江林林 吳磊 許海霞 黃堅(jiān)麗 張永進(jìn) 徐期 楊勇

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺州 318000）

腺苷三磷酸（ATP）是生物體內(nèi)重要的代謝物質(zhì)，作為代謝中間體、輔酶和能量供體參與生物體內(nèi)多種生化反應(yīng)，是生命活動及生化反應(yīng)所必需的高能化合物。在體外，ATP常作為酶反應(yīng)的輔底物應(yīng)用于工業(yè)產(chǎn)品如谷胱甘肽的生產(chǎn)［1-2]。目前合成ATP的方法有酶催化法、微生物細(xì)胞酶系合成法及基因工程菌合成法等，如Maruyama等［3]報(bào)道了以腺嘌呤為底物，在產(chǎn)氨棒桿菌催化下合成ATP，反應(yīng)28 h積累ATP量達(dá)到117 mmol/L，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到82%；廖鮮艷等［4]報(bào)道了以腺苷為底物，利用面包酵母的糖酵解途徑耦聯(lián)腺苷激酶和腺苷酸激酶合成ATP，ATP最高合成量達(dá)到9 mmol/L。美國麻省理工學(xué)院Whitesides博士的研究組曾報(bào)道了一種以乙酰磷酸在腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶3種固相酶的共同作用下將腺苷轉(zhuǎn)化為ATP的方法，產(chǎn)率能達(dá)98%以上，具有ATP大量生產(chǎn)的潛力。而國內(nèi)對此法的研究較少，對于乙酸激酶的研究，則常用于以ATP作為輔底物時(shí)的ATP再生［5-6]。

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）是一種廣泛存在于生物體細(xì)胞中的重要代謝中間體，在體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫等多種生化反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。目前SAM已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肝病、關(guān)節(jié)炎、抑郁癥等疾病的治療，療效好、副作用低［7-8]。在體外采用酶促轉(zhuǎn)化法合成SAM主要是利用腺苷甲硫氨酸合成酶轉(zhuǎn)化ATP和L-甲硫氨酸合成［9-10]。研究過程中發(fā)現(xiàn)，由于ATP的價(jià)格較高，大大抬高了合成SAM的成本，因此考慮以其他成本低廉的前體物質(zhì)代替ATP來降低反應(yīng)的成本。例如，鄭計(jì)瑞等報(bào)道以一株具有轉(zhuǎn)化腺嘌呤生產(chǎn)ATP的毛霉為出發(fā)菌株，重組酵母腺苷甲硫氨酸合成酶，以腺嘌呤為前體物質(zhì)合成腺苷甲硫氨酸，濃度達(dá)到1 g/L左右［11]。

本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了表達(dá)腺苷激酶（Adenosine kinase，AK，EC 2.7.1.20）、腺苷酸激酶（Adenylate kinase，ADK，EC 2.7.4.3）、乙酸激酶（acetate kinase，ACK，EC 2.7.2.1）3種酶的ATP轉(zhuǎn)化菌株，以腺苷和乙酰磷酸二鋰鹽（以下簡稱ACP）作為起始物料，合成ATP，并對反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化；再與甲硫氨酸在表達(dá)SAM合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，EC 2.5.1.6）的菌體催化下合成SAM。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 pET24a質(zhì)粒載體購自NOVAGEN公司；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）購自Invitrogen公司。釀酒酵母菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。表達(dá)腺苷甲硫氨酸合成酶的重組大腸桿菌pET24a-metK，宿主菌為大腸桿菌BL21（DE3）]由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

腺苷酸激酶基因和乙酸激酶基因來源于大腸桿菌BL21（DE3）基因組序列，腺苷激酶基因來源于釀酒酵母基因組序列，通過PCR獲得。PCR引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏 5，蛋白胨 10，氯化鈉 10。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 15，酵母粉 25，磷酸氫二鉀 10，甘油 5，用6 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.5。

在含50 μg/mL卡那霉素的種子培養(yǎng)基中加入1‰甘油凍存管菌液，37℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。將種子培養(yǎng)液按2%移種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)約5 h，降溫至25℃后加入終濃度為1%的乳糖作為誘導(dǎo)劑，220 r/min發(fā)酵過夜。

1.1.3 試劑及工具酶NdeⅠ、BamHⅠ、BglⅡ限制性內(nèi)切酶、Pyrobest聚合酶、dNTPs、SolutionⅠ、DNA Marker、基因組提取試劑盒等購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒購自AXYGEN公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo公司；卡那霉素、ATP標(biāo)準(zhǔn)品購自上海生工生物工程股份有限公司；SAM標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma；其他分析純試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組菌構(gòu)建 使用基因組提取試劑盒分別提取得到大腸桿菌BL21（DE3）和釀酒酵母的基因組序列，并設(shè)計(jì)下述PCR引物，分別從大腸桿菌BL21（DE3）中擴(kuò)增得到腺苷酸激酶基因（gene ID：8156163）和乙酸激酶基因序列（gene ID：8156267），從釀酒酵母中提取得到腺苷激酶基因序列（gene ID：853569）。

腺苷激酶PCR所用引物對為：正向引物：AAA AAAAAAACATATGACCGCACCATTGGTAG，反向引物：AAAAAAAAAAGGATCCCTATTTAGAGTAAGA T。腺苷酸激酶PCR所用引物對為：正向引物：AAA AAAAAAACATATGCGTATCATTCTGCTTG，反向引物：AAAAAAAAAAGGATCCTTAGCCGAGGATTTTT。乙酸激酶PCR所用引物對為：正向引物：AAAAAAA AAACATATGTCGAGTAAGTTAGTAC，反向引物：AA AAAAAAAAGGATCCTCAGGCAGTCAGGCGG。

正向引物中下劃線部分表示NdeⅠ酶切位點(diǎn)，反向引物中下劃線部分表示BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

擴(kuò)增腺苷激酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：ddH2O 37.5 μL，10×Pyrobest緩 沖 液 5 μL，dNTP（各 2.5 mmol/L）4 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，模板 1 μL，Pyrobest酶 0.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為 ：95℃ 5 min ；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10 min，16℃ 1 min。

擴(kuò)增腺苷酸激酶基因的PCR反應(yīng)體系（50 μL）：ddH2O 37.5 μL，10×Pyrobest緩 沖 液 5 μL，dNTP（各 2.5 mmol/L）4 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，模板 1 μL，Pyrobest酶 0.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為 ：95℃ 5 min ；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃40 s，30 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10 min，16℃ 1 min。

擴(kuò)增乙酸激酶基因的PCR反應(yīng)體系（50 μL）：ddH2O 37.5 μL，10×Pyrobest緩沖液 5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，模 板 1 μL，Pyrobest酶 0.5 μL。PCR 反應(yīng)條 件 為 ：95℃ 5 min ；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 75 s，30 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10 min，16℃ 1 min。

將通過上述方法得到的3種酶的編碼序列片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收；將回收的三種酶基因的片段和pET24a質(zhì)粒載體分別用限制性內(nèi)切酶NdeI于37℃處理3-4 h，再添加限制性內(nèi)切酶BamH I于30℃處理3-4 h。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用AXYGEN公司的膠回收試劑，盒參考供應(yīng)商提供的操作手冊分別回收經(jīng)酶切的3種酶的基因片段和pET24a質(zhì)粒。

首先將上一步處理后的pET24a質(zhì)粒分別與經(jīng)酶切、回收的腺苷激酶基因片段、腺苷酸激酶基因片段和乙酸激酶基因片段，利用快速連接酶SolutionⅠ連接3-4 h，后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，分別獲得重組質(zhì)粒pET24a-AK、pET24a-ADK和pET24a-ACK。將上述重組質(zhì)粒pET24a-AK用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切，30℃酶切3 h后再用堿性磷酸酶（CAP）處理15 min，電泳回收。用BglⅡ與BamH I雙酶切處理pET24a-ADK，電泳并回收腺苷酸激酶基因的酶切片段。將如上得到的經(jīng)酶切的pET24a-AK和腺苷酸激酶基因的酶切片段利用快速連接酶Solution Ⅰ連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組質(zhì)粒pET24a-AKADK。將得到的重組質(zhì)粒pET24a-AK-ADK用BamHⅠ酶切，30℃酶切3 h后用堿性磷酸酶處理15 min，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳回收。用BglⅡ與BamHⅠ雙酶切處理pET24a-ACK，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收乙酸激酶基因的酶切片段。將經(jīng)酶切的pET24a-AK-ADK和ACK的酶切片段利用快速連接酶Solution Ⅰ連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組質(zhì)粒pET24a-AKADK-ACK。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET24a-AK-ADK-ACK的圖譜如圖1所示。通過測序檢測3種酶的表達(dá)序列全部正確。

圖1 重組質(zhì)粒pET24a-AK-ADK-ACK

將上述得到的重組質(zhì)粒pET24a-AK-ADK-ACK用KCM法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)，挑取陽性克隆在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后用終濃度為10%甘油保種，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 3種酶的表達(dá)及檢測 在含50 μg/mL卡那霉素的種子培養(yǎng)基中加入1‰重組大腸桿菌甘油凍存管菌液，37℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。將種子培養(yǎng)液按2%移種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)約5 h，降溫至25℃后加入終濃度為1%的乳糖作為誘導(dǎo)劑，220 r/min發(fā)酵過夜。離心收集菌體并破胞，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析重組菌對3種酶的表達(dá)結(jié)果。

1.2.3 重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)ATP及反應(yīng)條件優(yōu)化 發(fā)酵結(jié)束后采用8 000 r/min離心10 min收集菌體，用pH 7.0、50 mmol/L硼砂緩沖液洗滌菌體2次備用。反應(yīng)體系中含有30 mmol/L腺苷、50 mmol/L硼砂、一定濃度ACP和硫酸鎂，加入一定量濕菌體作為酶源合成ATP，對ACP濃度、硫酸鎂濃度、菌體用量、反應(yīng)液pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.4 聯(lián)合生產(chǎn)S-腺苷甲硫氨酸 表達(dá)腺苷甲硫氨酸合成酶的菌株（pET24a-metK）由本實(shí)驗(yàn)室在前期構(gòu)建并于-80℃保存，通過以大腸桿菌BL21（DE3）基因組序列為模板PCR擴(kuò)增得到表達(dá)腺苷甲硫氨酸合成酶的基因序列（gene ID：8180558），經(jīng)NdeI和BamH I雙酶切后與載體連接得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至大腸桿菌BL21（DE3）即得到該菌株。

按照1.2.2所述發(fā)酵方法發(fā)酵該菌株，8 000 r/min離心10 min收集菌體備用。

在發(fā)酵罐中進(jìn)行5 L體系的反應(yīng)。先投入5 L ATP反應(yīng)體系，35℃反應(yīng)，過程中監(jiān)測腺苷的轉(zhuǎn)化情況，等腺苷完全轉(zhuǎn)化為ATP后再補(bǔ)加D，L-甲硫氨酸、硫酸鎂等其他物料，在表達(dá)腺苷甲硫氨酸合成酶的菌體催化下合成SAM。

2 結(jié)果

2.1 重組大腸桿菌蛋白表達(dá)結(jié)果

重組大腸桿菌pET24a-AK-ADK-ACK表達(dá)結(jié)果如圖2-A所示，重組大腸桿菌pET24a-metK表達(dá)結(jié)果如下圖2-B所示，后續(xù)將用于考察反應(yīng)的效果。

圖2 重組大腸桿菌蛋白表達(dá)結(jié)果

2.2 ACP濃度對ATP生成的影響

由于ACP在溶液中易降解，實(shí)際使用時(shí)需要過量才能使腺苷完全轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)以腺苷濃度為30 mmol/L，分別考察了 ACP濃度為 90、105、120、135、150 mmol/L時(shí)的ATP轉(zhuǎn)化率，其他條件為硫酸鎂20 mmol/L、菌體濃度為10 g/L（濕重，下同），反應(yīng)pH為7.5，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為5 h，結(jié)果如下圖3所示。

從液相分析結(jié)果可知，在上述ACP濃度范圍內(nèi)，腺苷均已完全轉(zhuǎn)化，但當(dāng)ACP濃度低于135 mmol/L時(shí)，部分生成ADP，甚至還有少量的AMP存在；當(dāng)ACP濃度達(dá)到135 mmol/L，即腺苷與ACP摩爾比達(dá)到1∶4.5時(shí)，底物腺苷轉(zhuǎn)化為ATP（以下均稱轉(zhuǎn)化率）達(dá)到99%以上。

圖3 ACP濃度對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 硫酸鎂濃度對ATP生成的影響

實(shí)驗(yàn)中分別考察了硫酸鎂濃度為1、5、10、15、20 mmol/L時(shí)的ATP的生成率，其他條件同2.2所述，結(jié)果如下圖4所示。從上述結(jié)果可知，當(dāng)硫酸鎂濃度為5 mmol/L時(shí)就已經(jīng)足夠使腺苷完全轉(zhuǎn)化為ATP，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)硫酸鎂濃度就采用5 mmol/L。

圖4 硫酸鎂濃度對反應(yīng)的影響

2.4 菌體濃度對ATP生成的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步降低菌體用量，分別考察了菌體濃度為1、2、4、6、8、10 g/L時(shí)的反應(yīng)情況。結(jié)果如下圖5所示。

從上述結(jié)果可知菌體的活力較高，在反應(yīng)體系中用量僅2 g/L就可使底物腺苷完全轉(zhuǎn)化為ATP。

圖5 菌體用量對反應(yīng)的影響

2.5 反應(yīng)液pH對ATP生成的影響

隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液pH會出現(xiàn)下降，下降幅度在1.0左右。為操作便利，在實(shí)驗(yàn)過程中不對pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此需考察反應(yīng)液初始pH的最佳值。實(shí)驗(yàn)分別考察了pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5條件下的反應(yīng)情況，結(jié)果如下圖6所示。從上述結(jié)果可知反應(yīng)液pH在7.5時(shí)ATP的生成率最高，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用反應(yīng)液初始pH為7.5。

圖6 pH對反應(yīng)的影響

2.6 反應(yīng)時(shí)間對ATP生成的影響

根據(jù)上述優(yōu)化后的反應(yīng)條件，進(jìn)一步考察了反應(yīng)時(shí)間為0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h和5 h的反應(yīng)情況，結(jié)果如圖7所示。反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達(dá)到95%以上；繼續(xù)反應(yīng)至3 h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上。因此后續(xù)均反應(yīng)3 h。

2.7 放置pH條件對ATP穩(wěn)定性的影響

ATP料液轉(zhuǎn)化完成后繼續(xù)放置會有部分重新降解為ADP和AMP，考慮到實(shí)際操作過程中存在無法及時(shí)處理ATP反應(yīng)料液的可能性，因此實(shí)驗(yàn)考慮將料液加酸，分別考察了pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0條件下室溫放置ATP反應(yīng)液的穩(wěn)定性，結(jié)果如下圖8所示。從上述結(jié)果可知，在反應(yīng)結(jié)束后放置前6 h，ATP基本都是穩(wěn)定的；6 h后當(dāng)料液的pH為3.0、3.5、4.0，ATP基本較穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯的降解；當(dāng)pH為4.5及5.0時(shí)，ATP出現(xiàn)大量的降解，料液中ADP、AMP明顯增多，因此后續(xù)如需存放ATP料液，可以調(diào)節(jié)料液的pH為3.0-4.0。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

圖8 反應(yīng)液放置pH對ATP穩(wěn)定性的影響

2.8 雙菌聯(lián)合生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，反應(yīng)體系中含腺苷30 mmol/L、ACP 135 mmol/L、MgSO45mmol/L、硼砂50 mmol/L，重組ATP轉(zhuǎn)化菌株2g/L（濕重），反應(yīng)液pH為7.5，35℃反應(yīng)3 h，即可使腺苷完全轉(zhuǎn)化為ATP。

按照上述反應(yīng)體系配制5 L反應(yīng)液，在發(fā)酵罐中進(jìn)行控溫反應(yīng)，反應(yīng)3 h后采用高效液相分析腺苷已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為ATP，按50 g/L（濕重）補(bǔ)加表達(dá)SAM合成酶的菌體均質(zhì)液，并加入另一底物D，L-甲硫氨酸65 mmol/L，補(bǔ)加硫酸鎂15 mmol/L，控溫37℃反應(yīng)，反應(yīng)過程中檢測SAM的生成情況，結(jié)果如圖9所示。

反應(yīng)最終生成腺苷蛋氨酸濃度達(dá)到8.7g/L，ATP轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.5%。

圖9 SAM生成結(jié)果

3 討論

目前用于ATP生產(chǎn)的主要菌株為酵母菌株及產(chǎn)氨棒桿菌，反應(yīng)所需的時(shí)間較長，而采用重組大腸桿菌用于ATP生產(chǎn)的文獻(xiàn)相對較少。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的ATP轉(zhuǎn)化菌株能夠在較低的菌體用量下實(shí)現(xiàn)30mmol/L腺苷完全轉(zhuǎn)化為ATP，且反應(yīng)所需的時(shí)間僅需3 h。所用的腺苷濃度相對較低，主要是為了將反應(yīng)液直接用于下一步S-腺苷甲硫氨酸的合成。后續(xù)可以考察更高濃度的ATP合成及ATP的分離純化，用于ATP的生產(chǎn)。另外，由于ATP反應(yīng)液中含有較高濃度的醋酸鹽，以及過量未參與反應(yīng)的ACP，可能會對下一步生成SAM產(chǎn)生一定的影響，后續(xù)可以考慮先對ATP反應(yīng)液做一定的處理。以價(jià)格較低的腺苷作為底物先合成ATP，再與甲硫氨酸反應(yīng)合成SAM，可以大大降低SAM的生產(chǎn)成本。

4 結(jié)論

構(gòu)建了重組菌E.coilBL21（DE3）（pET24a-AK-ADK-ACK），催化以腺苷為底物合成ATP，并對反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的體系為：腺苷30 mmol/L，乙酰磷酸二鋰鹽135 mmol/L，硫酸鎂5 mmol/L，硼砂50 mmol/L，菌體2 g/L，反應(yīng)液初始pH為7.5，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到99%以上。初步考察了聯(lián)合腺苷甲硫氨酸合成酶合成S-腺苷甲硫氨酸，生成S-腺苷蛋氨酸濃度能達(dá)到8.7 g/L，轉(zhuǎn)化率能達(dá)到72.5%。