彭 婷，李星星，童榮生,2，師健友,2

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610054;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072)

癌癥是威脅人類健康和生命的三大類疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，到2030年，全球因癌癥死亡的人數(shù)將達(dá)到1310萬(wàn)。癌癥的一般治療手段包括放療，化療和手術(shù)治療，在癌癥晚期，病人只能依賴放射治療和化療也就是藥物治療。而以上的傳統(tǒng)治療方式因其毒副作用大，預(yù)后很差，使患者難以受益[1]。 亟需尋找更為有效、副作用小的靶向治療手段。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)技術(shù)設(shè)計(jì)并合成了化合物DN-4，已通過(guò)體外藥理實(shí)驗(yàn)證明，DN-4對(duì)多種不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞具有抑制其增殖的作用，對(duì)人肺癌A549細(xì)胞、H1299細(xì)胞、人胃癌HGC-27細(xì)胞以及小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞均表現(xiàn)良好的抑制作用。

多種體外實(shí)驗(yàn)均顯示，化合物DN-4是抗癌治療的極具潛力的活性化合物。研制一條快捷簡(jiǎn)便、實(shí)用的合成方法快速合成大量化合物，對(duì)于活性化合物的制備以及后續(xù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)研究十分必要。

1 材料與方法

1.1 材料Bruker Avance 400 型核磁共振波譜儀(TMS 為內(nèi)標(biāo)，DMSO-d6 為溶劑)；Waters e2695-2998 系列高效液相色譜儀(PDA 檢測(cè)器，美國(guó) Waters 公司)；UPLC-Q Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(Thermo Fisher Scientific公司)；YRT—3 型熔點(diǎn)儀(天大天發(fā)科技有限公司)；3，5-二硝基苯甲酸和2-三氟甲基苯胺均購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；其余所用試劑為市售分析純；所用試劑均無(wú)需處理。實(shí)驗(yàn)時(shí)間2018年7～10月。

1.2 方法

1.2.13，5-二硝基苯甲酰氯(化合物2)的合成 向裝有攪拌器、回流冷凝管和滴液漏斗的三口瓶中依次加入21.2(100 mmol)3，5-二硝基苯甲酸(化合物1)、300 ml氯化亞砜(SOCl2)和20 ml N，N-二甲基甲酰胺，90 ℃下加熱回流反應(yīng)1.5 h，停止反應(yīng)。向反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入適量CH2Cl2減壓濃縮除去SOCl2，重復(fù)三次，得3，5-二硝基苯甲酰氯(化合物2)粗品，直接用于下一步。

1.2.23，5-二硝基-N-(3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺(化合物3)的合成 向裝有攪拌器、回流冷凝管和滴液漏斗的三口瓶中加入16.1 g (100 mmol)間三氟甲基苯胺、26 g (200 mmol)N，N-二異丙基乙胺(DIEA)、300 ml 溶劑(THF/1，4-二氧六環(huán)/CH2Cl2/DMF)，置于冷肼內(nèi)冷卻至0 ℃以下，攪拌，滴加“2.1”制備的化合物2粗品和CH2Cl2300 ml的混合物。加畢，室溫下攪拌2小時(shí)，加入甲醇15 ml，用2 mol/L鹽酸200 ml洗滌，收集有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，固體用少量乙酸乙酯-己烷(1∶2)洗滌。

1.2.33，5-二氨基-N-(3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺(DN-4)的合成 水合肼還原法具體操作如下：向裝有攪拌器、回流冷凝管和滴液漏斗的三口瓶中依次加入7.1 g(20 mmol)化合物3，30 ml 無(wú)水乙醇，80 mmol的水合肼，適量10%Pd/C，80 ℃加熱回流反應(yīng)3.5 h，趁熱抽濾，除去Pd/C，濃縮濾液得產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用乙醇-水重結(jié)晶，析出棕褐色沉淀，抽濾，干燥。鐵粉還原法具體操作為：向裝有攪拌器、回流冷凝管和滴液漏斗的三口瓶中依次加入6.7 g(20 mmol)化合物3，40 ml 水和乙醇的混合物(水∶無(wú)水乙醇=1∶3)，1.07 g(20 mmol)氯化銨、2.24 g(40 mmol)鐵粉，65 ℃加熱回流4 h。見(jiàn)圖1。

圖1 化合物DN-4的合成路線

2 結(jié)果

2.1 溶劑對(duì)3，5-二硝基-N-(3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺(化合物3)產(chǎn)率影響幾種常用溶劑對(duì)反應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。除1，4-二氧六環(huán)做溶劑外，其他溶劑在不同工藝下對(duì)產(chǎn)率的影響不大，產(chǎn)率較高。

表1 溶劑對(duì)3，5-二氨基-N-取代苯甲酰氯(化合物3)產(chǎn)率影響

2.2 3，5-二氨基-N-(3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺(DN-4)的合成方法采用水合肼還原法和金屬還原法(鐵粉還原法)進(jìn)行3，5-二硝基-N-取代苯甲酰胺還原為3，5-二氨基-N-取代苯甲酰胺的還原方法考察，結(jié)果鐵粉還原的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高于水合肼還原法，但在實(shí)際的后處理過(guò)程中，鐵粉還原法后處理萃取過(guò)程中產(chǎn)物不易萃出，且鐵粉不易除去，產(chǎn)物損失較多，實(shí)際產(chǎn)率低于水合肼還原法。見(jiàn)表2。

表2 3，5-二氨基-N-取代苯甲酰胺(DN-4)的合成方法

2.3 水合肼還原法的反應(yīng)條件按照水合肼還原法操作，分別考察反應(yīng)時(shí)間、溫度和水合肼用量對(duì)反應(yīng)的影響。反應(yīng)結(jié)果顯示：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)率增加，但反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3.5 h，再繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，產(chǎn)率無(wú)明顯變化；同樣，當(dāng)溫度增加至80 ℃，水合肼量增加至4倍量時(shí)，繼續(xù)增加，產(chǎn)物產(chǎn)率無(wú)明顯變化。綜合考慮產(chǎn)品收率與生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率等因素，最終選擇10% Pd/C催化，4倍量水合肼在乙醇溶劑中80 ℃回流3.5 h，還原化合物3。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)率增加，但反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3.5 h，再繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，產(chǎn)率無(wú)明顯變化；同樣，當(dāng)溫度增加至80 ℃，水合肼量增加至4倍量時(shí)，繼續(xù)增加，產(chǎn)物產(chǎn)率無(wú)明顯變化。見(jiàn)表3～表5。

表3 不同反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物收率(溫度80 ℃，水合肼量40 mmol)

表4 不同反應(yīng)溫度的產(chǎn)物收率(反應(yīng)時(shí)間3.5 h，水合肼量40 mmol)

表5 不同水合肼量的產(chǎn)物收率(反應(yīng)時(shí)間3.5 h，反應(yīng)溫度90 ℃)

2.4 擴(kuò)試在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將原料1的投料量擴(kuò)大 5 倍即21.2 g (0.1 mol)，按照優(yōu)化條件后的反應(yīng)條件進(jìn)行操作，平行實(shí)驗(yàn) 3 次，分別得到3，5-二氨基-N-取代苯甲酰胺(化合物4)26.9 g、26.5 g、26.8 g，收率分別為 91.2 %、89.7 %、90.8 %，擴(kuò)試平均產(chǎn)量為26.7 g 、收率為 90.6%，擴(kuò)試結(jié)果顯示收率較高，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.5 化合物DN-4特征性分析熔點(diǎn)：188.4-189.0 ℃；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ 10.28 (s，1 h)，8.23 (d，J = 1.9 Hz，1 h)，8.01 (dd，J = 8.2，2.0 Hz，1 h)，7.55 (t，J = 8.0 Hz，1 h)，7.39 (d，J = 7.6 Hz，1 h)，6.31 (d，J = 2.0 Hz，2 h)，6.01 (t，J = 2.0 Hz，1 h)，4.98 (s，4 h)。13C NMR (101 MHz，DMSO-d6) δ 168.13，149.68，140.87，136.72，130.31-129.51 (m)，123.85，119.82，116.42，102.73。HRMS (ESI-MS) m/z：(M+H)+296.0992。

3 討論

3，5-二硝基苯甲酰氯在CH2Cl2，THF等常用溶劑中溶解性不好，導(dǎo)致產(chǎn)率降低。根據(jù)文獻(xiàn)[2～4]，研究了幾種常用溶劑對(duì)反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，除用1，4-二氧六環(huán)做溶劑外，其他溶劑在不同工藝下對(duì)產(chǎn)率的影響不大，產(chǎn)率較高。所有反應(yīng)在室溫下反應(yīng)2 h后再繼續(xù)反應(yīng)對(duì)產(chǎn)率提高無(wú)明顯效果。在此反應(yīng)中，3，5-二硝基苯甲酰氯在DMF中溶解度最高，但由于DMF沸點(diǎn)高，且具有良好的水溶性，后處理非常麻煩；雖然在CH2Cl2中溶解度一般，但可以滿足反應(yīng)進(jìn)行，且產(chǎn)率最高，后處理簡(jiǎn)單。

目前，大部分硝基化合物可直接經(jīng)由還原反應(yīng)制得相應(yīng)氨基化合物。相關(guān)文獻(xiàn)研究表明[5～7]，常用的硝基還原反應(yīng)的方法主要有：水合肼還原法、金屬還原法、催化加氫還原法、硫化堿還原法等。我們?cè)趯?shí)際實(shí)驗(yàn)操作中考慮到催化加氫還原法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)條件(溫度和壓力)要求均較高。同時(shí)也考慮到硫化堿還原法易產(chǎn)生毒性氣體，且還原效率并不高。鐵粉還原的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率相對(duì)于水合肼還原法更高，但在實(shí)際的后處理過(guò)程中，鐵粉還原法后處理萃取過(guò)程中產(chǎn)物不易萃出，且鐵粉不易除去，產(chǎn)物損失較多，實(shí)際產(chǎn)率略低于水合肼還原法。另外，鐵粉還原過(guò)程中產(chǎn)生污染物鐵泥對(duì)環(huán)境不利。水合肼還原硝基反應(yīng)簡(jiǎn)單易行、無(wú)污染；原料廉價(jià)易得。因此我們選擇操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)可行性更好，產(chǎn)率較高的水合肼還原法作為3，5-二硝基-N-取代苯甲酰胺的還原方法。進(jìn)一步對(duì)水合肼還原法的反應(yīng)時(shí)間、溫度和水合肼用量進(jìn)行考察，綜合考慮產(chǎn)品收率與生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率等因素，最終選擇10% Pd/C催化，4倍量水合肼在乙醇溶劑中80 ℃回流3.5 h，還原3，5-二硝基-N-(3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺。

3，5-二氨基-N-(3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺的制備過(guò)程中，無(wú)需特殊試劑和條件，通過(guò)重結(jié)晶技術(shù)對(duì)化合物反復(fù)純化，不再使用層析柱分離，操作更簡(jiǎn)便，效率更高，更有利應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。經(jīng)過(guò)以上條件調(diào)整和改進(jìn)使得整個(gè)工藝過(guò)程條件溫和，收率高，對(duì)環(huán)境友好，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。