徐重新 張存政 劉媛 張霄 仲建鋒 劉賢金

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地全與營養(yǎng)研究所-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014）

食源致病微生物是伴隨食品、食用農(nóng)產(chǎn)品整個(gè)產(chǎn)供過程的關(guān)鍵潛在生物危害因素，嚴(yán)重威脅食品、食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，給人類和動(dòng)物健康造成嚴(yán)重危害。食源致病微生物一方面通過污染食品、食用農(nóng)產(chǎn)品，使其發(fā)生腐敗、變質(zhì)，直接損害產(chǎn)品品質(zhì)，給產(chǎn)業(yè)造成巨大浪費(fèi)和損失；另一方面以食品、食用農(nóng)產(chǎn)品為載體或傳播媒介，通過病原體直接或者代謝的毒素間接損害機(jī)體，引起腸胃疾病、器官衰竭乃至誘發(fā)癌癥等臨床癥狀［1-2］，是人類和動(dòng)物日常疾病最主要誘因之一。因此，對食源致病微生物的安全有效防控，是保障食品、食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的必要手段，直接關(guān)乎老百姓“舌尖上的安全”和食品、食用農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)可持續(xù)發(fā)展，是廣大科研工作者努力探索研究的目標(biāo)，更是不可推卸的社會(huì)責(zé)任。

傳統(tǒng)抗生素對致病微生物防控發(fā)揮著極其重要的作用，特別是發(fā)現(xiàn)初期，抗生素在人類和動(dòng)物疾病治療乃至食品、農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮上都發(fā)揮了巨大作用；但近幾十年來，由于濫用，其帶來的副作用及導(dǎo)致的病原菌耐藥性問題日益凸顯，嚴(yán)重威脅到了人類和動(dòng)物健康乃至生態(tài)安全［3-4］。目前，多數(shù)抗生素在食品、食用農(nóng)產(chǎn)品中都屬于禁限用藥物?？咕锘钚噪淖鳛橐活惥哂锌咕δ艿纳锒嚯念惖鞍踪|(zhì)，被普遍認(rèn)為是對人類和動(dòng)物以及生態(tài)環(huán)境安全的有望替代抗生素用于防控致病微生物的新型安全抗菌類藥物，在生物醫(yī)藥和食品、農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮等領(lǐng)域具有重大挖掘潛力和應(yīng)用價(jià)值，越來越受到科研工作者的關(guān)注［5-6］。

近年來，世界各國科研工作者對抗菌生物活性肽的有關(guān)研究蓬勃發(fā)展，現(xiàn)已從傳統(tǒng)的生物體內(nèi)分離制備天然抗菌肽逐漸向從大容量多肽庫中特異性高通量靶向淘篩人工合成抗菌多肽發(fā)展的趨勢［7-9］?；诖耍疚膶咕锘钚噪脑谑吃粗虏∥⑸锓揽厣系难芯繝顩r進(jìn)行系統(tǒng)綜述；并結(jié)合作者及所在科研團(tuán)隊(duì)相關(guān)課題成果，探討了當(dāng)前抗菌生物活性肽創(chuàng)制存在的主要問題并提出了擬解決對策，旨在為快速高效研發(fā)具有可用于食品、食用農(nóng)產(chǎn)品致病微生物防控的新型安全抗菌生物活性肽提供新思路和可行性建議。

1 食源致病微生物主要類型及其安全風(fēng)險(xiǎn)

食源致病微生物可分為食源致病病毒、食源致病細(xì)菌、食源致病真菌以及其他較為高等的食源致病病原蟲等幾大類型，表1即按類別詳細(xì)梳理出了當(dāng)前食品、農(nóng)產(chǎn)品中較為常見的致病微生物及其主要污染特點(diǎn)與危害風(fēng)險(xiǎn)等相關(guān)信息。食源致病病毒中比較典型的有諾如病毒（Norwalk viruses，NV）、甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）以及輪狀病毒（Rotavirus，RV）等，均能引起急性腸胃炎，導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉等癥狀［10-11］；食源致病細(xì)菌中危害最大、分布最廣的是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli），此外還有產(chǎn)劇毒的肉毒桿菌（Clostridium botulinum）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）等也是威脅食物質(zhì)量安全較為嚴(yán)重的致病菌［12-13］；食源致病真菌多數(shù)具有的共性危害特點(diǎn)是代謝真菌毒素，主要污染糧油等農(nóng)作物及其產(chǎn)品，最為典型的有麥類作物中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON，又稱嘔吐毒素）、油料作物中的黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）以及玉米中的玉米赤霉烯酮（Zearalenone，又稱F-2毒素）和伏馬菌素（Fumonisin，F(xiàn)B）等，均屬劇毒高危致癌或致畸類生物毒素，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康，也給糧油產(chǎn)業(yè)造成巨大浪費(fèi)和損失［14-16］。此外，動(dòng)物性食品中還有一些寄生性致病微生物如隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）、賈第蟲（Giardiasis）、旋毛蟲（Trichinella spiralis）、痢疾阿米巴蟲（Entamoeba histolytica）等，也能引起機(jī)體腸道疾病，甚至誘發(fā)臟器衰竭導(dǎo)致致命風(fēng)險(xiǎn)［17-20］。

表1 食源致病微生物常見種類及其主要危害風(fēng)險(xiǎn)

2 抗菌生物活性肽主要來源及特點(diǎn)

抗菌生物活性肽可以分為天然的抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）和人工合成的具有抗菌活性的多肽兩大類型。天然抗菌肽種類多、來源廣，是幾乎存在于所有生物種體內(nèi)的在機(jī)體防御上發(fā)揮重要作用的進(jìn)化保守的特殊多肽，分子量普遍介于2-50 kD之間，其發(fā)揮活性的關(guān)鍵功能區(qū)域往往富含帶正電荷的氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基，形成α-螺旋β折疊及α-β復(fù)合等結(jié)構(gòu)，并通過破壞菌體細(xì)胞膜的通透性及滲入胞內(nèi)后阻礙RNA合成、抑制細(xì)胞骨架關(guān)鍵蛋白酶和細(xì)胞呼吸酶的活性、阻斷蛋白質(zhì)正確折疊的伴侶蛋白和線粒體正常功能等系列級聯(lián)反應(yīng)，最終使得菌體繁殖受到抑制甚至徹底致死［5，21］。據(jù)國際權(quán)威抗菌肽數(shù)據(jù)庫（Antimicrobial peptide database，APD；http：//aps.unmc.edu/AP/）最新收錄信息顯示：目前登記收錄的各類抗菌肽數(shù)量已達(dá)3 027種，其中2 236種源于動(dòng)物，344種源于植物，336種源于微生物，18種源于真菌，8種源于原生生物，4種源于古生菌；其中較為典型并可歸類的有Cathelicidins、Cecropins、Magainins和 BuforinⅡ等家簇抗菌肽，以及魚黏液類、防御素類和細(xì)菌類抗菌肽等（表2）。人工合成的具有抗菌活性的多肽則是伴隨基因工程抗體創(chuàng)制和特異性抗體高通量篩選技術(shù)發(fā)展而來的具有模擬傳統(tǒng)抗生素功能的新型安全抗菌生物活性肽，來源一般是依附微生物全細(xì)胞或特定抗生素在靶標(biāo)微生物上的受體為包被靶點(diǎn)，然后從各類多肽庫中靶向篩選獲得（表2）；據(jù)公開報(bào)道可查的人工抗菌生物活性肽氨基酸序列分析，其發(fā)揮抗菌活性區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸組成也普遍符合天然抗菌肽的特點(diǎn)，抗菌機(jī)制也較為類似［22］，目前該類研究尚處于探索嘗試階段，文獻(xiàn)報(bào)道也相對較少。

3 抗菌生物活性肽創(chuàng)制技術(shù)實(shí)例及其抗菌特點(diǎn)

抗菌生物活性肽創(chuàng)制技術(shù)大致可以分為隨機(jī)篩選和靶向篩選兩種方式（表3），且創(chuàng)制的抗菌生物活性肽材料普遍具有廣譜抗菌活性的特點(diǎn)。天然抗菌肽以從生物體特定組織、器官或分泌物中隨機(jī)篩選較為常見，如Murakami等［23］和 Gao等［24］分別從人乳和鴨體內(nèi)隨機(jī)篩選到了Cathelicidin家族的抗菌肽材料，Li等25］、Nayak 等［26］、Lee 等［27］和Meamarpoor-Yazdi等［28］分別從鯰魚、家蠶、蜈蚣和隱翅蟲體內(nèi)隨機(jī)篩選到了相應(yīng)抗菌肽，均對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較強(qiáng)抑菌活性；近年也有采用致病微生物特性蛋白或活性脂質(zhì)體作為靶點(diǎn)進(jìn)行靶向篩選的報(bào)道［29-31］。人工抗菌生物活性多肽創(chuàng)制技術(shù)幾乎都是通過微生物全細(xì)胞或特性蛋白作為包被靶點(diǎn)，從多肽庫中靶向篩選獲得，其抗菌活性往往具有靶向特異性抗菌譜的特點(diǎn)，如Pini等［32］、Rao等［33］和 Bishop-Hurley等［34］以大腸桿菌和空腸彎曲菌全細(xì)胞為包被靶點(diǎn)，從噬菌體展示的10肽、12肽和15肽庫中分別篩選到了對應(yīng)人工抗菌多肽；Zoeiby 等［35］、Tanaka 等［36］、Wang 等［37］和 Hart等［38］分別以綠膿桿菌MurC酶蛋白、趨磁細(xì)菌BacMPs磁性蛋白、乙型肝炎病毒PreS1蛋白和金黃色葡萄球菌lipid II蛋白為包被靶點(diǎn)，均從噬菌體展示多肽庫中篩選到了對應(yīng)的人工抗菌多肽。而Tucker等［9］則將天然抗菌肽與細(xì)菌表面展示多肽庫技術(shù)相結(jié)合，通過構(gòu)建的抗菌肽庫與微生物互作，實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)微生物靶向抗菌多肽自動(dòng)篩選與進(jìn)化的重要突破，為靶向高效創(chuàng)制抗菌活性肽提供了捷徑。

4 抗菌生物活性肽在食源致病微生物防控中的應(yīng)用研究狀況

目前抗菌生物活性肽在食源致病微生物防控上的應(yīng)用研究主要集中在替代農(nóng)獸藥防控動(dòng)植物病害和食品、農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮等兩大領(lǐng)域；就抗菌生物活性肽類型來看，目前以傳統(tǒng)天然抗菌肽為主，而人工抗菌多肽則尚無公開報(bào)道的文獻(xiàn)（表4）。在替代農(nóng)獸藥防控動(dòng)植物病害的應(yīng)用研究方面，抗菌肽測試對象涉及防控農(nóng)作物病害、動(dòng)物疫病以及調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫機(jī)能等方面，使用方法涵蓋轉(zhuǎn)基因［45-46］和制劑噴灑［47］、灌注［48］及拌料喂養(yǎng)［49-50］等，對靶標(biāo)病害均具有一定防控效果；在這類應(yīng)用當(dāng)中，天然抗菌肽材料因其對應(yīng)編碼的基因信息明確，理論上完全可用于跨物種克隆表達(dá)，因此在轉(zhuǎn)基因抗菌作物改造上具有極大挖掘潛力和廣闊的市場應(yīng)用價(jià)值，這在當(dāng)前已成熟并實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)Bt作物上已有先例可循，有望推進(jìn)抗菌肽的創(chuàng)新應(yīng)用。在食品、農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮的應(yīng)用研究方面，各種源于動(dòng)物［51］、植物［52］、微生物［53-54］等生物體的天然抗菌肽在均有應(yīng)用研究的報(bào)道，其中新鮮農(nóng)產(chǎn)品的防腐保鮮以控制霉菌為主，而食品特別是肉制品的防腐保鮮則以控制細(xì)菌為主（如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、李斯特菌和沙門氏菌等），供試抗菌肽對相應(yīng)測試的食品、農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮效果均較為顯著，其中乳酸鏈球菌素和別-聚賴氨酸兩類抗菌肽已被批準(zhǔn)作為食品添加劑用于食品、農(nóng)產(chǎn)品的防腐保鮮［55］。理論上來說，只要對食源性致病菌有防控效果的抗菌生物活性肽均具有應(yīng)用于食品防腐保鮮的潛力，但因食品、食用農(nóng)產(chǎn)品的特殊屬性，抗菌生物活性肽作為食品防腐劑的準(zhǔn)入要求極為嚴(yán)苛，因此短期內(nèi)抗菌生物活性肽在食品防腐保鮮中的實(shí)際應(yīng)用仍然任重而道遠(yuǎn)。此外，近年抗菌生物活性肽還有被用于食品活性包裝袋材料輔助防控食品面源致病微生物的報(bào)道［56］，這是抗菌生物活性肽在食品中食源致病微生物防控應(yīng)用上的新動(dòng)態(tài)；且抗菌生物活性肽作為包裝材料使用，其在食品致病微生物防控領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢，更容易被政府監(jiān)管部門和廣大消費(fèi)者所認(rèn)可，有望快速投入使用，市場前景一片大好。

表2 抗菌生物活性肽主要類型及其來源和特點(diǎn)

表3 抗菌生物活性肽創(chuàng)制研究的實(shí)例

表4 抗菌生物活性肽在食源致病微生物防控中的應(yīng)用研究實(shí)例

5 結(jié)語

抗菌生物活性肽作為源于生物體或人工合成的具有抗菌功能的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，其在生物毒性和環(huán)境安全性方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素，被普遍認(rèn)為是有望替代或輔助抗生素用于致病微生物防控的安全抗菌材料，具有極大的挖掘潛力和廣闊的應(yīng)用前景。然而，盡管報(bào)道的抗菌肽種類和數(shù)量很多，相關(guān)探索性應(yīng)用研究也在不斷跟進(jìn)，但能夠?qū)崿F(xiàn)商品化應(yīng)用的材料卻很少，美國FDA在過去數(shù)十年間只批準(zhǔn)了十幾種抗菌生物活性肽類藥品［5］，可用于食品、農(nóng)產(chǎn)品致病微生物防控級別的產(chǎn)品更是少之又少。究其原因，抗菌生物活性肽普遍存在制備困難、活性弱、穩(wěn)定性差以及生物安全潛在危害風(fēng)險(xiǎn)等問題或爭議，是當(dāng)前制約其在食源致病微生物防控上應(yīng)用的最主要因素。針對這些問題，以下對策可供參考。

5.1 借鑒基因工程抗體庫創(chuàng)制思路，拓展抗菌生物活性肽高通量篩選方法

微生物表面展示多肽庫技術(shù)（如噬菌體表面展示、細(xì)菌表面展示、酵母表面展示等）是近年蓬勃發(fā)展的人工多肽創(chuàng)制技術(shù)，其可以將任何多肽進(jìn)行展示構(gòu)成大容量庫，然后通過包被靶點(diǎn)從庫中高通量靶向篩選具有靶標(biāo)特異性的多肽及其相應(yīng)基因材料，這為抗菌生物活性肽人工高通量靶向篩選提供了全新的路徑，現(xiàn)已有相關(guān)探索研究的報(bào)道。

5.2 依托抗獨(dú)特型抗體創(chuàng)制理論，靶向設(shè)計(jì)模擬抗生素功能的抗菌生物活性肽

1974年，Jerne 首次提出“免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說”，認(rèn)為在動(dòng)物免疫系統(tǒng)中，采用抗體免疫后，通過級聯(lián)反應(yīng)能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生具有抗原獨(dú)特型的抗體，其中“β”型的抗獨(dú)特型抗體具有抗原“內(nèi)影像”效應(yīng)，即具有與抗原相同的抗原決定簇，從而可以模擬特定抗原決定簇分子構(gòu)象及乃至其生物活性的功能；隨后Nisonoff 和Lamoyi 進(jìn)一步證實(shí)抗獨(dú)特型抗體具有能替代抗原誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的作用［70］；目前國內(nèi)外在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)昆蟲防控領(lǐng)域已有成功的報(bào)道［71-75］。其中，作者所在科研團(tuán)隊(duì)，借助抗獨(dú)特型抗體技術(shù)路徑，從人源噬菌體展示多肽庫中成功創(chuàng)制出了具有模擬Bt Cry系列殺蟲蛋白抗蟲功能的人工抗蟲肽材料，現(xiàn)已獲得國家發(fā)明專利和國際PCT專利授權(quán)；這為靶向創(chuàng)制具有模擬抗生素（特別是多肽類抗生素，如萬古霉素）抗菌功能的新型安全抗菌生物活性肽材料提供了方向。

5.3 借助抗體體外親和成熟技術(shù)，推進(jìn)抗菌生物活性肽的定向修飾

借助蛋白質(zhì)分子對接模擬軟件，預(yù)測抗菌生物活性肽關(guān)鍵活性位點(diǎn)的氨基酸信息，采用多種抗體體外親和力成熟技術(shù)（如定點(diǎn)突變）對多肽進(jìn)行突變改造，并結(jié)合基因工程多肽展示庫技術(shù)和特異性多肽高通量篩選技術(shù)，進(jìn)一步篩選高活性的突變體。如 Zhang 等［76］、Schier等［77］和 Bardera 等［78］均采用分子對接模擬分析然后借助定點(diǎn)突變技術(shù)對母體單鏈抗體基因結(jié)合位點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變改造，分別將多肽親和力提高了4、145和454倍；這為抗菌生物活性肽活性改造提供了思路，有望助推其實(shí)用性價(jià)值。