張 靜，林錦峰，2，康彩玲，3，張萬明，4

（1.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300；

2.金鳳社區(qū)居委會，福建 德化 362500；

3.德化縣人民政府，福建 德化 362500；4.雅客（中國）有限公司，福建 晉江 362200）

臭豆腐是中國傳統(tǒng)的特色小吃，是一類以大豆為主要原料的發(fā)酵豆制品，從魏到明清時代均有大量史料記載，具有悠久的歷史[1]。臭豆腐可以分為兩大種類，一類是發(fā)酵型臭豆腐，另一類是非發(fā)酵型臭豆腐[2-4]。臭豆腐“聞著臭”是因為大豆蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解，所含的硫氨基酸充分水解，產(chǎn)生硫化氫化合物，這種化合物具有刺鼻的臭味。但蛋白質(zhì)分解后產(chǎn)生氨基酸，又使得口感鮮美“吃著香”[5]。

發(fā)酵型臭豆腐中含有的維生素（vitamin B12，VB12）可以預(yù)防老年癡呆[6]；含有的植物性乳酸菌[7]能夠?qū)δc胃起到調(diào)節(jié)作用；含有的大豆異黃酮具有美容養(yǎng)顏、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防肥胖癥等功效。所以發(fā)酵型臭豆腐因其味道特別，口感好，營養(yǎng)價值高，而廣受歡迎[8-10]。

在傳統(tǒng)臭豆腐加工的基礎(chǔ)上，采用魯氏毛霉（Mucor rouxianus）接種的前發(fā)酵方式[11]，選取協(xié)調(diào)性好且功能和香氣明顯的輔料，加入具有降脂功效的干制荷葉、可以改善口感的干制薄荷和增香明顯的干制茉莉花，以賦予臭豆腐更多的營養(yǎng)價值和不同的感官體驗，為發(fā)酵型臭豆腐的新產(chǎn)品研制提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆、食鹽、油脂：武夷山雙好超市；干制薄荷、干制茉莉花、干制荷葉：武夷山市永暉藥店；毛霉菌粉（魯氏毛霉，有效活菌數(shù)≥110×108個/g）：錦潤生物科技有限公司；鹽鹵：天津市塘沽金輪鹽化有限公司。

平板計數(shù)瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯、7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂平板、腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；血平板：江門市凱林貿(mào)易有限公司；鉛、鉻、鎘標(biāo)準(zhǔn)樣品：國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-1109B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；MDS-6G微波消解儀：上海新儀微波化學(xué)技術(shù)有限公司；UV-3200PC紫外可見光分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZA-3000原子吸收分光光度計：日立高新技術(shù)公司；KDN-CZ定氮儀：上海新嘉電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐加工工藝流程及操作要點

操作要點：

①混合浸提液的制備：分別按照薄荷、茉莉花、荷葉1g、1 g、1 g；1 g、5 g、5 g；1 g、5 g、10 g；5 g、5 g、10 g；5 g、10 g、10 g的比例稱取干制薄荷、干制茉莉花和干制荷葉，放置于4 000 g清水中，沸水煮制5～8 min，晾涼、過濾后備用。

②豆腐坯加工：取飽滿、富有光澤、無蟲蛀、無霉變的大豆500g，洗凈、浸泡，采用用薄荷、茉莉花、荷葉混合浸提液反復(fù)磨漿。豆?jié){經(jīng)過濾后置于鍋中煮沸，冷卻到82～85℃時開始點漿，再經(jīng)過蹲腦、成型制成豆腐[12]。將豆腐切成4.5 cm×4.5 cm×1.5 cm的豆腐坯，備用。

③毛霉菌懸液的配制：稱取1～5g的毛霉菌粉置于無菌燒杯中，添加60 g無菌水，攪拌均勻，轉(zhuǎn)入無菌噴霧器備用。

④前發(fā)酵：將切好的豆腐坯均勻放置于消毒好的雙層鍋中，豆腐之間須保持間隔。將配制好的毛霉菌溶液均勻的噴于每塊豆腐的各個面上，置于15～35℃，相對濕度96%條件下進(jìn)行前期發(fā)酵1～5 d，當(dāng)豆腐表面長有濃密的“白毛”時前發(fā)酵結(jié)束。

⑤搓霉鹽腌：將豆腐坯表面的“白毛”搓平，貼在豆腐塊的表面，形成“皮”，有利于腐乳成型，按層裝入已消毒并烘干的泡菜壇中，每放置一層，豆腐表面撒鹽一次，直至豆腐全部置于壇中，用鹽量為0～200 g，隔水密封3 d。

⑥后發(fā)酵：取出鹽腌完畢的豆腐胚晾干后放在整片荷葉上，用荷葉包緊。再置于洗凈消毒烘干后的泡菜壇中，倒入調(diào)配好的含鹽量6%的黃漿水，以黃漿水淹沒豆腐5 cm為宜[13-14]。最后，使用由石灰和豬血調(diào)配而成的豬血灰封壇。

⑦成品：發(fā)酵約15d后，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到0.4g/（100g）時，發(fā)酵結(jié)束，得到薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐成品。1.3.2前發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

以500 g豆腐坯為基準(zhǔn)，從浸提液中薄荷、茉莉花、荷葉添加量、毛霉菌粉添加量、前發(fā)酵溫度、前發(fā)酵時間、腌制用鹽量五個方面進(jìn)行發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐發(fā)酵單因素試驗。設(shè)置薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量分別為：1 g、1 g、1 g；1 g、5 g、5 g；1 g、5 g、10 g；5 g、5 g、10 g；5g、10g、10 g。毛霉菌粉添加量分別為1 g、2 g、3 g、4 g、5 g。前發(fā)酵溫度分別為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃；前發(fā)酵時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d；腌制用鹽量分別為100 g、150 g、200g、250 g、300 g。以感官評分為評價指標(biāo)，采用單一因素變量法試驗，每組單因素試驗重復(fù)3次，取平均值。1.3.3前發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗[15-16]，以毛霉菌粉添加量（A）、前發(fā)酵溫度（B）、前發(fā)酵時間（C）、腌制用鹽量（D）為影響因素，以感官評分為評價指標(biāo)，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗優(yōu)化，因素與水平如表1所示。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.4 發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐感官評價

制作完成的發(fā)酵臭豆腐油炸后進(jìn)行感官評定。參照國標(biāo)GB 2712—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)豆制品》[17]及商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10527—2009《臭豆腐（臭干）》[18]中感官指標(biāo)要求，結(jié)合薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐自身特點，發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2，滿分100分，所得分?jǐn)?shù)平均值作為感官評分[19]。

表2 發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fermented stinky tofu with peppermint,jasmine and lotus leaf

續(xù)表

指標(biāo) 感官評價要求 分值/分具有臭豆腐顯著的臭味，入口后略帶薄荷的清新口感20～30氣味 臭豆腐的臭味一般，薄荷的清新感不明顯且能明顯感覺10～20（30分） 到荷葉氣味臭豆腐的臭味一般，入口無薄荷感，有其他異味1～10

1.3.5 檢測方法

水分的測定采用直接干燥法；蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法[20]；大腸菌群采用大腸菌群計數(shù)法第一法[21]；鉛含量采用國標(biāo)GB 5009.12—2017《食品中鉛的測定》[22]；鎘含量采用國標(biāo)GB 5009.15—2014《食品中鎘的測定》[23]；鉻含量采用國標(biāo)GB 5009.123—2014《食品中鉻的測定》[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響

圖1 薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of extract addition of peppermint,jasmine and lotus leaf on sensory quality of fermented stinky tofu

由圖1可知，薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量對成品的感官品質(zhì)有影響。當(dāng)薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量均為1 g時，成品臭豆腐僅有薄荷的清涼口感，沒有茉莉花和荷葉的香氣。當(dāng)薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量分別為1 g、5 g、10 g時，成品臭豆腐既有茉莉花和荷葉的香氣，又有薄荷的清涼口感，口感最為協(xié)調(diào)。當(dāng)薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量為5 g、5 g、10 g時，成品臭豆腐薄荷味太明顯，掩蓋了荷葉和茉莉花的清香。當(dāng)薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量分別為5 g、10 g、10 g時，薄荷味掩蓋了荷葉和茉莉花的清香，豆腐坯顏色為黃綠色，顏色過深。因此，選擇薄荷、茉莉花、荷葉浸提液添加量分別為1 g、5 g、10 g。

2.1.2 毛霉菌粉添加量對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響

由圖2可知，毛霉菌粉添加量對成品的感官品質(zhì)有很大的影響，當(dāng)毛霉菌粉添加量為1～3 g時，菌絲生長過程中無法覆蓋豆腐坯的表面；當(dāng)毛霉菌粉添加量為3 g時，發(fā)酵型臭豆腐“白毛”生長適度，豆腐坯的表面剛好被“白毛”所覆蓋，毛霉菌產(chǎn)生的蛋白酶分解豆腐坯中蛋白質(zhì)，使成品臭豆腐具有發(fā)酵型臭豆腐的獨特香味，感官評分最高，為86分；當(dāng)毛霉菌粉添加量＞3 g之后，會產(chǎn)生大量菌絲，使臭豆腐坯的“白毛皮”太厚，導(dǎo)致成品的感官品質(zhì)下降。因此，選擇毛霉菌粉添加量為3 g。

圖2 毛霉菌粉添加量對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of mould powder addition on sensory quality of fermented stinky tofu

2.1.3 前發(fā)酵溫度對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響

圖3 前發(fā)酵溫度對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of pre-fermentation temperature on sensory quality of fermented stinky tofu

由圖3可知，當(dāng)前發(fā)酵溫度在15～25℃時，隨著發(fā)酵溫度的升高，溫度越來越適宜于毛霉菌的生長；當(dāng)前發(fā)酵溫度為25℃時，毛霉菌菌絲生長情況最好，“白毛”可覆蓋整個豆腐坯表面，毛霉菌產(chǎn)生的蛋白酶多，對豆腐坯蛋白質(zhì)分解程度高，成品感官評價分?jǐn)?shù)最高，為87分；當(dāng)前發(fā)酵溫度＞25℃之后，隨著前發(fā)酵溫度的升高，越來越不適宜于毛霉菌的生長，而越來越適宜于嗜溫型細(xì)菌的生長，豆腐坯表面發(fā)黏，不能被“白毛”覆蓋，蛋白質(zhì)分解差，成品感官評價降低。因此，選擇前發(fā)酵溫度為25℃。

2.1.4 前發(fā)酵時間對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響

臭豆腐前發(fā)酵時間對成品的感官品質(zhì)影響很大，前發(fā)酵時間的長短是臭豆腐前發(fā)酵是否進(jìn)行充分的重要控制手段。由圖4可知，在發(fā)酵溫度25℃時，隨著前發(fā)酵時間在1～3 d范圍內(nèi)延長，臭豆腐發(fā)酵程度越好，感官品質(zhì)越來越好；發(fā)酵3 d時發(fā)酵充分，且成品感官評分最高，為86分；前發(fā)酵時間＞3 d之后，發(fā)酵時間太長，毛霉菌菌絲體老化，甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，導(dǎo)致成品的感官品質(zhì)下降。因此，選擇前發(fā)酵時間為3 d。

圖4 前發(fā)酵時間對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響Fig.4 Effects of pre-fermentation time on sensory quality of fermented stinky tofu

2.1.5 腌制用鹽量對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響

食鹽是一種調(diào)味物質(zhì)，被稱為百味之源，食品中添加食鹽后可提高原料風(fēng)味，襯托發(fā)酵產(chǎn)品的香味，并可協(xié)調(diào)其他風(fēng)味物質(zhì)，使產(chǎn)品的風(fēng)味更加鮮美、柔和[25]。由圖5可知，當(dāng)食鹽添加量為100～150 g時，臭豆腐滋味寡淡，特殊的香味不突出；當(dāng)食鹽添加量為150 g時，咸淡適宜，臭豆腐特殊香味突出，成品感官品質(zhì)最佳，感官評分為88分；當(dāng)食鹽添加量＞150 g之后，成品臭豆腐味道太咸，掩蓋了臭豆腐本身的香味，而且食用過多的食鹽易引起高血壓等疾病。綜上所述，食鹽添加量為150 g。

圖5 腌制用鹽量對發(fā)酵型臭豆腐感官質(zhì)量的影響Fig.5 Effects of salt addition on sensory quality of fermented stinky tofu

2.2正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐發(fā)酵工藝進(jìn)行L9（34）正交試驗優(yōu)化，其試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

極差R值的大小可以反應(yīng)出各因素的影響程度，由表3可知，影響發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐發(fā)酵效果的各因素的大小順序為C＞D＞A＞B，即前發(fā)酵時間＞腌制用鹽量＞毛霉菌粉添加量＞前發(fā)酵溫度。根據(jù)極差分析的結(jié)果確定發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐的較優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為A1B2C1D2，即毛霉菌粉添加量2 g、前發(fā)酵溫度25℃、前發(fā)酵時間2 d、腌制用鹽量150 g。對方差分析的較優(yōu)組合A1B2C1D2及正交試驗時得分最高試驗組A1B2C2D2進(jìn)行3次重復(fù)驗證試驗，感官評分分別為（90.8±0.21）分和（93.3±0.15）分。因此發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐的最佳發(fā)酵工藝組合為：A1B2C2D2，即毛霉菌粉添加量2g、前發(fā)酵溫度25℃、前發(fā)酵時間3 d、腌制用鹽量150 g。

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，A（毛霉菌粉添加量）、C（前發(fā)酵時間）、D（腌制用鹽量）均對結(jié)果有極顯著的影響（P＜0.01），B（前發(fā)酵溫度）對結(jié)果有顯著的影響（P＜0.05），且影響的主次順序為C＞D＞A＞B，進(jìn)一步驗證了極差分析的結(jié)果。

2.3 發(fā)酵型臭豆腐品質(zhì)分析

發(fā)酵所得的薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐表面呈黃褐色，油炸后呈金黃色；具有臭豆腐顯著“臭味”；口感酥脆，有荷葉和茉莉花香氣及薄荷的清新口感，無不良滋味。經(jīng)測定發(fā)酵型臭豆腐在最佳工藝條件下的水分為83 g/100 g，蛋白質(zhì)為6.0g/100 g，氨基酸態(tài)氮為0.45 g/100 g，致病菌未檢出，大腸菌群29 MPN/100 g，鉛0.403 3 mg/kg，鎘0.039 1 mg/kg，鉻0.041 8 mg/kg。各指標(biāo)均符合SB/T 10527—2009《臭豆腐（臭干）》中理化指標(biāo)要求及GB 2712—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)豆制品》中衛(wèi)生指標(biāo)要求。

3 結(jié)論

試驗在單因素的基礎(chǔ)上，通過正交試驗對發(fā)酵型薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：500 g黃豆磨漿時，所用的薄荷、茉莉花、荷葉混合浸提液為4 000 g水中加入薄荷1 g、茉莉花5 g、荷葉10 g所得；發(fā)酵工藝參數(shù)為豆腐胚500 g、毛霉菌添加量2 g、前發(fā)酵時間3 d、食鹽150 g、前發(fā)酵溫度25℃。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，發(fā)酵所得的薄荷、茉莉花、荷葉臭豆腐感官評分為93分，呈黃褐色，口感酥脆，有荷葉和茉莉花香氣及薄荷的清新口感。成品質(zhì)量指標(biāo)均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。