左彤彤，李興鵬，周春艷，宋麗文

(1. 吉林省林業(yè)科學(xué)研究院，長(zhǎng)白山動(dòng)物資源與生物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130033；2. 露水河林業(yè)局，吉林 白山 134506)

紅松Pinuskoraiensis是我國(guó)珍貴的用材林樹種，也是重要的經(jīng)濟(jì)林樹種。但近年來(lái)，以果梢斑螟Dioryctriapryeri和球果尺蛾Eupitheciaabietaria為主的紅松球果害蟲發(fā)生猖獗，東北地區(qū)紅松球果受害率可達(dá)40%，種子損失率在25%以上，大幅降低紅松籽的產(chǎn)量與質(zhì)量，嚴(yán)重影響紅松林的天然更新能力及紅松籽產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也影響了森林的生態(tài)功能和社會(huì)效益。

植物次生代謝物質(zhì)是植物與病蟲害長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，對(duì)提高植物抗性具有重要作用的一類物質(zhì)，植物對(duì)昆蟲的防御是通過(guò)害蟲脅迫引起植物生理的應(yīng)激反應(yīng)[1]，植物體內(nèi)變動(dòng)著的次生物質(zhì)影響著昆蟲的行為、生長(zhǎng)和發(fā)育[2]，對(duì)植食性昆蟲具有毒殺、拒食、不育、引誘或趨避等作用。單寧、酚類和黃酮類物質(zhì)均是重要的次生代謝物質(zhì)。單寧可以抵御害蟲和病原微生物的攻擊[3]，對(duì)害蟲的發(fā)生起主要抑制作用[4]；酚類物質(zhì)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)，有些專為植物抵御病蟲侵染而產(chǎn)生[5]，有的則直接作為植物構(gòu)成抗性而發(fā)揮作用[6]；黃酮具有毒害作用，可以影響昆蟲正常代謝過(guò)程，致其中毒甚至死亡，具有趨避和拒食作用[7]。

本研究按照紅松球果害蟲的生活史，測(cè)定南亞、中亞和北亞種源健康與被害紅松的韌皮部和球果中單寧、總酚和黃酮含量，結(jié)合紅松球果害蟲危害率，探討3種不同地理種源健康與被害紅松主要次生代謝產(chǎn)物的含量差異及其與紅松被害率的相關(guān)性，為紅松果材林的經(jīng)營(yíng)管理和害蟲防治提供理論參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紅松球果被害率調(diào)查與樣品采集 實(shí)驗(yàn)地位于露水河林業(yè)局宏偉紅松種子園內(nèi)，9月采集球果，隨機(jī)選取南亞、北亞、中亞3個(gè)紅松無(wú)性系種源各50株,調(diào)查每株紅松球果的受害與健康數(shù)量，統(tǒng)計(jì)球果被害率；解剖被害球果，調(diào)查球果尺蛾和果梢斑螟的危害比例。結(jié)合球果害蟲生活史不同時(shí)期的危害部位，7月采集各紅松種源健康和被害球果樣品，10月采集健康和被害枝梢的韌皮部，每個(gè)種源隨機(jī)選取樣株5株，按照上、中、下3層，東、南、西、北4個(gè)方位采集。

1.2 3種次生代謝產(chǎn)物的提取測(cè)定

1.2.1 單寧的提取測(cè)定 取兒茶素0.05 g放入離心管，加入70%甲醇5 mL，封口搖勻，常溫靜置24 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液待測(cè)。取0.5 mL待測(cè)液加入4%香草醛的甲醇溶液3 mL和濃鹽酸1.5 mL，搖勻，20 ℃水浴20 min，在510 nm處測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)全程遮光操作[8]。

取兒茶素10 mg，配制成0，25，35，45，55，65，75 μg/mL 的系列梯度溶液，處理后分別測(cè)OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=398.09X-0.136 9，R2= 0.999 1(Y，兒茶素濃度μg/mL；X，吸光度；R，相關(guān)系數(shù))。

1.2.2 總酚的提取測(cè)定 取沒(méi)食子酸0.1 g，加入鹽酸甲醇體積比為1∶100的提取液10 mL，水浴10 min，4 ℃ 放置24 h待測(cè)。取待測(cè)液0.4 mL加入4 mL提取液稀釋10倍搖勻。用754型分光光度計(jì)于280 nm處測(cè)OD值。用回歸方程計(jì)算出總酚的含量[9]。

取沒(méi)食子酸10 mg，配制成0，10，15，20，25，35，45，55 μg/mL的系列溶液，分別取上述溶液用紫外分光光度計(jì)在280 nm處測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程如下：Y=33.46X-1.507 2，R2=0.967 6(Y，沒(méi)食子酸濃度，μg/mL；X，吸光度；R，相關(guān)系數(shù))。

1.2.3 黃酮的提取測(cè)定 取蘆丁0.05 g于10 mL刻度離心管內(nèi)，加入80%乙醇溶液10 mL，70 ℃水浴20 min，4 ℃放置24 h待測(cè)。取待測(cè)液4 mL，加80%乙醇溶液1 mL。然后加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，最后0.4 mL水定容至刻度，放置20 min，在510 nm處測(cè)定吸光度[10]。

取蘆丁14 mg，配制成0，14，19.2，28，32，42，56，60 μg/mL系列梯度溶液，按上述方法處理后分別測(cè)其OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=293.18X-0.069 1，R2=0.997 8(Y，蘆丁濃度，μg/mL；X，吸光度；R，相關(guān)系數(shù))。

T，單寧含量(mg/g);t，由回歸方程所得的單寧含量(mg/mL);P，總酚含量(mg/g);p，稀釋后總酚含量(mg/mL);F，黃酮含量(mg/g);f，由回歸方程所得的黃酮含量(mg/mL);V，提取液的體積(mL);M，稀釋倍數(shù);Q，樣品質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)用 Excel 2010進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)后，用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析和偏相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同地理種源紅松被害率 調(diào)查結(jié)果表明，南亞、北亞和中亞種源紅松均不同程度受到球果害蟲的危害，其中中亞種源的紅松球果被害率顯著高于南亞和北亞種源，達(dá)到47.67%。從果梢斑螟和球果尺蛾的蟲口密度情況分析，在被害球果中，中亞種源紅松球果中球果尺蛾與果梢斑螟被害率與南亞和北亞種源差異顯著，北亞種源與南亞種源無(wú)顯著差異；南亞種源球果尺蛾與果梢斑螟比例為0.30∶1，北亞種源為0.35∶1，而中亞種源為0.87∶1(表1)。

表1 不同種源紅松球果被害率

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同地理種源紅松球果次生代謝產(chǎn)物含量 北亞健康球果單寧含量較高，為23.11 mg /g，與南亞和中亞相比較差異顯著；被害后3個(gè)亞系單寧含量差異不顯著。南亞健康球果的總酚含量與中亞相比差異顯著，而與北亞相比，差異并不顯著；受害球果與健康球果結(jié)果一致，但在同一種源健康與受害球果之間，總酚含量差異顯著。北亞健康球果黃酮含量最高，為13.22 mg/g，但3個(gè)亞系健康球果無(wú)顯著差異；受害之后，黃酮含量均有所上升，但也并無(wú)顯著差異。3個(gè)種源的球果在受到蟲害之后，其單寧、總酚和黃酮含量均有不同程度的上升(表2)。

表2 不同地理種源健康與受害紅松球果次生代謝產(chǎn)物含量

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 不同地理種源紅松韌皮部次生代謝產(chǎn)物含量 北亞健康紅松韌皮部單寧含量最高，較南亞和中亞單寧含量差異顯著；中亞健康與受害樣本單寧含量呈現(xiàn)顯著差異，而北亞及南亞健康與受害樣本之間差異不顯著。3個(gè)種源健康樣本總酚含量差異不顯著，受害后也并無(wú)顯著差異。中亞健康樣本黃酮含量最高，為32.99 mg/g，北亞次之，但在受害后，北亞樣本含量最高，與南亞和中亞相比呈顯著差異。3個(gè)種源的紅松韌皮部在受到蟲害后，其單寧、總酚和黃酮含量均有不同程度的上升(表3)。

表3 不同地理種源健康與受害紅松韌皮部次生代謝產(chǎn)物含量

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 健康紅松不同部位3種次生代謝產(chǎn)物含量與紅松被害率相關(guān)性 健康紅松3種次生代謝產(chǎn)物均與其被害率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，韌皮部的單寧含量及球果的單寧和黃酮含量在0.05水平與其被害率顯著相關(guān)(表4)。

注：*P<0.05顯著相關(guān)

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，不同地理種源中亞、南亞和北亞紅松的健康與被害樣本，其球果和韌皮部的單寧、黃酮和總酚含量均表現(xiàn)出不同程度的差異。在這3個(gè)種源健康樣本中，3種次生代謝產(chǎn)物均與其被害率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，這與很多研究結(jié)果一致。如朱苗苗[11]的研究表明，杏樹受小蠹蟲危害程度與樹皮中的次生代謝物質(zhì)(黃酮、單寧、總酚)質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)性。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，韌皮部與球果部位單寧與黃酮含量差異顯著，這與其球果害蟲危害方式及危害部位相對(duì)應(yīng)，表明紅松樣本本身的單寧與黃酮含量與其抗性直接相關(guān)，偏相關(guān)性分析結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。王偉[12]的研究結(jié)果表明,桉樹葉片的單寧和黃酮含量與桉樹枝癭姬小蜂Leptocybeinvasa有顯著關(guān)系,本研究與其結(jié)果相一致。3個(gè)種源紅松在受到侵害之后，單寧、總酚和黃酮含量總體均表現(xiàn)上升趨勢(shì)，與鄭宏[13]的研究結(jié)論相同，即松樹針葉在受到思茅松毛蟲危害后，針葉黃酮含量，單寧含量和總酚含量與未受害相比，均呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明單寧、總酚和黃酮這3種次生代謝物質(zhì)均在蟲害誘導(dǎo)抗性中發(fā)揮重要的作用，在樣本受到蟲害侵害之后為提高其抗性的表現(xiàn)。但張思祿[14]的研究結(jié)果證實(shí)，粒肩天牛Aprionagermari在危害楊樹初期，黃酮含量下降，在危害盛期，黃酮含量增加，關(guān)于不同危害時(shí)期次生代謝產(chǎn)物含量變化，本實(shí)驗(yàn)未能按照危害時(shí)段進(jìn)行檢測(cè)，也為今后實(shí)驗(yàn)提供思路，更進(jìn)一步細(xì)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

至于在紅松球果害蟲危害紅松過(guò)程中，這3種次生代謝物質(zhì)的表達(dá)途徑和過(guò)程，需要進(jìn)一步研究和探索。研究昆蟲取食誘導(dǎo)后紅松主要次生代謝產(chǎn)物含量的變化，不僅能在理論上加深對(duì)球果尺蛾和果梢斑螟種群動(dòng)態(tài)機(jī)制、與紅松相互關(guān)系、種間種內(nèi)相互作用以及其群落構(gòu)建機(jī)制等的認(rèn)識(shí),還能在實(shí)踐上補(bǔ)充和完善球果尺蛾和果梢斑螟綜合治理，如培育強(qiáng)誘導(dǎo)抗蟲性品種，開發(fā)利用誘導(dǎo)劑等。