后，曲妥珠單抗的療效也顯著降低。最近的一項(xiàng)臨床研究顯示自然殺傷細(xì)胞的功能與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者對(duì)曲妥珠單抗治療的效應(yīng)之間存在相關(guān)性［14]。這些報(bào)道支持了曲妥珠單抗通過ADCC效應(yīng)實(shí)現(xiàn)治療效果的事實(shí)，并且證實(shí)增強(qiáng)ADCC效應(yīng)可以成為一種潛在的提高曲妥珠單抗治療效果的方法［15]。

抗體介導(dǎo)的ADCC強(qiáng)弱和許多因素有關(guān)，如抗體與抗原的親和力、抗體與Fc段受體的親和力、免疫效應(yīng)細(xì)胞的特性等。一般情況下，抗體與抗原或Fc受體的親和力越高，其介導(dǎo)的ADCC作用越強(qiáng)。因此，對(duì)抗體的Fc段進(jìn)行改造，提高其對(duì)Fc受體的親和力也是提高ADCC效應(yīng)的一個(gè)有效途徑。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)完全敲除曲妥珠單抗Fc端N連接寡糖的核心巖藻糖時(shí)，低劑量使用即可引起強(qiáng)的ADCC效應(yīng)［16]。通過敲除曲妥珠單抗的核心巖藻糖來改善其臨床療效也成為一個(gè)重要的研究方向。

2 曲妥珠單抗核心巖藻糖的敲除

敲除巖藻糖可明顯增強(qiáng)抗體的ADCC效應(yīng)，其內(nèi)在分子機(jī)制是由于巖藻糖的敲除引起抗體Fc端恒定區(qū)構(gòu)象發(fā)生改變［17-19]，導(dǎo)致Fc與NK細(xì)胞上的FcγRIIIa結(jié)合作用增強(qiáng)，避免血清IgG蛋白與抗體競爭結(jié)合NK細(xì)胞上的活化Fc受體，從而抑制抗體的 ADCC作用［20-21]。研究表明，α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1，6 fucosyltransferase，F(xiàn)UT8）可催化GDP-巖藻糖上的巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)到GlcNAc內(nèi)部，通過α-1，6糖苷鍵連接，形成Fc段寡糖的核心巖藻糖［22]。FUT8可能是催化巖藻糖 α-1，6連接的唯一關(guān)鍵酶［23]。因此，生產(chǎn)完全無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗可通過構(gòu)建內(nèi)源性FUT8基因完全敲除、穩(wěn)定生產(chǎn)出無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗的特異性細(xì)胞株來實(shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^以下多種方式敲除FUT8基因。

2.1 敲除FUT8基因

Yamane等［24]通過序列同源重組技術(shù)成功靶向破壞CHO/DG44細(xì)胞系中的FUT8等位基因，產(chǎn)生的FUT8-/-CHO/DG44細(xì)胞株可表達(dá)完全無巖藻糖修飾的抗體。研究表明，F(xiàn)UT8-/-細(xì)胞系產(chǎn)生的抗CD20 IgG1與人類FcγIIIa受體具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，并顯著增強(qiáng)ADCC效應(yīng)，使ADCC增加到正常CHO/DG44細(xì)胞株產(chǎn)生抗體的大約100倍。然而，在實(shí)現(xiàn)基因敲除時(shí)，發(fā)生非同源重組的頻率遠(yuǎn)高于同源重組，這導(dǎo)致同源重組策略耗時(shí)且費(fèi)力［25]。此外，產(chǎn)生完全無巖藻糖修飾的抗體或FUT8基因的完全敲除是可逆的，而重新敲除FUT8基因也成為利用同源重組技術(shù)產(chǎn)生FUT8-/-CHO細(xì)胞系作為生產(chǎn)抗體的宿主細(xì)胞的一大挑戰(zhàn)［24，26]。

Mori等［27]使用小干擾 RNA（siRNA）在產(chǎn)生抗體的CHO/DG44細(xì)胞系中靶向敲除FUT8，選擇凝集素（LCA）進(jìn)行篩選后，分離得到的細(xì)胞系中有60%可穩(wěn)定表達(dá)無巖藻糖修飾的抗體。與正常CHO/DG44細(xì)胞株相比，ADCC效應(yīng)提高100倍以上。此外，該細(xì)胞系非常穩(wěn)定，即使在無血清分批補(bǔ)料培養(yǎng)中也可產(chǎn)生去糖基化抗體。

鋅指核酸酶（ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）技術(shù)也可用于破壞 FUT8基因［26，28]。Malphette等［26]在3周內(nèi)利用ZFN技術(shù)破壞FUT8基因，得到了FUT8-/-CHO細(xì)胞，并以此細(xì)胞生產(chǎn)出完全巖藻糖修飾的抗體，該抗體具有正常的糖基化模式，且沒有其他的不利表型。Cristea等［28]通過同時(shí)采取ZFN技術(shù)和TALEN核酸酶技術(shù)實(shí)現(xiàn)了FUT8基因的敲除。該技術(shù)主要通過序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的ZFN和TALEN與非特異性DNA核酸酶連接，引起DNA雙鏈斷裂，從而進(jìn)行基因?qū)哟蔚倪z傳調(diào)節(jié)。然而，DNA雙鏈斷裂易引起非同源末端連接或同源性定向修復(fù)出現(xiàn)錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致基因突變和蛋白質(zhì)功能喪失［29]。

CRISPR/Cas9基因修飾系統(tǒng)可特異性地進(jìn)行基因編輯［30]。Rond等［31]通過破壞編碼寡糖中FUT8的特殊位點(diǎn)基因，首次證實(shí)了CRISPR/Cas9技術(shù)可有效用于CHO細(xì)胞的基因編輯。此外，以LCA進(jìn)行篩選測(cè)試的結(jié)果表明靶向FUT8基因的sgRNAs引起的缺失頻率高達(dá)99.7%。Sun等［29]使用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行基因改造，3周內(nèi)FUT8-/-CHO細(xì)胞株的成功率為9%至25%，當(dāng)使用LCA進(jìn)行篩選后，成功率可增強(qiáng)至52%。通過基因編輯產(chǎn)生的FUT8-/-CHO細(xì)胞系可產(chǎn)生無巖藻糖修飾的治療性單克隆抗體，而此基因敲除對(duì)細(xì)胞生長、存活力以及產(chǎn)品質(zhì)量均未產(chǎn)生不利影響。此外，Grav等［32]使用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)FUT8、BAK和BAX進(jìn)行三重靶向敲除后，得到一個(gè)可穩(wěn)定表達(dá)無巖藻糖修飾抗體且表達(dá)量明顯提高的細(xì)胞系。

2.2 其他去除巖藻糖的方法

GDP-巖藻糖作為巖藻糖的轉(zhuǎn)運(yùn)媒介，為FUT8催化核心巖藻糖基化形成的過程中提供核心巖藻糖底物。GDP-巖藻糖通過兩條不同途徑合成：從頭路徑和補(bǔ)救途徑。從頭路徑通過鳥苷二磷酸-甘露糖脫水酶（GDP-mannose-4，6-dehydratase，GMD）將GDP-甘露糖轉(zhuǎn)化成GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖；然后通過鳥苷二磷酸-4-酮-6-脫氧甘露糖異構(gòu)還原酶（GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose epimerase/reductase，GMER或FX蛋白）將該酮中間體轉(zhuǎn)化為GDP-巖藻糖。補(bǔ)救途徑直接將從細(xì)胞外來源或從溶酶體分解代謝釋放的巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成GDP-巖藻糖，這一轉(zhuǎn)運(yùn)過程是通過巖藻糖激酶和GDP-巖藻糖焦磷酸化酶（GFPP）實(shí)現(xiàn)［33]。隨后，由這兩條途徑合成的GDP-巖藻糖通過GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GFT）被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w的內(nèi)腔［34]。

CHO-Lec13細(xì)胞由于內(nèi)源性GMD的缺乏，在GDP-巖藻糖形成中天然缺陷，可應(yīng)用Lec13細(xì)胞作為表達(dá)無巖藻糖修飾抗體的宿主細(xì)胞系。但從Lec13細(xì)胞中分離的單抗顯示出多種巖藻糖基化模式，大多數(shù)單抗產(chǎn)生50%-70%巖藻糖基化［35]。siRNA技術(shù)可成功介導(dǎo)巖藻糖基化途徑相關(guān)酶FUT8、GMD和GFT的沉默并降低抗體巖藻糖基化的含量［36]。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該敲除過程可能會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng)，暫時(shí)無法順利產(chǎn)業(yè)化［37]。Louie等［38]利用CRISPR/Cas9技術(shù)得到FX基因敲除的CHO-K1細(xì)胞系，并證實(shí)該細(xì)胞系能表達(dá)完全無巖藻糖修飾的抗體。此外，也可通過GFT基因（Slc35c1）失活或突變阻止抗體在高爾基體中發(fā)生巖藻糖基化修飾［39]。通過該方法產(chǎn)生的Slc35c1基因失活的CHO細(xì)胞系在無血清懸浮培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長速率、活細(xì)胞密度和抗體生產(chǎn)力均無改變，且已應(yīng)用于產(chǎn)生無巖藻糖修飾抗體研究［40-41]。

通過細(xì)胞工程和培養(yǎng)基修飾等策略也可以改變抗體巖藻糖基化狀態(tài)，進(jìn)而提高ADCC效應(yīng)?？贵w表達(dá)的糖基化與其培養(yǎng)條件之間存在復(fù)雜的關(guān)系，宿主細(xì)胞類型、培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程等參數(shù)會(huì)對(duì)抗體糖基化產(chǎn)生顯著影響。圖1總結(jié)了不同培養(yǎng)操作條件的影響［42]，具體使用哪一種還需要考慮技術(shù)的有效性和實(shí)際實(shí)施，以及生物制造兼容性和可用性等其他因素［43]。

此外，巖藻糖基化的生化抑制劑［44]、植物細(xì)胞作為表達(dá)平臺(tái)［45]、化學(xué)酶重塑［46]等方法也被開發(fā)用來產(chǎn)生無巖藻糖修飾的抗體。

3 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗的臨床優(yōu)勢(shì)

曲妥珠單抗在乳腺癌治療中的具有明顯的臨床療效。然而，藥物的有效性存在局限性［47]。巖藻糖敲除的曲妥珠單抗在體外活性和體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)上都具有明顯的優(yōu)勢(shì)，有望在不久的將來取代曲妥珠單抗。

圖1 各種培養(yǎng)參數(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的糖基化途徑中的各種酶和糖核苷酸前體的影響［42]

圖2 治療性抗體誘導(dǎo)的ADCC［48]

3.1 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗保留FcγR非依賴性功能

曲妥珠單抗可直接抑制腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和增殖抑制。研究表明巖藻糖的敲除不會(huì)影響曲妥珠單抗的FcγR依賴性功能。這些功能包括HER2結(jié)合，對(duì)PI3K途徑的瞬時(shí)抑制和對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的持續(xù)抑制［49]。

3.2 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗避免血漿IgG蛋白的抑制作用

血漿IgG蛋白與抗體競爭結(jié)合NK細(xì)胞上的活化Fc受體，從而抑制抗體的ADCC作用［50]。無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗對(duì)NK細(xì)胞上的FcγRIIIa具有更大的親和力，可避免血漿IgG蛋白的抑制作用。無巖藻糖的曲妥珠單抗的這種對(duì)天然IgG干擾的逃避機(jī)制，可利于其在臨床使用中實(shí)現(xiàn)更高的細(xì)胞毒性效力，因此低劑量的抗體即有可能產(chǎn)生療效。

3.3 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗體外ADCC效應(yīng)增加

Suzuki等［51]分別使用健康志愿者和乳腺癌患者的外周血單核細(xì)胞作為受體細(xì)胞，MCF-7或SKBR-3（2個(gè)具有不同HER2表達(dá)水平的乳腺癌患者的細(xì)胞系）作為靶細(xì)胞，以比較曲妥珠單抗和無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗各自的ADCC效應(yīng)。無論使用健康志愿者組還是乳腺癌患者組的外周血單核細(xì)胞作為受體，無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗的ADCC效應(yīng)明顯強(qiáng)于曲妥珠單抗。無論患者的身體情況如何，都可以觀察到ADCC效應(yīng)的增強(qiáng)，即使是自然殺傷細(xì)胞數(shù)量下降、ADCC效應(yīng)減弱的化療組。初步體外實(shí)驗(yàn)顯示無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗可以提高抗HER2治療療效，而且不依賴于患者的疾病治療情況。

3.4 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗的體內(nèi)療效增加

為了評(píng)估無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗在體內(nèi)的功效，Junttila等［49]以每周3次10 mg/kg的方案注射曲妥珠單抗或無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗，以評(píng)價(jià)巖藻糖敲除是否對(duì)曲妥珠單抗在抑制SCID-beige小鼠乳腺脂肪墊中KPL-4異種移植物生長的作用。與敲除前相比，無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗更有效地抑制KPL-4腫瘤的生長。此外，接受無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗治療的小鼠的中位無進(jìn)展生存期增加一倍以上。其中，曲妥珠單抗的中位無進(jìn)展生存期為23.4 d，而巖藻糖敲除后的中位無進(jìn)展生存期為48 d。這些結(jié)果表明無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗的體內(nèi)療效優(yōu)于曲妥珠單抗。

3.5 無巖藻糖修飾曲妥珠單抗的臨床適應(yīng)癥增加

TrasGEX是針對(duì)糖基化部位進(jìn)行改造所得的第二代曲妥珠單抗產(chǎn)品，與傳統(tǒng)曲妥珠單抗相比，TrasGEX的N-聚糖只含有少量巖藻糖。TrasGEX與NK細(xì)胞上FcγRIIIa受體的結(jié)合親和力更高，且在充分保持其結(jié)合力的同時(shí)可增強(qiáng)ADCC效應(yīng)。TrasGEX可引起所有高HER2和低HER2表達(dá)乳腺癌FcγRIIIa供體細(xì)胞的ADCC效應(yīng)，因此具有更廣譜的殺傷作用。目前正在進(jìn)行I期劑量遞增研究以確定可用于II期研究的最佳劑量和方案，并評(píng)價(jià)TrasGEX的安全性，藥代動(dòng)力學(xué)和初步抗腫瘤活性［52]。體外和體內(nèi)研究表明，對(duì)傳統(tǒng)曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌細(xì)胞仍保留了對(duì)ADCC殺傷效應(yīng)的敏感性［53]。提高無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗用藥劑量可以改善HER2陽性患者治療過程中出現(xiàn)的耐藥性（原發(fā)性或繼發(fā)性）。此外，無巖藻糖修飾曲妥珠單抗未來也可能用于有可疑、異質(zhì)或低HER2表達(dá)的乳腺癌患者，這可能是由于其具有顯著的ADCC效應(yīng)。這表明無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗有著更廣泛的患者群體和更大的市場(chǎng)。

4 單抗Fc段其他改造方法的探索

除了目前研究比較成熟的Fc段N連接寡糖的核心巖藻糖敲除外，研究者也探索出了其他針對(duì)曲妥珠單抗Fc段進(jìn)行改造的方法，期望能夠改善其ADCC效應(yīng)。

Nordstrom 等［54]設(shè) 計(jì) 出 了 MGAH22， 一 種與曲妥珠單抗具有類似特異性和親和力的嵌合抗HER2單克隆抗體，其Fc結(jié)構(gòu)域被改造以增加與人FcγRIIIa-158V/V基因型的外周血單核細(xì)胞的結(jié)合，而該基因型相比其他不同基因型的外周血單核細(xì)胞可引起更強(qiáng)的ADCC效應(yīng)。Fc結(jié)構(gòu)域改造后得到的抗體可更強(qiáng)地引起所有進(jìn)行考察的HER2陽性腫瘤細(xì)胞的ADCC效應(yīng)和抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，且這種效應(yīng)的提升對(duì)于那些低HER2表達(dá)水平的細(xì)胞也同樣適用。此外，MGAH22在轉(zhuǎn)入人FcγRIIIa-158F（F/F or V/F）基因的小鼠中表現(xiàn)出更好的靶向HER2表達(dá)性腫瘤的活性。而在一項(xiàng)使用食蟹猴的單一和重復(fù)劑量毒理學(xué)研究中，MGAH22在所有考察劑量下都具有良好的耐受性（15-150 mg/kg），且藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與其他抗HER2抗體相似。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)均表明，MGAH22在誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放方面與大多數(shù)的野生型mAb或曲妥珠單抗能力相似。這些數(shù)據(jù)為MGAH22進(jìn)入后續(xù)臨床開發(fā)提供了有利證據(jù)，且其可用于具有低HER2表達(dá)腫瘤或攜帶FcγRIIIa低結(jié)合等位基因的患者。

Jo等［55]利用大腸桿菌內(nèi)膜表達(dá)系統(tǒng)，通過定向改造結(jié)合隨機(jī)突變策略改造IgG的非糖基化Fc區(qū)，得到保留了與FcγRIIIa的結(jié)合能力并且可以有效發(fā)揮ADCC效應(yīng)的非糖基化Fc突變體。改造之后，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行多輪高通量篩選分離出與曲妥珠單抗相比具有更高FcγRIIIa親和力的非糖基化抗體 Fc突變體AglycoT-MG48和AglycoT-MG59。盡管AlycoT-MG48和 AglycoT-MG59的 FcγRIIIa親 和 力高于曲妥珠單抗，但ADCC活性低于糖基化IgG抗體。與曲妥珠單抗相比，非糖基化改造Fc突變體的ADCC活性較低，可能是由于對(duì)FcγRIIb的結(jié)合親和力增加。FcγRIIb是一種通過抑制免疫細(xì)胞活化以抑制抗腫瘤活性的抑制性受體。盡管已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是非常理想，然而通過進(jìn)一步改造以降低與抑制性FcγRIIb受體結(jié)合能力的操作，有可能產(chǎn)生表現(xiàn)出更好的ADCC效應(yīng)和腫瘤細(xì)胞殺傷活性的非糖基化Fc突變體曲妥珠單抗［55-56]。

Chen等［57]通過對(duì)Fc結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造得到可與FcγR接觸的額外環(huán)結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建編碼這些環(huán)中片段內(nèi)所有可能的氨基酸多樣性的文庫，從而篩選富集得到具有改善低親和力FcγRIIIa結(jié)合活性的突變體。其中非糖基化IgG1突變體DTT-IYG在各個(gè)評(píng)價(jià)模型中均可有效地替代野生型Fc。且理論上由于DTT-IYG不需要糖基化就可有效地與FcγR結(jié)合，因此此類抗體的表達(dá)系統(tǒng)得以擴(kuò)展。

在改善抗體Fc突變體與FcγRIIIa親和力時(shí)，其相應(yīng)的表達(dá)量以及生物物理特性，如穩(wěn)定性、血清半衰期、免疫原性等也需要納入考慮。此外，F(xiàn)c突變體能否介導(dǎo)ADCC活性的增強(qiáng)才是決定該變體是否進(jìn)行下一步研究的關(guān)鍵。從其成藥性來看，需要從非臨床和臨床研究等多方面進(jìn)行評(píng)估。

5 結(jié)語

曲妥珠單抗用于HER2陽性乳腺癌的治療的安全性和有效性已毋庸置疑。然而，藥物的有效性存在局限性。抗體翻譯后糖基化的研究為抗體細(xì)胞毒性作用提供了新的研究思路，通過對(duì)抗體Fc段改造，特別是核心巖藻糖的敲除可以顯著增強(qiáng)曲妥珠單抗ADCC效應(yīng)。

無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗不僅可以改善HER2陽性患者治療過程中出現(xiàn)的耐藥性，也可能用于有可疑、異質(zhì)或低HER2表達(dá)的乳腺癌患者，從而擴(kuò)大適應(yīng)癥范圍，這對(duì)于改善乳腺癌患者群體的治療效果具有非常重要的意義。因此，完全無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗，未來值得作為新一代降低劑量、提高療效的抗體治療應(yīng)用于患者，這將對(duì)基于ADCC機(jī)制的人類腫瘤治療產(chǎn)生巨大的影響。盡管關(guān)于曲妥珠單抗核心巖藻糖的敲除已經(jīng)具有很多相關(guān)報(bào)道，但都存在一定的局限性，如巖藻糖敲除不徹底或完全敲除后可逆、容易引起基因突變或蛋白功能喪失、細(xì)胞株表達(dá)不穩(wěn)定、耗時(shí)耗力、成本高等。如何經(jīng)濟(jì)有效地產(chǎn)生完全無巖藻糖修飾的曲妥珠單抗是目前急需解決的一大問題。