玉 云，尹團(tuán)章，龐登紅，馬煜明，朱 雯，黃友誼

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040)

產(chǎn)香菌在大自然中分布廣泛，種類豐富，其中，有關(guān)產(chǎn)香酵母的研究與應(yīng)用較多。產(chǎn)香酵母能產(chǎn)生花香、果香和清香3種香型[1-4]，合成的芳香物質(zhì)涉及10大類芳香物質(zhì)中的30多種，而不同來源的產(chǎn)香酵母因其代謝不同，產(chǎn)生的芳香物質(zhì)也不盡相同[5-8]。因此，挑選合適的材料篩選產(chǎn)香酵母，對發(fā)掘特色產(chǎn)香酵母意義重大。已有研究表明，產(chǎn)香酵母主要篩選自土壤、植物組織以及酒、醋、醬油等發(fā)酵食品，其中，關(guān)于發(fā)酵食品中分離篩選到的產(chǎn)香酵母的研究最多。關(guān)于植物組織中分離篩選的產(chǎn)香酵母的研究最少，但所篩選的產(chǎn)香酵母最具特色[9-11]。高健等[12]從萵苣中分離出1株內(nèi)生酵母菌，其發(fā)酵液香氣成分中檸檬烯含量高達(dá)20%，這在產(chǎn)香微生物中極少見。賈蓓蕾等[13]從煙草中分離出1株高降解α-胡蘿卜素菌株ULI3，其主要降解產(chǎn)物是5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等香味物質(zhì)。新鮮荔枝香味獨(dú)特，然而，鮮有篩選產(chǎn)香菌用于茶葉發(fā)酵的報道。鑒于此，以荔枝果肉為材料，從中篩選適宜茶葉發(fā)酵的產(chǎn)香酵母菌，以促進(jìn)特色發(fā)酵茶產(chǎn)品的開發(fā)利用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑 荔枝購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水果市場，綠茶購自湖北洞莊茶葉有限公司。葡萄糖、瓊脂等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為化學(xué)純。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 PDA(Potato dextrose agar)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 15～20 g，加水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min；富集培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，加水至1 000 mL，121 ℃滅菌 20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)香菌分離方法 分別采用組織塊分離法、組織勻漿法和富集分離法從荔枝果肉中分離產(chǎn)香菌[14-15]，用PDA培養(yǎng)基對分離得到的菌株不斷純化，得到單一菌株。組織塊分離法、組織勻漿法和富集分離法分離得到的菌株，分別用“ZKF+序號”、“ZYF+序號”和“ZFF+序號”表示。

1.2.2 產(chǎn)香菌株初篩方法 將分離純化的菌株分別接入PDA培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。由4位專業(yè)審評員感官評選出產(chǎn)香濃郁且風(fēng)味怡人的產(chǎn)香菌，初篩出較優(yōu)的產(chǎn)香菌株。

1.2.3 產(chǎn)香菌株復(fù)篩方法 將綠茶以1∶50的茶水(沸水)比浸提10 min，過濾，茶湯以細(xì)菌瓶分裝為10 mL/瓶，以121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。將初篩產(chǎn)香菌株接入茶湯中，設(shè)置對照(不接菌)，置于28 ℃搖床中培養(yǎng)5 d，得菌種液。取滅菌茶葉(20 g/瓶)，接種10 mL菌種液。試驗(yàn)設(shè)置CK(綠茶不添加外源物的空白對照茶樣)、C1(綠茶添加10 mL無菌水的茶樣)、C2(綠茶添加10 mL 2%無菌茶湯的茶樣)3個對照。所有樣品于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。參照黑茶審評標(biāo)準(zhǔn)，評價時側(cè)重于茶葉香氣，由5位審評員進(jìn)行審評，確定評分指標(biāo)及其權(quán)重。茶用荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶綜合得分=香氣得分×40%+湯色得分×20%+滋味得分×30%+葉底得分×10%。依據(jù)綜合得分，復(fù)篩出最佳產(chǎn)香菌株。

1.2.4 產(chǎn)香菌株鑒定 對復(fù)篩出的產(chǎn)香菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定。分別在光學(xué)顯微鏡下和電子顯微鏡下觀察菌株的顯微結(jié)構(gòu)，根據(jù)菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)判斷菌株種屬。用試劑盒提取菌株DNA，選用引物(NL-1:5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL-4:5′-GGTCCGTGTTTCAAGA-CGG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序： 94 ℃變性1 min，52 ℃延伸1 min，72 ℃復(fù)性1 min 30 s，30個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系100 μL：Taq酶(5 U/μL)0.8 μL、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)10 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL、模板DNA 2.5 ng、引物NL-1(10 μmol/L)2 μL、引物NL-4(10 μmol/L)2 μL，用ddH2O補(bǔ)至100 μL。用1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產(chǎn)物，對所得產(chǎn)物進(jìn)行測序，以BLAST軟件對所得序列進(jìn)行同源性比對，將比對結(jié)果中同源性較高的序列挑選出，采用MEGA 4.1軟件對其進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定產(chǎn)香菌株種屬[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶用荔枝產(chǎn)香菌初篩

以組織塊分離法、組織勻漿法和富集分離法分別從荔枝果肉中分離產(chǎn)香菌，均分離培養(yǎng)得到單一菌株。將從荔枝果肉中分離純化得到的單一菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，經(jīng)感官評價對產(chǎn)香菌進(jìn)行篩選，初篩出6株具有較高產(chǎn)香能力的菌株(表1)。由表1可知，荔枝ZFF1具有果香，但其香氣較淡，有酸味，且不清新；其余5株菌株均具有發(fā)酵香或米酒香，其中，荔枝ZYF3香氣最為濃郁。初篩的產(chǎn)香菌產(chǎn)米酒香的較多，推測這幾株產(chǎn)香菌可能為酵母菌，但各菌株的香氣濃郁程度和類型仍然存在一定差別。通過3種常規(guī)的真菌分離方法均分別從荔枝果肉中僅分離出2株產(chǎn)香能力較高的菌株，這說明荔枝果肉中產(chǎn)香菌株偏少。

表1 茶用荔枝產(chǎn)香菌株產(chǎn)香能力初篩結(jié)果

注：+代表香氣濃度，+越多表示香氣濃度越大。

Note:+ represents the concentration of aroma,and the more + means the more aroma concentration.

2.2 茶用荔枝產(chǎn)香菌復(fù)篩

由表2可知，整體上各接菌發(fā)酵茶綜合得分都高于對照茶樣，說明產(chǎn)香菌對發(fā)酵茶品質(zhì)的形成有促進(jìn)作用。就香氣而言，CK茶樣香氣表現(xiàn)為酸、陳香；C1茶樣香氣表現(xiàn)為純正；接種荔枝ZYF3的發(fā)酵茶樣香氣表現(xiàn)為怡人甜香、略帶煙味；接種荔枝ZFF2的發(fā)酵茶樣香氣表現(xiàn)為豆豉香；其余4株產(chǎn)香菌發(fā)酵茶香氣不突出，說明荔枝ZYF3和ZFF2能夠明顯改善茶葉香型，提高茶葉品質(zhì)。此外，接種荔枝ZYF3發(fā)酵茶樣湯色表現(xiàn)為紅色、明亮，滋味醇和似米湯，綜合得分為75.23；接種荔枝ZFF2發(fā)酵茶樣湯色表現(xiàn)為紅色、略渾，滋味呈豆豉味，綜合得分為75.03。綜上，判定荔枝ZYF3為最佳產(chǎn)香菌。

表2 茶用荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶的感官品質(zhì)Tab.2 Sensory quality of fermented tea by aroma-producing strains for tea from litchi

2.3 茶用荔枝產(chǎn)香菌株鑒定

2.3.1 茶用荔枝產(chǎn)香菌株形態(tài)特征 利用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法對荔枝ZYF3菌株進(jìn)行鑒定。從圖1可以看出，荔枝ZYF3菌落為白色蠟質(zhì)狀，菌體為藕節(jié)形，個體形態(tài)為橢圓形，細(xì)胞表面光滑，無鞭毛，質(zhì)地較均勻，大小為2～5 μm。綜上，推測荔枝ZYF3為酵母菌。

圖1 茶用菌株荔枝ZYF3的菌落(A)、電子顯微鏡(B)和光學(xué)顯微鏡(C)觀察結(jié)果Fig.1 Observation by colony (A),electron micrograph (B) and micrograph (C) of aroma-producing strain ZYF3 suitable for tea from litchi

2.3.2 茶用荔枝產(chǎn)香菌株分子生物學(xué)鑒定 26S rDNA(D1/D2區(qū)域)位于酵母核糖體大亞基的5′端，大小在600 bp左右，這段區(qū)域具有較高的變異率。同種菌株26S rDNA(D1/D2區(qū)域)核苷酸差異率較小，不同種菌株差異率較大，因此，常利用26S rDNA(D1/D2區(qū)域)序列進(jìn)行親緣關(guān)系較近的菌株分類研究。利用PCR技術(shù)獲得ZYF3菌株的26S rDNA(D1/D2區(qū)域)序列，根據(jù)不同微生物序列的相似性獲得系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[17]。由圖2可以看出，ZYF3菌株的26S rDNA(D1/D2區(qū)域)序列與泰國有孢漢遜酵母(Hanseniasporathailandica)的相似性最高，為100%。結(jié)合菌體形態(tài)特征，判定荔枝ZYF3為泰國有孢漢遜酵母。

圖2 基于26S rDNA(D1/D2區(qū)域)序列的茶用產(chǎn)香菌ZYF3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of aroma-producing strain ZYF3 suitable for tea from litchi based on 26S rDNA(D1/D2 region) sequences

3 結(jié)論與討論

新鮮荔枝是常見的鮮食水果，香味獨(dú)特。目前，國內(nèi)外對荔枝內(nèi)生真菌的研究主要集中于內(nèi)生真菌生物防治[18]和荔枝采后保鮮處理[19]方面，但依然有關(guān)于荔枝內(nèi)生真菌產(chǎn)香的研究[20-21]。周麗娟等[20]從新鮮荔枝中分離出4株產(chǎn)香菌，優(yōu)選出的Lizhi-01菌株主要香氣成分為β-苯乙醇，其次為糠醛及十六酸，其發(fā)酵制得的香精可使香煙具有明顯的柔和煙氣，并提高煙氣細(xì)膩性和甜潤感。邊金勇等[21]從荔枝果皮和荔枝干等樣品中分離到多株野生酵母菌株，優(yōu)選出的酵母菌株10-05在發(fā)酵能力和口感風(fēng)味方面均強(qiáng)于市售活性干酵母，可用于發(fā)酵風(fēng)味獨(dú)特的荔枝果酒。由此可見，荔枝中可以篩選出產(chǎn)香菌。本研究結(jié)果表明，荔枝是篩選產(chǎn)香菌的適宜材料。

本研究從荔枝果肉中篩選出的最優(yōu)產(chǎn)香菌，經(jīng)鑒定為泰國有孢漢遜酵母。泰國有孢漢遜酵母廣泛存在于很多水果中，并被用來增香發(fā)酵。如李豪等[22]從自然發(fā)酵的草莓果酒中分離鑒定出泰國有孢漢遜酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)。楊瑩等[23]發(fā)現(xiàn)廣西野生葡萄發(fā)酵2 d前僅有泰國有孢漢遜酵母存在，其是啟動葡萄發(fā)酵的菌株。趙海霞等[24]從蘋果園土壤中篩選出產(chǎn)香菌，并可發(fā)酵制得風(fēng)味優(yōu)異的蘋果酒，將最佳產(chǎn)香菌鑒定為泰國有孢漢遜酵母。泰國有孢漢遜酵母屬于有孢漢遜酵母屬，該屬的酵母發(fā)酵能力強(qiáng)、產(chǎn)酯產(chǎn)香良好、可以增加發(fā)酵品的風(fēng)味[23]。由此可見，泰國有孢漢遜酵母屬于安全菌株，可應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)香。

本研究中泰國有孢漢遜酵母是經(jīng)過固態(tài)茶葉發(fā)酵后復(fù)篩出來的，表明其能耐受茶葉的抑菌活性，且生長良好，表明可應(yīng)用于茶葉發(fā)酵產(chǎn)香。除產(chǎn)香外，酵母菌可在茶葉發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化代謝。眾所周知，酵母菌富含氨基酸、B族維生素等活性成分，產(chǎn)香發(fā)酵后，無疑可給發(fā)酵茶增香，并增添很多活性成分，有利于開發(fā)特色發(fā)酵茶產(chǎn)品。當(dāng)前，我國夏秋茶資源浪費(fèi)嚴(yán)重，借助泰國有孢漢遜酵母對夏秋茶進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，有望促進(jìn)夏秋茶資源的高效開發(fā)利用。