李海霞 賈然然 邢國珍 王愛武 孫金花

摘要：為了解決實驗教學中存在的一些實際問題，本文對凝膠過濾分離血紅蛋白與硫酸銅實驗進行了改進，給出一套簡單、操作方便、實驗結果可靠且重復性好的實驗方案，使得該實驗得以在本科教學中開展。本實驗的設計符合了本科生實驗教學特點，為農(nóng)業(yè)類院校生物化學專業(yè)基礎課提供一個典型實驗，同時降低了實驗成本。本實驗不僅適用于本科生，同時也適用于研究生進行科研素質訓練，以達到掌握實驗原理與實驗方法，初步掌握凝膠過濾分離技術。

關鍵詞：凝膠過慮；實驗教學；血紅蛋白；硫酸銅

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2019）23-0273-02

分離和提純蛋白質方法多種多樣，其中最為重要的一種方法就是凝膠過濾層析。凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白質分子大小不同進行分離的方法，是一種有效的液相層析色譜技術，具有設備簡單、操作方便、分離迅速及不影響分子的生物學活性等優(yōu)點，目前已廣泛應用于各種生物大分子物質的分離和純化[1]。作為一項基本的實驗技能，在農(nóng)業(yè)類院校已經(jīng)把凝膠過濾分離血紅蛋白與硫酸銅作為生物化學教學的一項基本實驗[2]。凝膠層析技術不僅被廣泛應用于科研與教學，同時也是醫(yī)學和生物技術類院校普遍安排的對本科生和研究生的生化實驗[3，4]。通過凝膠過濾分離血紅蛋白與硫酸銅，讓學生充分了解凝膠過濾層析的工作原理、方法及應用等，初步掌握凝膠過濾分離技術。但由于實驗過程步驟復雜、耗時過長，或者實驗結果不理想，再加上儀器、試劑、樣品處理等原因的約束，而使其在本科生實驗教學中很難開設。為了能讓學生在兩個學時內(nèi)完成實驗過程并且能掌握實驗原理與實驗的方法，我們進行了多次的預習實驗，最后確定了一套實驗方法與步驟，簡化了實驗過程，充分利用了試劑，對樣品也進行了一些改進，在實驗過程中使用直徑為1cm、長為15cm的層析柱。利用較少的樣品、簡便的器材即可以完成操作，使其適合在本科生實驗教學中開設[5]?，F(xiàn)將整個實驗方案介紹如下。

一、實驗原理

凝膠過濾的方法廣泛地應用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽等。凝膠是一種有立體網(wǎng)狀結構的不溶性珠狀顆粒物質，用它來分離物質，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質分子具有不同的排阻效應進行分離。把樣品加到充滿凝膠顆粒的層析柱中用緩沖液洗脫，當被分離的混合物溶液通過凝膠的網(wǎng)孔向下運動時，由于大分子物質直徑大于凝膠的網(wǎng)孔，不能進入膠粒內(nèi)部而完全被排阻在外，沿著膠顆粒間的縫隙向下移動，所以大分子物質流程短、流速快，首先流出柱外。而一些小分子物質由于直徑小于凝膠的網(wǎng)孔，不被排阻，可以自由擴散，進入凝膠的顆粒內(nèi)部，而后又被經(jīng)過的洗脫液帶走。由于其不斷地進入和流出凝膠顆粒，使其流程變長、移動速度變慢，小分子物質反而最后流出層析柱。這樣就使樣品中各組分按相對分子質量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。凝膠過濾層析又稱之為排阻層析[1]（如Sephadex G-50），是一種按照分子量大小分離物質的層析方法[6]。

二、器材和試劑

（一）器材

層析柱、移液管、洗耳球、試管與試管架、分光光度計、血紅蛋白與硫酸銅、Sephadex G-50等。

（二）試劑

洗脫液：0.05mol/L磷酸緩沖液

血紅蛋白溶液：稱取2g血紅蛋白加入10mL蒸餾水中充分溶解。血紅蛋白溶液使用前要進行離心，以徹底清除雜質，保護柱床以及保證分離的效果。

堿性硫酸銅溶液：將硫酸銅3.73g溶于10mL熱蒸餾水中，冷卻后稀釋到15mL。另取檸檬酸鈉17.3g及Na2CO3·H2O 10g加水60mL，加熱使之溶解。冷卻，稀釋至85mL。最后把硫酸銅溶液緩緩傾入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中，混勻即可[6]。

血紅蛋白-堿性硫酸銅混合溶液：在臨使用前將上述血紅蛋白溶液和堿性硫酸銅溶液按體積比1∶1混合待用。

三、操作步驟

凝膠預處理（提前由實驗員完成）：稱取葡萄糖凝膠Sephadex G-50適量（視裝層析柱數(shù)量而定）于燒杯中，加人足量的蒸餾水或洗脫液于沸水浴中溶脹5小時或室溫溶脹過夜；待溶脹平衡后，用玻璃棒適度攪拌使之充分懸浮后靜置，等大部分凝膠沉降后，慢慢傾倒去掉漂浮在上層的細小顆粒；如此反復傾倒幾次直到清除干凈懸浮的細小顆粒，然后減壓抽氣去除凝膠孔隙中的空氣，準備裝柱[6，7]。

1.裝柱。層析柱下端止水，倒入洗脫液，排除氣泡，將底部留少許洗脫液。把溶脹好的凝膠邊攪拌邊倒入柱中，當?shù)撞砍练e約2cm凝膠時，打開下端出口開關，讓洗脫液緩緩流出。注意裝柱過程中層析柱下端需要適時止水，以保證洗脫液面始終高于凝膠面1cm左右，防止凝膠因脫水而毀柱。待肉眼可見的凝膠沉降至8cm時為止。

2.清洗與柱平衡。檢查柱床是否均勻，若有氣泡或分層界面，或者殘留物時，需要重新裝柱或清洗。此時將裝好的層析柱倒入洗脫液，使洗脫液高于柱床面3—4cm，然后用拇指壓住層析柱管口，水平晃動層析柱，使柱內(nèi)葡聚糖完全懸??；然后豎直使其自然沉降后，把多余的洗脫液從底部排出，使層析柱床平衡5分鐘；然后沿著柱壁環(huán)繞加入1—2倍洗脫液清洗平衡層析柱，打開下端出口使柱內(nèi)洗脫液不斷流出；最后待液面與凝膠床表面平齊時（注：整個清洗平衡過程中不可使凝膠表面干燥），關閉出口，停止洗脫。在平衡過程中調(diào)節(jié)好流速和收集器械，待平衡完成后即可使用。

3.加樣與洗脫。吸取0.2ml樣品距柱床表面1mm處沿管壁輕輕轉動加入樣品，然后打開底端出口開關，使樣品浸入床表面，用少量的洗脫液同樣小心清洗表面樣品1到2次，使洗脫液流至床表面，以盡量避免樣品的稀釋以保證分離效果；然后用滴管小心加人洗脫液約高于柱床面4cm，調(diào)節(jié)好流速開始連續(xù)洗脫收集。在加樣和洗滌過程中防止沖壞柱床面。

4.收集與測定。打開出口，收集洗脫液，每1.5mL收集一管，共計5—10管。在451nm波長處以洗脫液為空白對照進行光吸收測定，測定后以收集管數(shù)為橫坐標，光密度為縱坐標對應作曲線圖。

四、結束語

本實驗在進行裝柱的過程中要連續(xù)裝柱，才能保證膠柱的均勻。裝柱的過程中還要一直保持膠體處于洗脫液中，避免干膠。在平衡過程中要調(diào)節(jié)好流速，以利于收集。流速會影響分離的效果，太慢了峰值趨緩，太快了可能導致分離不徹底，蛋白峰與鹽峰重疊[7]。流速的調(diào)節(jié)根據(jù)具體情況而定，每分鐘10滴為宜，一管收集18—20滴。

預先對層析柱的規(guī)格進行了篩選，直徑為1cm、長為15cm的層析柱是最好選擇。對加樣量進行了優(yōu)化，0.2mL的加樣量剛好能滿足實驗的要求，達到比較理想的分離效果。對于血紅蛋白與硫酸銅實驗來說，Sephadex G-50分離效果最好。為了更精確的測量光密度值，用5mm規(guī)格的比色皿，增加接收管數(shù)，做出更準確的曲線圖。

在本科生教學中開展，建議2—3人一組進行實驗，該實驗已經(jīng)在20多個本科專業(yè)開設，實驗學生人數(shù)達一萬余人次。

參考文獻：

[1]史偉，禹婷.蛋白質的層析分離[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2011，（01）：110-112.

[2]劉明，晁代軍，王淑娟.凝膠層析分離蛋白質的實驗改進[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2000，（05）：315.

[3]袁榴娣.生物化學實驗指導[M].第一版.南京：東南大學出版社，2007：68-70.

[4]楊歌德，姜玉梅，周宏博.凝膠層析分離蛋白質實驗中3種過濾介質分離效果的比較[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2002，（3）：242-243.

[5]薛金艷，李俏俏，王云飛，王愛民.凝膠層析分離蛋白質實驗方法的優(yōu)化[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2010，44（06）：627-628.

[6]高玲，劉衛(wèi)群.生物化學實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2010

[7]李翠蓉.凝膠層析脫鹽技術應用[J].石河子科技，2009，（06）：43-45.