李 晶 楊 成

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

近年來，越來越多的肉類食品安全問題被曝出：歐洲的“馬肉事件”、中國(guó)的“假羊肉”事件以及肉產(chǎn)品加工黑作坊的“冒充”事件等，因此，消費(fèi)者對(duì)肉及其加工制品摻雜造假現(xiàn)象的關(guān)注度也呈逐年增加趨勢(shì)。如何判斷肉及其加工食品標(biāo)簽的真實(shí)性，成為越來越多研究者研究的焦點(diǎn)。目前，對(duì)于動(dòng)物源性成分的鑒定主要集中在基于DNA的檢測(cè)方法上，因此，所提基因組DNA質(zhì)量的高低、質(zhì)量濃度的大小直接關(guān)系到檢測(cè)鑒定的效果。盡管已經(jīng)報(bào)道的DNA提取方法有很多，但由于食品樣品基質(zhì)復(fù)雜、加工方式多樣，針對(duì)不同的食品肉產(chǎn)品樣品，不同的DNA提取方法必然會(huì)對(duì)DNA提取效果產(chǎn)生較大的影響。因此，本研究以5種常見的市售加工肉制品樣品（蠔油牛肉片、雞肉火腿腸、牛肉火腿腸、豬肉餡、豬肉脯）為試驗(yàn)材料，以十二烷基磺酸鈉（SDS） 法、十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）法、濃鹽法、ROCHE試劑盒法以及TIANGEN試劑盒法為試驗(yàn)方法，優(yōu)選出針對(duì)這5種常見加工肉制品的高效、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的DNA提取方法，并用所提取的DNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試驗(yàn)，以驗(yàn)證它們標(biāo)簽的真實(shí)性，旨在為后續(xù)的分子生物學(xué)的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，對(duì)食品安全領(lǐng)域的研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

蠔油牛肉片（標(biāo)簽已注明不含豬肉成分）、雞肉火腿腸、牛肉火腿腸（標(biāo)簽已注明不含豬肉成分）、豬肉餡、豬肉脯，購(gòu)于無錫市歐尚超市（高浪路店）。

1.2 主要試劑及設(shè)備

三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、異丙醇、乙酸鉀、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、十六烷基三甲基溴化銨、鹽酸、氫氧化鈉、蛋白酶K等，分子生物學(xué)級(jí)，阿拉丁化學(xué)試劑公司；ROCHE試劑盒（Cat.No.11796828001），羅氏集團(tuán)化學(xué)試劑公司；TIANGEN試劑盒（DP304），天根生物（北京） 公司；瓊脂糖N，生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR試劑盒（Code No.RR912），寶生物工程（大連）有限公司。

UV-3600 PLUS型紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；BSA 124S型電子天平，賽多利斯公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Light Cycler 96型基因擴(kuò)增儀，羅氏公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；5810R型低溫高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；Biorad GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)伯樂儀器公司；渦旋振蕩器，德國(guó)艾卡公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品預(yù)處理

分別稱取一定量的肉制品樣品，用不銹鋼多功能絞肉機(jī)將樣品盡可能充分絞碎，分裝，備用。

2.2 DNA提取方法

2.2.1 氯化鈉法提取DNA

在參考文獻(xiàn)[9]并加以改進(jìn)。稱取200 mg經(jīng)過處理的樣品，加入400 μL TE緩沖液（10 mM Tris-HCl，1 mMEDTA，pH 8.0），然后置于渦旋振蕩器上充分振蕩30 s，至徹底懸??；在上述混合樣品中加入8 mL lysis緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；2 mM EDTA，pH 8.0；0.4 M NaCl）和800 μL 20%的SDS，再次置于渦旋振蕩器上徹底混勻。其余步驟同參考文獻(xiàn)（操作過程中相應(yīng)增加試劑及溶劑用量）。

2.2.2 SDS法提取DNA

考農(nóng)業(yè)部2406號(hào)公告《轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)DNA提取和純化》。

2.2.3 CTAB法提取DNA

參考文獻(xiàn)[10]并加以改進(jìn)。稱取200 mg經(jīng)過處理的樣品，加入400 μL娃哈哈礦泉水和1 mL CTAB提取緩沖液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 MTris-HCl，20 mMNa2EDTA），然后置于渦旋振蕩器上充分振蕩至徹底懸浮。其余步驟同參考文獻(xiàn)（操作過程中相應(yīng)增加試劑及溶劑用量）。

2.2.4 ROCHE試劑盒法提取DNA

參照ROCHE試劑盒的操作說明進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.5 TIANGEN試劑盒法提取DNA

參照TIANGEN試劑盒的操作說明進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 DNA濃度和純度的測(cè)定

吸取一定量的DNA樣液，加入一定體積的TE緩沖液稀釋，混勻，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中，用等體積的TE緩沖液作對(duì)照，置于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定DNA樣液在260 nm處、230 nm處、280 nm處的吸光度值，DNA質(zhì)量濃度的計(jì)算公式為：DNA質(zhì)量濃度（ng/μL）＝A260×50×稀釋倍數(shù)。

根據(jù)260 nm處的吸光度值計(jì)算所得DNA的質(zhì)量濃度，根據(jù)A260/A280和A260/A230的值判斷所提基因組DNA的純度。一般來說，A260/A280在1.8左右，A260/A230大于2.0即可判定所提基因組DNA的純度較高。

2.4 實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)豬源性成分

參考《SN/T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法》。實(shí)時(shí)PCR體系為：2×Premix for Porcine 12.5 μL，Primer Mix for Porcine 1 μL，Probe Mix for Porcine 1 μL，樣品DNA1 μL，加雙蒸水至25 μL。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，60℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，防止出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，需先進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn)和陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

5種提取方法對(duì)5種常見加工肉制品基因組DNA提取效果的比較結(jié)果見表1。

由表1可知，對(duì)于不同加工方式的肉制品，它們基因組DNA的最佳提取方法并不完全相同。但通過分析可知，采用CTAB法提取這5種加工肉制品的DNA，均能獲得最佳得率和質(zhì)量濃度，范圍分別是 156.0±4.8 μg/g～196.0±6.2 μg/g 和 312.0±9.7 ng/μL ～392.0±12.4 ng/μL；同時(shí)，所得 DNA 的純度也相對(duì)較高，A260/A280基本在1.8左右，A260/A230基本在2.1左右。其次，氯化鈉法對(duì)豬肉脯、豬肉餡、雞肉火腿腸以及蠔油牛肉片的提取效果較好，也可以作為一種肉制品DNA提取的備選方法。

3.2 實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)食品樣品的豬源性成分

為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，首先進(jìn)行了空白對(duì)照試驗(yàn)和陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果均顯示正常，因此可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)際樣品檢測(cè)。將CTAB法提取所得的基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。豬肉脯（圖1A）、雞肉火腿腸（圖1B） 和豬肉餡（圖1C） 的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果可以看出，HEX信號(hào)和FAM信號(hào)均顯示陽(yáng)性，因此判定它們均含有豬源性成分，這一檢測(cè)結(jié)果也與它們的標(biāo)簽相吻合；牛肉火腿腸（標(biāo)簽已注明不含豬肉成分）（圖1D） 和蠔油牛肉片（標(biāo)簽已注明不含豬肉成分） （圖1E） 的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示只有HEX信號(hào)檢出而無FAM信號(hào)檢出，因此判定它們都不含有豬源性成分，同樣地，這一檢測(cè)結(jié)果也與它們的標(biāo)簽相吻合。如表2所示，通過5種加工肉制品的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的Ct值也可以很直觀的看出牛肉火腿腸和蠔油牛肉片不含豬源性成分。因此，就是否含有豬源性成分這一點(diǎn)來說，它們的標(biāo)簽均真實(shí)可靠。同時(shí)，該試驗(yàn)結(jié)果也表明，CTAB法提取的基因組DNA可以滿足實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)的要求。

表1 5種DNA提取方法對(duì)5種常見加工肉制品提取效果的比較

表2 5種加工肉制品實(shí)時(shí)PCR熒光信號(hào)Ct值

4 結(jié) 論

綜上所述，CTAB法提取所得的基因組DNA無論從濃度、得率還是純度來看，都明顯高于其他4種方法，同時(shí)，CTAB法提取的DNA能達(dá)到PCR試驗(yàn)的要求，是較佳的加工肉制品的DNA提取方法；濃鹽法提取所得基因組DNA的質(zhì)量?jī)H次于CTAB法，也可以作為加工肉制品基因組DNA提取的備選方法之一；SDS法提取所得基因組DNA的濃度和純度相對(duì)試劑盒法較高，但是得率較低；ROCHE試劑盒法和TIANGEN試劑盒法操作簡(jiǎn)便、快速，但提取所得基因組DNA的濃度和得率明顯小于其他3種方法，并且價(jià)格昂貴，增加試驗(yàn)成本。同時(shí)，PCR試驗(yàn)表明，這5種加工肉制品的食品標(biāo)簽均符合其真實(shí)屬性。