閆 偉，石鳳翎，錢亞斯

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

苜蓿(Medicago)是重要的豆科牧草，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和高蛋白含量〔1〕。與其共生的根瘤菌(Rhizobium)是有益土壤微生物，通過共生結(jié)瘤固氮，能夠促進(jìn)苜蓿的生長(zhǎng)和增強(qiáng)土壤肥力〔2-4〕。在根瘤-苜蓿共生系統(tǒng)中,寄主植物在根瘤菌形成類菌體開始固氮前為根瘤菌提供各種營(yíng)養(yǎng)元素,根瘤菌在形成類菌體后固定空氣中的N2，為苜蓿提供生長(zhǎng)所必需的氮素〔5-7〕。

而根瘤組織內(nèi)亦存在其他微生物定殖，相對(duì)根瘤菌而言，人們對(duì)這些根瘤內(nèi)生細(xì)菌的研究還相對(duì)較少，其中研究較多的是分離自根瘤的Agrobacteriumtumefaciens〔8-10〕，另外Burkholderiacepacia也被證實(shí)為植物內(nèi)生菌和根瘤內(nèi)生菌〔11〕。高俊蓮等人〔12〕從沙打旺根瘤上分離出19 株與土壤桿菌相關(guān)的株菌，經(jīng)過數(shù)值分類、AFLP、16S rDNA-RFLP分析，表明它們與土壤桿菌親緣關(guān)系較近。目前人們對(duì)根瘤內(nèi)存在土壤桿菌的現(xiàn)象已有一些相關(guān)研究，且有了初步認(rèn)識(shí)〔13〕。這些研究主要集中在根瘤內(nèi)土壤桿菌的鑒定、對(duì)共生結(jié)瘤的影響、以及其侵入根瘤的途徑等方面。早在1976年，Imshentskii等〔14〕就曾報(bào)道過土壤桿菌在自然條件下偶爾可以形成非典型的、無固氮能力的無效瘤。

本試驗(yàn)通過對(duì)內(nèi)蒙古西部地區(qū)各苜蓿屬材料根瘤內(nèi)生菌進(jìn)行分離、純化、形態(tài)特征、16SrDNA的初步鑒定，為深入研究苜蓿根瘤內(nèi)生細(xì)菌的結(jié)瘤固氮特性和對(duì)植株生長(zhǎng)的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及來源

鑒定菌株是本實(shí)驗(yàn)室從內(nèi)蒙古西部牧草栽培區(qū)各苜蓿屬材料根部根瘤中分離純化獲得，詳見表1。

1.1.2 試劑及儀器

培養(yǎng)基采用YMA培養(yǎng)基：甘露醇10ɡ，酵母粉0.4ɡ、K2HPO40.5ɡ、MgSO4.7H2O 0.2ɡ、CaCl2.6H2O 0.3ɡ、NaCl 0.1ɡ、瓊脂18ɡ、dH2O 1000ml、微量元素液4ml(微量元素液：H3BO35ɡ、Na2MoO45ɡ、dH2O至1000ml)配制，于1000ml試劑瓶中調(diào)pH至7。培養(yǎng)基均經(jīng)過高壓滅菌鍋在121℃的條件下滅菌25min后使用。

革蘭氏染色：

(1)結(jié)晶紫溶液：結(jié)晶紫(10g)、草酸銨(4g)、酒精(100ml)、蒸餾水(400ml)。

(2)碘溶液：碘(1g)、碘化鉀(2g)、酒精(25ml)、蒸餾水(100ml)。

(3)碘酒：碘溶液(5ml)、酒精(95ml)。

(4)復(fù)染劑：2.5%番紅酒精(10ml)、蒸餾水(100ml)。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)DP302，PCR試劑盒及瓊脂糖凝膠電泳試劑均購置于天根生化科技(北京)有限公司，引物采用細(xì)菌通用引物(27F/1492R)由上海生工(Sangon)合成。引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

表1 供試菌株一覽表Table 1 Strains for test

1.2 采集地概況

21份菌株均自行采集于4個(gè)地點(diǎn)，分別為內(nèi)蒙古自治區(qū)土默特左旗沙爾沁基地(N40°34′54″，E111°46′54″，海拔1050m)、土默特左旗海流基地(N40°31′17，E111°23′46″，海拔1008m)、呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)新校區(qū)牧草栽培基地(N40°41′30″，E111°22′30″，海拔1055m)達(dá)拉特旗關(guān)碾房農(nóng)業(yè)部草原生態(tài)環(huán)境野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站(N40°19′7″，E109°59′52″，海拔1030m)。

4個(gè)采集地的氣候條件接近，均屬典型大陸性氣候，呼和浩特市、海流、沙爾沁試驗(yàn)區(qū)年平均氣溫5.4℃，一月份最冷，極端最低氣溫-33.6℃，七月份最熱，極端最高氣溫36℃；年均日照2952h；年平均降水379mm，冬季積雪少；無霜期113-133d，初霜期9月中下旬，終霜期5月末。達(dá)拉特旗關(guān)碾房試驗(yàn)區(qū)年均氣溫6.1—7.1°C，無霜期135—150d，360mm,年均日照時(shí)數(shù)約3000h。各采集地地勢(shì)平坦，土壤主要養(yǎng)分含量見表1。

表2 試驗(yàn)地土壤理化性質(zhì)Table2 The properties of the soil in the experimental field

1.3 試驗(yàn)方法

1.4.1 根瘤采集

挖取生長(zhǎng)1-2年苜蓿屬材料帶有根瘤的根部，裝入塑封袋帶回室內(nèi)。將根部土壤清洗干凈，采集淡粉或粉紅色飽滿的根瘤。

1.4.2 細(xì)菌的分離與純化

配制YMA培養(yǎng)基〔15〕，滅菌備用。將根瘤用0.1%升汞溶液浸泡1分鐘后再用無菌水沖洗3遍，置超凈工作臺(tái)中備用。用滅過菌的鑷子壓碎根瘤菌后加入一小滴無菌水，再用接種環(huán)蘸取碾碎的根瘤菌液，在凝固后的培養(yǎng)基上劃線，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)根瘤菌落后長(zhǎng)至4-5天后再次進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，經(jīng)4-5次的分離，待沒有雜菌后采用甘油法保藏，并鑒定。

1.4.3 革蘭氏染色

將菌株接種于YMA培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在預(yù)先準(zhǔn)備好的載玻片上加一接種環(huán)水，從固體培養(yǎng)基上挑出少量菌體均勾涂于玻片上，并盡量分散開；在空氣中干燥后在酒精燈火焰頂部通過2次，待冷卻后用結(jié)晶紫溶液染色1min，用水輕輕的沖洗并吸去多余的水；用碘溶液浸沒后吸干，再用碘液染色1min，用吸水紙吸去碘液后用碘酒脫色5min；用水洗后吸去表面的水，用番紅復(fù)染染色5min；結(jié)束后用水輕輕沖洗，吸去表面水后掠干，上鏡〔16〕。

1.4.4 細(xì)菌16SrDNA鑒定

細(xì)菌DNA的提?。篋NA模板的提取參照試劑盒步驟。

16SrDNAPCR擴(kuò)增〔17〕：

16SrDNAPCR反應(yīng)體系體積均為50μl，反應(yīng)體系組成如下：

2.0μlReactionBuffer(10×) 5.0μldNTPs(10mM)

4.0μl正向引物P1(10μM) 1.0μl反向引物P6(10μM)

1.0μlTaq聚合酶(5U/μl) 0.25μlMgCl2

3.0μl去離子水蒸餾水 33.75μl模板DNA(約 50ng)

總體積 50μl

按上述組分配制好反應(yīng)液，分裝于PCR管中，加入模板DNA混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：

95℃ 預(yù)變性 5min

94℃ 變性 1min

55℃ 退火 1min36個(gè)循環(huán)

72℃ 延伸 2min

72℃ 最終延伸 10min

4℃ 保藏

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，100V、40min水平電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，目標(biāo)條帶約1200bp。

圖1 供試菌株P(guān)CR凝膠電泳

16SrDNA序列測(cè)定及序列數(shù)據(jù)分析

將PCR產(chǎn)物送至華大基因公司測(cè)序，通過Internet網(wǎng)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上NCBI基因庫中的BLAST對(duì)所測(cè)堿基序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性95%以上的11株細(xì)菌，用Mega(4.0)程序包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定各根瘤菌在微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的地位。同源性99%以上定義為種水平，95%-99%定義為屬水平，95%以下定義為科水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿內(nèi)生細(xì)菌分離結(jié)果

經(jīng)過分離純化獲得21株苜蓿根瘤內(nèi)生細(xì)菌，所有菌株在YMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天生長(zhǎng)少；培養(yǎng)2天開始大量生長(zhǎng)，生長(zhǎng)3天后，形成明顯菌落，大部分菌落表面粘稠、有光澤，菌落均圓形、凸起；顯微鏡下除菌株H1、H5、H9、SZ為不規(guī)則桿狀外，其余菌株形態(tài)都為桿狀；革蘭氏染色均為陰性；在進(jìn)入對(duì)數(shù)期后(3～4d)，各菌株菌落直徑不盡相同，其中菌株H1、H5、H9、SZ直徑最小，僅為1～2mm，HH、H2、H7、SJN、SWL等菌株達(dá)2～3mm，而H3、H10、SC3可達(dá)9～10mm。

表3 苜蓿根瘤內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)觀察結(jié)果Table 3 Results of morphological character tests of endophytic bacteria of Medicago root nodules

各菌株均在生長(zhǎng)1天時(shí)未見明顯菌落，屬于停滯期，2天后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌落在不斷擴(kuò)大，4天后達(dá)到靜止期，菌落不在擴(kuò)大，隨后很快進(jìn)入衰落期，菌落周圍開始出現(xiàn)無光澤、干涸的白色代謝物及死亡菌體。

圖2 供試菌株純培養(yǎng)物

2.2 各菌株16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果

由表3可知，21份菌株中，10份屬苜蓿中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)，2份屬根瘤菌屬(Rhizobium)，4份屬假單胞菌屬(Pseudomonas)，4份屬節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，1份屬土壤桿菌屬(Agrobacterium)。在GenBank數(shù)據(jù)庫中，所有菌株均未找到其同源性在95%水平以下的相似菌株，未能獲得種水平上的新菌株。

表4 苜蓿根瘤內(nèi)生菌16SrDNA序列比對(duì)結(jié)果Table 4 The results of 16SrDNA sequence blast of endophytic bacteriaof Medicago root nodules

3 討論

各菌株菌落外觀差異明顯，苜蓿中華根瘤菌與根瘤菌的純培養(yǎng)物相似，呈乳白色，苜蓿中華根瘤菌的單菌落較根瘤菌單菌落小，可能由于其生長(zhǎng)繁殖速度的差異；土壤桿菌的菌落較大，呈透明乳白色；節(jié)桿菌菌落較小，呈乳白色，菌落界限不明顯；假單胞菌呈微黃色，菌落邊緣呈白色。

微生物的生長(zhǎng)過程包括停滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、靜止期和衰落期〔18〕，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是指微生物在迅速生長(zhǎng)達(dá)到平衡前的一個(gè)階段，之后即進(jìn)入最利于根瘤菌統(tǒng)計(jì)的時(shí)期—穩(wěn)定期生長(zhǎng)期，本研究中根瘤菌(Rhizobium)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium)均在生長(zhǎng)1天時(shí)未見明顯菌落，屬于停滯期，2天后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4天后達(dá)到靜止期，隨后很快進(jìn)入衰落期，且菌落周圍開始出現(xiàn)無光澤、干涸的白色代謝物及死亡菌體，說明在根瘤菌的傳代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)時(shí)間不能超過5d。

土壤中的其他細(xì)菌在豆科植物根瘤中的存在是較為普遍的現(xiàn)象，而且它們對(duì)宿主及根瘤菌沒表現(xiàn)出致病性〔19〕; 它們有多種多樣的途徑進(jìn)入根瘤，有的伴隨根瘤菌侵入，有的在根瘤成熟后通過根瘤上裂隙滲入，而有的可能早期就已進(jìn)入植物種子；但是大多數(shù)根瘤內(nèi)生菌單獨(dú)回接原宿主不結(jié)瘤〔20〕，對(duì)植物生長(zhǎng)影響不大；僅少數(shù)具有促進(jìn)或降低根瘤菌結(jié)瘤的效果，但這與植物種類和菌種類型有關(guān)〔21〕。由此看來，根瘤內(nèi)生菌侵染豆科植物根瘤及其與根瘤菌、宿主植物之間的相互作用是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，目前人們對(duì)此還沒有清楚的認(rèn)識(shí)。

在不同地點(diǎn)采集的菌株，可能與土壤的養(yǎng)分差異、土壤微生物菌群、地區(qū)氣候條件及與寄主植物等密切相關(guān)〔22〕。本研究中，同一苜蓿屬材料在不同種植環(huán)境下，根瘤中的菌種不同，不同苜蓿屬材料在同一種植環(huán)境下，根瘤中的菌株也不盡相同。這與以前研究得出的結(jié)論相似，采集于同一地點(diǎn)下不同材料上的菌株，其親緣關(guān)系均較近；對(duì)于采集于不同地點(diǎn)上的同一材料的菌株可能分屬于兩個(gè)屬或同屬內(nèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)〔22〕。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果初步表明，苜蓿根瘤中有可培養(yǎng)得到的土壤桿菌、節(jié)桿菌、假單胞菌、苜蓿中華根瘤菌、根瘤菌共存，且均可以在YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；同一苜蓿屬材料在不同種植環(huán)境下，根瘤中的菌種不同，不同苜蓿屬材料在同一種植環(huán)境下，根瘤中的菌株也不盡相同。